Hier präsentieren wir eine Mikroskopie-basiertes Protokoll für hochauflösende Bildgebung und eine dreidimensionale Rekonstruktion der Maus neurovaskuläre Einheit und Blut – Hirn-Schranke mit Gehirn frei schwebenden Abschnitten. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung, Analyse und Quantifizierung der intrazellulären Organellen an der BBB.
Die Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist eine dynamische mehrzelligen Schnittstelle, die den Transport von Molekülen zwischen den Kreislauf und das Gehirn reguliert. Transcytosis über die BBB regelt die Lieferung von Hormonen, Metaboliten und therapeutische Antikörper, die in Anwesenheit von. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die Immunfluoreszenz frei schwebenden Abschnitte mit Laser kombiniert-scanning-konfokalen Mikroskopie und Bildanalyse subzellularen Organellen innerhalb von Endothelzellen an der BBB zu visualisieren. Kombination dieser Datensatz mit 3D Bildanalyse-Software ermöglicht für die semi-automatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kapillare Volumen und Fläche, sowie die Anzahl und Intensität von intrazellulären Organellen an der BBB. Die Erkennung der Maus endogenen Immunglobulin (IgG) in intrazellulären Vesikeln und deren Quantifizierung an der BBB wird verwendet, um die Methode zu veranschaulichen. Dieses Protokoll kann potenziell auf die Untersuchung der Mechanismen Steuern BBB Transcytosis von unterschiedlichen Molekülen in Vivoangewendet werden.
Die Blut – Hirn-Schranke (BBB) ist eine kontinuierliche zellulären Barriere bilden Astrozyten, Perizyten, Neuronen und Endothelzellen, die das zentrale Nervensystem (ZNS) aus dem Blutzirkulation1trennt. Die Regulierung der Transport über die BBB spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase des Gehirns und wird durch spezielle Eigenschaften des Gehirns Endothelzellen (BECs) vermittelt. Das Vorhandensein von enge interzelluläre Verbindungen zwischen BECs und eine niedrige basale Transcytosis begrenzen den parazellulär und intrazelluläre Transport von Blut übertragbare Molekülen, bzw.2. Vor kurzem hat Transcytosis Weg in BECs genutzt, um Lieferung von therapeutischen große Moleküle an das Gehirn3,4zu erhöhen. Jedoch wurden die Mechanismen der Transcytosis über die BBB vollständig charakterisierten5,6noch nicht.
Umfangreiche Arbeit geleistet in Vitro zu entziffern, die zellulären und molekularen Mechanismen intrazellulären Transport über BECs7,8,9,10, 11, aber solche Systeme nicht die komplexe Architektur und Physiologie des Referats neurovaskuläre (NVU) rekapitulieren. Auf der anderen Seite Studien in Vivo12,13 enthalten detaillierte quantitative Informationen zu Frachten über die BBB aber keine Einblicke in die intrazellulären Mechanismen des Verkehrs. Untersuchung der zellulären und intrazellulären Komponenten der NVU bleibt in Vivo und ex Vivo daher sehr anspruchsvoll14. Nur eine begrenzte Anzahl von Techniken sind zugänglich, subzelluläre Strukturen in den Zellen der NVU zu analysieren. Die meisten Studien verwenden Elektronenmikroskopie, aber diese Technik ist begrenzt durch die komplexe Protokolle erforderlich für die ordnungsgemäße Gewebe Vorbereitung und Probenbehandlung. Daher haben wir eine Methode basiert auf hochauflösenden konfokalen Mikroskopie, die die Verarbeitung von Gehirn-Proben, die Analyse und Quantifizierung der subzelluläre Kompartimente innerhalb der Zellen von der NVU erleichtern würde.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das nutzt Maus Gehirn frei schwebenden Abschnitte um quantitative Bildgebung des BBB und NVU auf zellulärer und subzellulärer Ebene durchzuführen. Wir haben getestet und validiert eine Anzahl von Antikörpern gegen Bild und NVU in drei Dimensionen zu rekonstruieren. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokolls Bildgebung mit der maximalen optischen Beugung begrenzte Auflösung des Organellen innerhalb Gehirn-Kapillaren. Zusammen mit Bildanalyse kann dieses Protokoll verwendet werden, um den intrazellulären Transport von Makromolekülen in der BBB unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, zum Beispiel in Mausmodellen Krankheit der Neurodegeneration zu untersuchen.
