Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato - encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.
Abstract
A barreira hemato - encefálica (BBB) é uma interface multicelular dinâmica que regula o transporte de moléculas entre o cérebro e a circulação. Transcytosis do outro lado do BBB regula a entrega de anticorpos terapêuticos, metabólitos e hormônios para o parênquima cerebral. Aqui, apresentamos um protocolo que combina imunofluorescência de seções flutuantes com laser de varredura, microscopia confocal e análise de imagem para visualizar as organelas subcelulares dentro das células endoteliais no BBB. Combinar este conjunto de dados com software de análise de imagem 3D permite a segmentação semi-automática e quantificação do volume capilar e área de superfície, bem como o número e intensidade das organelas intracelulares no BBB. A detecção de rato endógeno da imunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares e sua quantificação no BBB é usada para ilustrar o método. Este protocolo potencialmente pode ser aplicado para a investigação dos mecanismos de controlo BBB transcytosis de moléculas diferentes em vivo.
Introduction
A barreira hemato - encefálica (BBB) é uma barreira celular contínua formada por astrócitos, pericitos, neurônios e células endoteliais que separa a circulação de sangue1sistema nervoso central (SNC). O Regulamento de transporte através do BBB desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do cérebro e é mediado por propriedades especializadas das células endoteliais do cérebro (BECs). A presença de junções intercelulares apertadas entre BECs e uma baixa taxa basal de transcytosis limitar o transporte paracellular e transcellular de moléculas transmitidas pelo sangue, respectivamente2. Recentemente, o caminho de transcytosis na BECs tem sido aproveitado para melhorar a sua prestação de terapêuticas grandes moléculas para o cérebro3,4. No entanto, os mecanismos de transcytosis através do BBB ainda não foram totalmente caracterizado5,6.
Extenso trabalho tem sido feito em vitro para decifrar os mecanismos celulares e moleculares que regulam o transporte intracelular através de BECs7,8,9,10, 11, mas esses sistemas não conseguem recapitular a complexa arquitetura e fisiologia da unidade neurovascular (NVU). Por outro lado, estudos em vivo12,13 fornecem informações quantitativas detalhadas sobre as taxas de transporte através do BBB mas não fornecer insights sobre os mecanismos intracelulares de transporte. Portanto, investigar os componentes celulares e intracelulares do NVU in vivo e ex vivo continua a ser muito desafiador14. Apenas um número limitado de técnicas é aptos para analisar estruturas subcelulares dentro de células do NVU. A maioria dos estudos usar microscopia eletrônica, mas esta técnica é limitada pelos protocolos complexos necessários para a preparação adequada de tecido e manuseio de amostras. Portanto, estabelecemos uma metodologia baseada na microscopia confocal de alta resolução que facilitasse o processamento das amostras de cérebro, a análise e a quantificação dos compartimentos subcellular dentro das células do NVU.
Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza as seções flutuantes cérebro do rato para executar quantitativos de imagem do BBB e NVU a nível celular e subcelular. Temos testado e validado um número de anticorpos para imagem e reconstruir o NVU em três dimensões. Além disso, este protocolo permite imagens com a máxima resolução óptica de difração limitada das organelas dentro de capilares do cérebro. Juntamente com a análise de imagem, este protocolo pode ser usado para investigar o transporte intracelular de macromoléculas através do BBB sob diferentes condições experimentais, por exemplo, em modelos de doença de rato de neurodegeneração.
Protocol
aprovação ética para este estudo foi fornecida pela Federal da segurança alimentar e veterinária Office da Suíça. Todos os animais de experimentos foram conduzidos em estrita observância a portaria federal Suíça sobre proteção animal e bem-estar, bem como de acordo com as regras da Associação de avaliação e acreditação do laboratório Animal conta internacional (AAALAC).
1. geração de cérebro seções de Free-floating
- para garantir a qualidade ideal de amostra, preparar uma solução fresca de 2% paraformaldeído (PFA) em solução salina tampão de fosfato (PBS) no dia da perfusão.
Cuidado: PFA é moderadamente tóxico por contacto com a pele e um provável carcinogênico. Use luvas de nitrilo para lidar com PFA e preparar a solução sob uma coifa de química.- Preparar 60 mL de solução PFA por animal.
- Trazer PFA em solução aumentando o pH com 180-200 µ l de uma solução KOH de 5 M para cada 100 mL de PBS e aquecer a solução até 60 ° C.
Nota: NaOH não deve ser usado como impacta negativamente preservação de tecidos mediante fixação. - Deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente e levar o pH até 7.4 usando HCl. filtre a solução usando papel de filtro (ver Tabela de materiais).
- Realizar uma fixação todo rato através de perfusão transcardial como descrito anteriormente 15 com algumas modificações. Primeiro, lave o sangue da vasculatura utilizando 20 mL de PBS, em seguida, perfundir com 40 mL de 2% PFA.
- Remover o cérebro do crânio como descrito anteriormente 15.
- Mergulhar um fresco 2% PFA-perfundidos cérebro em 20 mL de 2% PFA para 7 h a 4 ° C para fixação pós.
Nota: Aumentando a incubação no programa de acção não é recomendável pois pode impedir a deteção das estruturas intracelulares. - Extensivamente lavar o cérebro com PBS gelado.
- Embed fixada cérebros em agarose.
Solução de
- Prepare um agarose a 3% em PBS usando um microondas para aquecimento. Agite suavemente a solução para esfriá-la, mas evitar a solidificação.
- Secar o excesso de PBS em torno do cérebro antes de imersão na solução de agarose em um recipiente de plástico. Gire o cérebro dentro do agarose para remover as bolhas de ar. Permitir que a agarose solidificar por a arrefecer na Ice.
- Cuidadosamente remova o recipiente plástico do bloco de agarose e cortar um cubo em torno do cérebro usando uma lâmina de barbear. Montar o cérebro para um suporte de amostra vibratome (ver Tabela de materiais) usando cola de cianoacrilato (ver Tabela de materiais). Permitir tempo suficiente para que a cola solidificar antes de prosseguir com o seccionamento.
- Transferência do cérebro no porta-amostra para a bandeja de tampão vibratome preenchido com PBS. Use o vibratome para seção 100 fatias de cérebro µm (sagitais ou coronais). Recolher as seções do cérebro em uma placa de 6 anteriormente preenchida com PBS.
- Com acabamento corte do cérebro, cuidadosamente remover PBS e substituir por uma solução de 1:1 da PBS/glicerol.
- Armazenar seções em PBS/glicerol em -20 ° C.
2. Célula ou organela rotulagem pela mancha da imunofluorescência
- cuidadosamente transferência uma seção do cérebro em um poço de uma placa de 24 anteriormente preenchida com 500 µ l de PBS por bem. A seção permanecerá no mesmo poço até o final do processo.
- Enxaguar a seção duas vezes com 500 µ l de PBS durante 5 min sob agitação suave.
- Remover a PBS e realizar bloqueio simultâneo e permeabilização de fatias de cérebro.
- Prepare uma solução de bloqueio e permeabilização com 0,3% Triton-X e 10% soro de burro em PBS.
Nota: Soro de burro pode ser substituído com soro de cabra para coincidir com as espécies de hospedeiros dos anticorpos secundários específicos usados. - Incubar seções com 250 µ l de solução de bloqueio e permeabilização por 1h à temperatura ambiente sob leve agitação.
- Prepare uma solução de bloqueio e permeabilização com 0,3% Triton-X e 10% soro de burro em PBS.
- Remover a solução e adicionar uma solução de PBS contendo 5% de soro de burro e o anticorpo primário em uma diluição adequada (por exemplo, 1: 100 para 1:1, 000). Incubar durante uma noite a 4 ° C, sob agitação suave.
Nota: Consulte a Tabela de materiais, para obter uma lista de anticorpos que rotulam com sucesso os diferentes tipos de células do NVU com este protocolo. A diluição ideal de anticorpos primários deve ser determinada empiricamente. Para rotulagem simultânea de antígenos diferentes, dilua todos os anticorpos primários na mesma solução. Todos os anticorpos primários devem ser disparados em diferentes espécies. Para melhorar a penetração do anticorpo, amostras podem ser incubadas por até 72 h a 4 ° C. - Remover anticorpos solução lavagem seções e três vezes por 10 min em PBS sob agitação suave na temperatura de quarto. PBS de remover e adicionar 250 µ l PBS solução contendo 5% burro de soro e o anticorpo secundário fluorescente etiquetado espécie-específicos adequado. Incubar as seções à temperatura ambiente durante 1 h, sob agitação suave.
- Ver Tabela de materiais para obter uma lista dos anticorpos secundários usado com este protocolo.
- Remover as seções de anticorpo solução e lavar três vezes por 10 min em PBS, sob agitação suave na temperatura de quarto.
- Remover PBS e adicionar 250 µ l de uma 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) solução com uma concentração final de 1 µ g/mL. Incube as seções à temperatura ambiente durante 10 minutos sob agitação suave. Remova as seções de solução e lavagem DAPI 3 vezes por 5 min com PBS.
- Montar a seção do cérebro na colagem de lâminas de microscopia (por exemplo, lâminas de vidro de histo-bond). Remova cuidadosamente o excesso PBS ao redor da seção do slide. Adicionar uma gota de meio de montagem (ver tabela de materiais) na parte superior da seção de cérebro e cuidadosamente cubra-o com uma lamela de vidro de borosilicato de 0,17 mm (n º 1.5).
- Armazenar amostras a 4 ° C, protegido da luz, até realizar a aquisição de imagem.
3. De alta resolução de imagem Confocal da barreira sangue - cérebro
- realizar aquisição de imagem com uma apropriado-varredura a laser confocal microscópio (ver Tabela de materiais) com linhas de laser no 405, 488, 561 e 633 nm para a excitação de Fluorophores nas regiões do espectro da luz azuis, verdes, laranja e vermelhas. Para aquisição de imagens, use um 63 X objetivo de óleo com uma abertura numérica de 1.4.
- Na aquisição menu do software que controla o microscópio, definir a imagem parâmetros de aquisição. No menu drop-down de ‘ tamanho da imagem ’, selecione um valor de 1024 x 1024 pixels. Modificar o tamanho de pixel para um valor entre 200 e 300 nm, ajustando o valor da ‘ Zoom ’ menu ”
Nota: para a análise das estruturas intracelulares, reduzir o tamanho do pixel de 75 nm. Essa configuração de tamanho de imagem substancialmente aumenta o tempo de aquisição e pode ser reduzida para 512 x 512 pixels para diminuir o tempo de aquisição de imagem a um campo de visão menor. - No ' velocidade de aquisição ' menu drop-down, selecione um valor de 400 Hz, ou seja, 400 linhas por segundo. Na ' configurações de sistemas & #39; menu, selecione o ' profundidade Pixel ' menu suspenso e altere o valor para 12 bits.
- No software do microscópio, dentro do ' aquisição ' guia, ativar/desativar a opção para aquisição de quadro sequencial. Definir a espessura de secção óptica para um valor entre 0,75 e 1 µm para cada canal, modificando o valor no ' Pinhole ' menu.
- No painel para a excitação fluorescente, ativar o laser necessário para excitar otimamente o fluorophores na amostra, por exemplo um 488 nm linha de laser para um fluoróforo verde-emitindo.
Nota: Use um visualizador de espectros de fluoróforo (consulte Tabela de materiais) para selecionar o laser de excitação adequada. - No painel para a deteção fluorescente, mova o controle deslizante para selecionar os comprimentos de onda que serão medidos em cada canal, por exemplo entre 510 e 550 nm para um fluoróforo verde-emitindo.
Nota: Use um visualizador de espectros de fluoróforo (consulte Tabela de materiais) para seleccionar os comprimentos de onda adequados deteção. - Adicionar uma gota de óleo de imersão, com um índice de refração de 1,52 em cima da lamela com a seção do cérebro para coincidir com o índice de refração do vidro lamela e objetivo. Coloque a amostra no microscópio e acender a luz epifluorescente Visualizar a amostra usando o binóculo microscópio.
- Usando os botões sobre o suporte do microscópio, mudar a roda do filtro para selecionar um filtro adequado para a visualização de núcleos DAPI-manchado. Use o foco grosso para focar o sinal de núcleos manchadas de DAPI.
- Usando os botões sobre o suporte do microscópio, mudar os filtros para visualizar o sinal de marcadores vasculares (por exemplo, CollagenIV ou CD31) e no centro do campo de visão em um segmento capilar individual.
- Pressione o botão para iniciar o modo de viver-scan. Durante a verificação ajustar a intensidade de laser e ganho para cada canal maximizar a gama dinâmica das imagens e evitar saturação pixel.
Nota: Utilize uma tabela look-up que rotula pixels saturados para avaliar visualmente o excesso de saturação. Para evitar saturação excessiva de sinal, ajustar as configurações com a amostra que deverá ter o maior sinal fluorescente. - Definir o valor para a linha média de 2.
Nota: Ao usar velocidades mais altas de aquisição, aumente este valor para reduzir ruído. - Estabelecer começa e termina as seções para desempenho ópticos z-pilhas que abrangem todo o volume do capilar. Usar um tamanho de passo de 0,45 µm.
Nota: Se imagens serão usadas para quantificação subsequente, manter as mesmas configurações de aquisição para o conjunto de dados completo. - Para quantificação, adquirir pilhas z de 10 a 20 por seção pelo menos três diferentes ratos para comparações estatísticas.
Nota: Adquirir o conjunto completo de dados na mesma sessão para reduzir a variabilidade decorrentes de flutuações de intensidade de laser e clareamento de amostra.
4. Imagem 3D e processamento de reconstrução da unidade Neurovascular
- (opcional) para aumentar a resolução axial das z-pilhas adquiridas, executar deconvolução do conjunto de dados de imagem usando o software apropriado (ver tabela de materiais de ).
- No software deconvolução, alterar as configurações para realizar " cegos " deconvolução, (isto é, usando uma função de ponto-propagação adaptativa).
- Nas configurações do software de deconvolução, ativar/desativar a opção para remoção de fundo; esta opção irá determinar o menor valor de intensidade na pilha de imagem e subtrair os valores de intensidade de todos os pixels na imagem.
- Nas configurações do software de deconvolução, alternar entre as opções de reescalar intensidade e redimensionamento de profundidade de 16 bits; essas opções irão manter os valores de intensidade original e a gama dinâmica das imagens.
- No menu de ' índice de refração ', defina o valor para 1,52. No ' definir o comprimento de onda ' menu, selecionar a emissão de valores para cada canal de imagem. Por exemplo, selecione 520 para um fluoróforo verde-emitindo.
- Abrir o conjunto de dados de imagem utilizando o software adequado para visualização e análise de conjuntos de dados 3-dimensional (ver Tabela de materiais). Do software de análise de imagem, pressione a " Surpass " botão para processar o volume 3D de capilares.
- Na imprensa de software de análise de imagem o " Adicionar nova superfície " botão para segmentar a superfície capilar. Use as setas do fundo para mover entre etapas do assistente de criação de superfícies.
- No ' criar ' guia, definir o canal de origem para o canal com marcador capilar, por exemplo CollagenIV e definir os detalhes de superfície para um valor de 0,5 µm.
Nota: A última opção aplica um filtro gaussiano para a imagem e determina a suavidade da superfície. - No ' criar ' guia, ativar/desativar a opção para o limiar de intensidade absoluta.
Nota: Esta opção irá criar uma superfície gerando uma máscara baseada a intensidade absoluta do canal selecionado na imagem. - Sobre o próximo passo do assistente de criação de superfícies, ajustar o limiar inferior de intensidade para a superfície, movendo a janela deslizante através do histograma de intensidade até a máscara renderizada cobre todo capilar na imagem. Determinar o intervalo de valores para este parâmetro empiricamente para cada conjunto de dados.
- Na etapa final do assistente para criação de superfícies, clique no menu drop-down sob " filtro tipo " e selecione a opção ' número de Voxels '. Definir o número mínimo de voxels para um valor entre 1.0e5 a 2.0e5.
Nota: Esta opção irá excluir as superfícies com um pequeno número de voxels, por exemplo, pequenos segmentos de capilares na borda do frame. - Concluir o assistente de criação de superfícies e salvar os parâmetros de criação clicando " Lembre-se de parâmetros " na aba do menu de superfície de recompilar.
- Repita o procedimento para todo o conjunto de dados de imagem por carregar o conjunto de parâmetros utilizado para a primeira imagem. Ajustar os parâmetros para a intensidade e limiar mínimo número de voxels para cada imagem para explicar as diferenças na intensidade de fundo e morfologia capilar, respectivamente.
- No ' criar ' guia, definir o canal de origem para o canal com marcador capilar, por exemplo CollagenIV e definir os detalhes de superfície para um valor de 0,5 µm.
- Para o segmento de estruturas vesiculares intracelulares (por exemplo, endossomos cheio de imunoglobulina), primeiro crie um novo canal que inclui apenas o sinal fluorescente de dentro do capilar.
Nota: Este processo irá definir uma região de interesse, criando uma máscara usando a superfície capilar, criada na etapa 4.3- Selecione a ' edição ' menu no ' superfície capilar ' painel. Sob ' máscara Propriedades ', clique " máscara todos os ". Selecione o canal que contém o sinal de vesículas intracelulares, como o ' fonte canal ' e na opção Ativar/desativar " duplicar canal antes de aplicar a máscara ".
- No ' configurações de máscara ' coluna, selecione " constante dentro/fora " e " definir voxels superfície para exterior: " e defina seu valor como 0,00.
Nota: Este processo irá criar um canal adicional na imagem onde todos os voxels fora a máscara capilar terá um valor de intensidade de 0. Para quantificar a eventos fora do capilar (i.e., no parênquima cerebral), escolha " conjunto voxels dentro de superfície para: " e defina seu valor como 0,00. - Para o segmento de estruturas vesiculares, pressione o botão para iniciar o " adicionar novos Spots " assistente. Use as setas do fundo para mover entre etapas do assistente de criação de superfícies.
- Na guia criar, use o menu drop-down sob " canal fonte " para seleccionar o canal mascarado intracelular criado na etapa 4.4.4.
- Na guia criar, sob o " Spot deteção " seção, defina o diâmetro estimado de XY para um valor entre 0,5 e 1 µm, dependendo do tamanho médio das vesículas observadas em o experimento. Essa opção determina o menor tamanho que será detectado pelo algoritmo de segmentação.
- Na guia criar, sob o " Spot deteção " seção, a opção para ativar/desativar " subtração de fundo ".
Nota: Esta opção suavizar a imagem com um filtro gaussiano de 0,75 ponto raio (do valor selecionado na etapa 4.4.7) e subtraindo a intensidade da imagem original Gaussian filtrados por 0,88 raio local. - No ' criar ' guia, pressione o menu suspenso sob ' filtro tipo ' e selecione " qualidade ". Note que isto irá segmentar a imagem através da aplicação de limiares com base na intensidade no centro dos pontos. Ajustar o limiar inferior de intensidade, movendo a janela deslizante em toda a ' qualidade ' histograma até que a maioria das vesículas identificáveis é rotulada.
Nota: O intervalo de valores para este parâmetro precisa ser determinado empiricamente para cada conjunto de dados. - Concluir o assistente de criação local e salvar os parâmetros de criação, pressionando o botão " Lembre-se de parâmetros " na aba do menu de superfície de recompilar.
- Repita o procedimento para todo o conjunto de dados de imagem por carregar o conjunto de parâmetros utilizado para a primeira imagem. Ajustar os parâmetros para o ' limiar de intensidade de qualidade ' para cada imagem explicar as diferenças na intensidade de fundo.
5. Quantificação de transporte intracelular no BBB
- quantificar o volume (em µm 3) e a área (em µm 2) do segmento capilar. O software de análise, acessar o painel de estatísticas da superfície vascular criado no passo 4.3. Selecione o ' Detailed ' tab e use o menu suspenso para selecionar " todos os valores " para encontrar os valores para o volume e área.
- Quantificar o número de vesículas no segmento capilar. O software de análise, acessar o painel de estatísticas dos spots criados na etapa 4.4. Selecione a ' geral ' guia para encontrar o valor do número total de pontos na imagem.
- Para calcular o número de vesículas por volume capilar, para cada imagem normaliza o número de pontos pelo volume calculado na etapa 5.1. Multiplique este valor por 1.000 para obter o número de vesículas por 1.000 µm 3 do volume capilar.
- Para quantificar a intensidade total dentro do capilar cria uma nova superfície que abrange a seguinte imagem inteira as instruções descritas em etapas 4.3 com as seguintes modificações. Selecione o canal que contém o sinal pertinente (por exemplo, mIgG) como canal de fonte e defina o valor de nível de detalhe da área de superfície de 5 µm. Para criar uma superfície que cobre toda a imagem, defina o valor do limite da intensidade baixo para 0.
- Do software de análise, acessar o painel de estatísticas da superfície criada na etapa 5.4. Selecione o " Detailed " tab e use o menu suspenso para selecionar " todos os valores ". Registre os valores para ' soma de intensidade ' para os canais de interesse; Este parâmetro corresponde à soma dos valores individuais de intensidade ao longo de todos os pixels.
Nota: Para um sinal intracelular, isto corresponde o canal duplicado com voxels superfície definida como 0,0 exterior. Para um sinal no parênquima cerebral, isso corresponde ao canal duplicado com voxels dentro superfície definida como 0,0. - Para calcular a intensidade de fluorescência por volume capilar, para cada imagem normaliza a intensidade pelo volume calculado na etapa 5.1. Multiplique este valor por 1.000 para obter o valor de intensidade de fluorescência por 1.000 µm 3 do volume capilar.
Nota: Para sinais fluorescentes no parênquima cerebral, normalizar os valores pelo volume total da imagem menos o volume capilar e multiplicar por 1.000 para obter a intensidade total por 1.000 µm 3 do parênquima cerebral. - Repita o procedimento para o conjunto de dados e usar o software adequado para realizar a análise estatística dos dados.
Representative Results
Como exemplos representativos das imagens obtidas no protocolo descrito aqui, seções de cérebro de rato foram coradas com anticorpos reconhecer diferentes componentes do NVU, incluindo a membrana basal, astrócitos, pericitos e células endoteliais (ver Tabela de materiais para anticorpos específicos utilizados) (Figura 1A, D e E). Com essa resolução, é possível distinguir os processos individuais de hamartomas e ponta-pés que estão em contato direto com os capilares.
Para destacar a adequação deste protocolo para a detecção de estruturas intracelulares, seções de cérebro de animais perifericamente injetados com o de anticorpo humano anti-Tau mAb8616 estavam manchadas com um fluorescente etiquetado anticorpos anti-humano ( Figura 1B). mAb86 é conhecido por especificamente os neurônios alvo expressando uma forma patológica de Tau16. Usando o protocolo descrito neste documento, o mAb86 foi detectada com resolução de difração limitada dentro de estruturas vesiculares individuais dentro de neurônios (Figura 1B-C). Além disso, o mouse endógeno IgG foi detectado nas estruturas intracelulares dentro das células endoteliais, mas não em pericitos (Figura 1D-E e Figura 2).
A aquisição de z-pilhas confocal de alta resolução da vasculatura cerebral permite a segmentação tridimensional dos capilares e vesículas intracelulares no BBB. A Figura 2 mostra um exemplo do processo de renderização e segmentar um capilar rotulado com CollagenIV e mouse IgG-positivo intracelulares vesículas. Através da quantificação por exemplo um conjunto de dados completo de imagens segmentadas, medindo-se o número de vesículas por volume capilar, é possível estudar mudanças nos processos de transporte intracelular sob diferentes condições. Figura 3 B-C mostra as diferenças em mIgG vesículas número e fluorescência intensidade correspondente a mIgG no parênquima cerebral, respectivamente, após esgotamento do Pericito no modelo de pdgf-bret/ret rato como relatado anteriormente 17. a mesma abordagem também recentemente foi usada para analisar as alterações no transporte intracelular no BBB entre cerebrais diferentes regiões18.
Figura 1: Rotulagem de vários tipos de células e estruturas subcelulares do neurovascular unidade Imagens representativas da unidade neurovascular (A e D) e vesículas intracelulares contidas em (B) de neurônios ou células endoteliais (E) obtidas com este protocolo. A imagem de projeção de intensidade máxima na A (topo) mostra a distribuição de astrócitos GFAP positivo (vermelhos) ao redor de capilares classificados pelo CollagenIV (verdes). As setas apontam para processos individuais hamartomas. Barra de escala = 20 µm. Com essa resolução, os processos individuais astrocyte e ponta-pés são claramente visíveis, como mostra a imagem ampliada da região in a box (parte inferior). Pontas de seta apontam para hamartomas ponta-pés. Barra de escala = 10 µm. A imagem em B mostra o acúmulo de um anticorpo perifericamente-injetado, mAb86 (verde), dentro de um neurônio hippocampal. Pontas de seta apontam para individuais vesículas mAb86-positivo. Barra de escala = 10 µm. O gráfico em C mostra a intensidade do perfil de linha de uma única vesícula. O tamanho da vesícula foi estimado pela largura total no máximo metade de um ajuste Gaussian (linha preta sólida) da curva de intensidade (linha verde e círculos). As imagens em D mostram uma reconstrução tridimensional de uma célula endotelial (verde), rodeada por um Pericito (vermelho) dentro da lâmina basal (CollagenIV, cinzento). Os painéis inferiores mostram os canais individuais de fluorescência. Barra de escala = 10 µm. As imagens E mostrar a localização do mIgG (vermelho) em vesículas intracelulares dentro das células endoteliais (à esquerda do painel, CD31 em verde) mas não em pericitos (painel à direita, CD13 em verde). Em todas as imagens, DAPI manchado núcleos são mostrados em azul. Barra de escala = 5 µm. painéis D e E foram modificadas da referência17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Renderização tridimensional de capilares e vesículas intracelulares na barreira sangue - cérebro. Com o protocolo descrito, de alta resolução imagens confocal de capilares CollagenIV-positivo (verdes) e rato IgG vesículas intracelulares (vermelho) foram adquiridas (A). O painel esquerdo mostra uma única secção óptica com secções transversais. As setas apontam para individuais mIgG-positivo vesículas dentro das células endoteliais do cérebro. O painel sobre a reconstrução da direita mostra o 3D da z-pilha cheia usando software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais). O volume capilar (B) e vesículas individuais (C) foram processadas em três dimensões e quantificados usando o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais). Em todas as imagens, DAPI manchado núcleos são mostrados em azul. Escala de barras = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Quantificação da mIgG localização intracelular no BBB. Imagens representativas mostrando (A) reconstruções tridimensionais dos capilares (rotulados com collagenIV, verde) e a distribuição da mIgG (vermelho) em camundongos C57BL/6 e em Pericito pdgf-bret/ret empobrecido ratos anteriormente descritos em19. Barras de escala = 10 µm. As imagens em B mostram a segmentação das vesículas intracelulares dentro da máscara de CollagenIV. The gráfico em B mostra a quantificação e comparação do número de vesículas mIgG por volume de capilar. Cada ponto representa medições de segmentos individuais capilares. A linha contínua mostra a média e as barras de erro representam o desvio padrão dos dados. As imagens em C mostrar o sinal de fluorescência mIgG fora a máscara de CollagenIV. Da mesma forma, o gráfico em C mostra a quantificação e comparação da intensidade de fluorescência mIgG no parênquima cerebral entre camundongos C57BL/6 e pdgf-bret/ret ratos Pericito empobrecido. Unidades de intensidade de fluorescência foram normalizadas pela intensidade média mIgG parênquima medida em todos os camundongos C57BL/6. Esta figura foi modificada da referência17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O protocolo descrito acima descreve a preparação das seções flutuantes de cérebro, coloração imunofluorescente, aquisição de imagem e parâmetros de análise para a microscopia de alta resolução do BBB. Este método tem sido usado recentemente para investigar a localização do anticorpo entrega plataformas3, o transporte de IgG endógena através do BBB,17e a heterogeneidade do BBB após Pericito perda18. Diferentes etapas do protocolo podem ser modificadas para adaptar-se ao objetivo específico do experimento. Primeiro, o uso de espessura (100 µm) seções facilita a sua manipulação durante os procedimentos de imunocoloração e montagem. Ele também permite a reconstrução 3D da rede capilar, a unidade neurovascular e para a geração de capilar e secções transversais NVU. No entanto, penetração de anticorpos dentro as secções de tecido pode variar e algumas mancha do anticorpo pode ser restrito à camada superficial do tecido perto da lamela. O protocolo pode ser modificado através do aumento da concentração de detergente durante a etapa de permeabilização e/ou o comprimento do passo permeabilização para melhorar a penetração do anticorpo no tecido. Em segundo lugar, a qualidade de imagem pode ser comprometida ao tentar adquirir imagens mais profundas dentro do tecido (geralmente de 20 a 30 µm abaixo da superfície), devido à dispersão da luz, bem como aberrações ópticas de incompatibilidade de índice de refração. Para superar este problema, novos métodos para tecido de compensação e de penetração de anticorpo ativo20 podem ser combinados com este protocolo de imagem maiores volumes de tecido. Em terceiro lugar, deconvolução é realizada após a aquisição de imagens para melhorar a resolução axial da imagem. A escolha do algoritmo de deconvolução cega usado neste protocolo baseou-se (i) a sua facilidade de uso, como sem pre-cálculo da função de ponto-propagação é necessária, (ii) a sua robustez para melhorar a qualidade de imagem21e (iii) a ausência de artefatos na mIgG estruturas intracelulares após a implementação. Dependendo das estruturas intracelulares visualizadas na amostra, outros algoritmos de deconvolução podem resultar em maior qualidade de imagem. As seguintes referências21,22 fornecem uma ampla discussão sobre as vantagens e limitações de algoritmos adicionais para deconvolução da imagem. Finalmente, o uso de um pacote de software de análise de imagem permitiu a segmentação de capilares e estruturas intracelulares em três dimensões. Claramente, análise de imagem não se restringe ao software descrito no protocolo e pacotes alternativos, por exemplo aqueles discutidos em referência23, pode ser usado para imagens de segmento. A adequação dos programas de software diferente para a análise das estruturas intracelulares através do BBB deve ser verificada empiricamente por avaliar a precisão da segmentação de imagens.
Desde que este método é baseado em amostras de fixas, ele não fornece informações directas sobre a dinâmica de transcytosis através do BBB. No entanto, pode ser combinada com as experiências do tempo-curso24, por exemplo por via intravenosa, injetando a molécula de interesse e medindo sua acumulação dentro BECs em pontos diferentes de tempo após a injeção, para reconstruir a cinética de transporte intracelular. A vantagem dessa abordagem é que ela permite a análise de regiões profundas do cérebro, como mostrado em18, que são atualmente inacessíveis para intravital abordagens de imagens ao vivo. Um passo crítico durante o protocolo é o monitoramento cuidadoso de fixação de tecidos. Fixação com 4% PFA reduz drasticamente a imunogenicidade de organelas intracelulares e de imunoglobulinas endógeno ou administrado perifericamente17 (figura 1B). Uma limitação do presente protocolo é sua exigência de qualidade anticorpos(ou seja, baixa mancha não específica, baixa reatividade cruzada) apropriados para imunofluorescência. Desde que tais reagentes estão disponíveis, o método pode ser aplicado para investigar a localização intracelular de qualquer proteína de interesse. Por exemplo, o protocolo foi usado para identificar os lisossomos no cérebro células endoteliais17. Também deve ser notado que, desde que este protocolo baseia-se na microscopia confocal, a resolução lateral é limitada pela difração e não é possível resolver estruturas menores que cerca de 175 a 250 nm (Figura 2).
Estudos anteriores têm realizado uma análise detalhada da composição celular da unidade neurovascular usando microscopia confocal25,26. No entanto, investigar transporte intracelular no BBB se baseia principalmente na utilização de microscopia eletrônica de transmissão19,,27,28. Enquanto esse método oferece a mais alta resolução lateral das estruturas intracelulares, microscopia eletrônica continua a ser uma técnica desafiadora com baixa taxa de transferência. Além disso, o número de diferentes alvos moleculares que podem ser visualizadas por EM é muito limitado. Este protocolo oferece uma alternativa acessível para investigar o transporte intracelular no BBB. O procedimento completo, da coleção do cérebro para análise de imagem, pode ser executado em 5 a 6 dias. Se os anticorpos apropriados estão disponíveis, imunofluorescência permite a detecção simultânea de vários tipos de célula/moléculas dentro da mesma amostra. Além disso, esse protocolo poderia ser combinado com técnicas de microscopia Super-resolução para superar as limitações na resolução espacial29. No geral, o protocolo descrito acima permite a quantificação de alterações a localização intracelular de proteínas de interesse dentro da unidade neurovascular. Sua aplicação para diferentes perturbações genéticas ou farmacológicas permitirá investigar as funções de estrutura e transporte intracelulares do BBB na vivo.
Disclosures
Os autores estão sob emprego remunerado pela Roche.
Acknowledgments
R.V. trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos de pós-doutorado de Roche (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
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