Die oben beschriebene Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Gehirn frei schwebenden Abschnitte, immunofluorescent Färbung, Bildaufnahme und Analyseparameter für hochauflösende Mikroskopie der BBB. Diese Methode hat vor kurzem verwendet, um die Lokalisierung der Antikörper Lieferung Plattformen3, den Transport von endogenen IgG über die BBB-17und die Heterogenität der BBB auf Pericyte Verlust18zu untersuchen. Verschiedene Schritte im Protokoll können zur Anpassung an die spezifischen Ziel des Experiments geändert werden. Zunächst erleichtert die Verwendung von dicken (100 µm) Abschnitte ihrer Handhabung beim Verfahren Immunostaining und Montage. Es ermöglicht auch für 3D Rekonstruktion des Kapillarnetzes, die neurovaskuläre Einheit und für die Generation der Kapillare und NVU Querschnitte. Allerdings Eindringen von Antikörper innerhalb der Gewebeschnitte variieren und einige Antikörper Färbung auf die oberflächliche Schicht des Gewebes in der Nähe des Deckglases beschränkt werden kann. Das Protokoll kann geändert werden, indem man die Konzentration der Reinigungsmittel während der Permeabilisierung Schritt bzw. die Länge der die Permeabilisierung Schritt zur Verbesserung der Antikörper Eindringen in das Gewebe. Zweitens kann Bildqualität gefährdet sein, wenn Sie versuchen, Bilder tiefer in das Gewebe (in der Regel 20 bis 30 µm unterhalb der Oberfläche) durch Lichtstreuung sowie optische Aberrationen von Brechungsindex Missverhältnis zu erwerben. Um dieses Problem zu überwinden, können neue Methoden für Gewebe, clearing und aktive Antikörper eindringen20 mit diesem Protokoll zu Bild größere Mengen an Gewebe kombiniert werden. Drittens erfolgt Dekonvolution nach der Bildaufnahme, axiale Auflösung des Bildes zu verbessern. Die Wahl des blind Deconvolution Algorithmus verwendet in diesem Protokoll stützte sich auf (i) seine einfache Bedienung, da keine Vorausberechnung der Point-Spread Funktion benötigt wird, (Ii) seine Robustheit für die Verbesserung der Bild Qualität21und (Iii) das Fehlen von Artefakten auf mIgG intrazelluläre Strukturen nach der Implementierung. Abhängig von der intrazellulären Strukturen visualisiert in der Probe führen andere Dekonvolution Algorithmen höhere Bildqualität. Die folgenden Referenzen21,22 geben eine ausführliche Diskussion über die Vorteile und Grenzen der zusätzliche Algorithmen für Bild Dekonvolution. Schließlich erlaubt die Verwendung von einer Bild-Analyse-Software-Paket die Segmentierung der Kapillaren und intrazellulären Strukturen in drei Dimensionen. Klar Bildanalyse beschränkt sich nicht auf die Software, die im Protokoll und alternative Pakete, zum Beispiel die Referenz23ausführlich beschrieben, Segment Bilder genutzt werden. Die Eignung der verschiedenen Software-Programmen für die Analyse der intrazellulären Strukturen über die BBB sollte empirisch überprüft werden, durch die Beurteilung der Genauigkeit der Bild Segmentierung.
Da diese Methode auf festen Proben basiert, bietet es keine direkten Informationen über die Dynamik des Transcytosis über die BBB. Jedoch mit Zeitverlauf Experimente24, z. B. kombinierbar durch intravenös injizieren das Molekül des Interesses und seine Ansammlung innerhalb BECs zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion zu rekonstruieren, die Kinetik der Messung intrazellulären Transport. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es für die Analyse von tiefen Hirnregionen wie gezeigt in18, die derzeit für intravitalen live bildgebenden Methoden nicht zugänglich sind. Ein wichtiger Schritt während des Protokolls ist die sorgfältige Überwachung der Gewebe Fixierung. Befestigung mit 4 % PFA drastisch reduziert die Immunogenität des intrazellulären Organellen und des endogenen oder peripher verabreichte Immunglobuline17 (Abbildung 1 b). Eine Einschränkung dieses Protokolls ist die Anforderung der qualitativ hochwertige Antikörper (d.h.niedrige unspezifische Färbung, geringe Kreuzreaktivität) geeignet für Immunfluoreszenz. Sofern solche Reagenzien zur Verfügung stehen, kann das Verfahren angewendet werden, um die intrazelluläre Lokalisation jedes Proteins des Interesses zu untersuchen. Zum Beispiel wurde das Protokoll zur Lysosomen im Gehirn endothelial Zellen17identifizieren. Es sollte auch angemerkt werden, dass da dieses Protokoll auf konfokalen Mikroskopie beruht, die laterale Auflösung durch Beugung begrenzt wird und nicht werden Strukturen, die kleiner als etwa 175 bis 250 aufgelöst kann nm (Abbildung 2).
Frühere Studien haben detaillierte Analyse der zellulären Zusammensetzung der konfokalen Mikroskopie25,26mit neurovaskuläre Einheit durchgeführt. Untersuchung von intrazellulären Transport an der BBB hängt jedoch vor allem auf die Verwendung von Transmission Electron Microscopy19,27,28. Während diese Methode die höchste laterale Auflösung der intrazellulären Strukturen bietet, bleibt Elektronenmikroskopie eine anspruchsvolle Technik mit niedrigem Durchsatz. Darüber hinaus ist die Anzahl der verschiedenen molekularen Ziele, die durch EM visualisiert werden können sehr begrenzt. Dieses Protokoll bietet eine zugängliche Alternative zu intrazellulären Transport an der BBB zu untersuchen. Die komplette Prozedur aus Gehirn Sammlung, Bildanalyse, kann in 5 bis 6 Tagen durchgeführt werden. Wenn geeignete Antikörper vorhanden sind, ermöglicht Immunfluoreszenz simultane Detektion von mehreren Zelle Arten/Moleküle innerhalb der gleichen Probe. Außerdem könnte dieses Protokoll mit Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken zur Überwindung der Grenzen in räumlicher Auflösung29kombiniert werden. Insgesamt ermöglicht das oben beschriebene Protokoll die Quantifizierung von Veränderungen in die intrazelluläre Lokalisation innerhalb der neurovaskuläre Einheit interessierender Proteine. Seine Anwendung für verschiedene genetische oder pharmakologische Störungen ermöglicht die intrazellulären Struktur und Transport-Funktionen des BBB in Vivozu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
R.V. wurde von einem Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017) unterstützt.
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |