Summary
Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed - hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.
Abstract
De bloed - hersenbarrière (BBB) is een dynamische meercellige interface die het vervoer van moleculen tussen het verkeer en de hersenen regelt. Transcytosis over de BBB regelt de levering van hormonen, metabolieten en therapeutische antistoffen aan de hersenen parenchym. Hier presenteren we een protocol dat immunofluorescentie van vrij zwevende secties met laser scannen confocale microscopie en beeldanalyse combineert te visualiseren subcellular organellen binnen endotheliale cellen bij de BBB. Deze gegevensset te combineren met de software van de analyse van de 3D-afbeelding staat voor de semi-automatische segmentatie en kwantificering van capillaire volume en oppervlakte, alsmede het aantal en de intensiteit van intracellulaire organellen op de BBB. De detectie van de muis endogene immunoglobuline (IgG) binnen de intracellulaire vesikels en hun kwantificering op de BBB wordt gebruikt ter illustratie van de methode. Dit protocol kan mogelijk worden toegepast op het onderzoek naar de beheersing van BBB transcytosis van verschillende moleculen in vivomechanismen.
Introduction
De bloed - hersenbarrière (BBB) is een continue cellulaire barrière gevormd door astrocyten, pericytes, neuronen en endotheliale cellen die het centrale zenuwstelsel (CNS) de bloed omloop1 scheidt. De verordening van het vervoer over de BBB speelt een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van de hersenen en is bemiddeld door gespecialiseerde eigenschappen van endothelial hersencellen (BECs). De aanwezigheid van strakke intercellulaire kruispunten tussen BECs en een lage basale snelheid van transcytosis beperken de paracellular en transcellulair vervoer van bloed overgedragen moleculen, respectievelijk2. Onlangs, heeft het transcytosis traject in BECs zijn aangewend om te verbeteren van therapeutische grote moleculen naar de hersenen3,4. Echter zijn de mechanismen van transcytosis over de BBB nog niet volledig gekenmerkt5,6.
Uitgebreide werk verricht in vitro om te ontcijferen van de cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van intracellulair transport over BECs7,8,9,10, 11, maar dergelijke systemen niet recapituleren de complexe architectuur en de Fysiologie van de neurovasculaire eenheid (NVU). Aan de andere kant, studies in vivo12,13 verstrekken gedetailleerde kwantitatieve informatie over vrachtprijzen over de BBB maar bieden geen inzicht in de intracellulaire mechanismen van vervoer. Onderzoek naar de cellulaire en intracellulaire componenten van de NVU blijft in vivo en ex vivo derhalve zeer uitdagend14. Slechts een beperkt aantal technieken zijn vatbaar voor het analyseren van subcellular structuren binnen cellen van de NVU. De meeste studies gebruik elektronenmicroscopie, maar deze techniek is beperkt door de complexe protocollen die nodig zijn voor goede weefsel voorbereiding en behandeling van het monster. Daarom we ingesteld een methode gebaseerd op hoge resolutie confocale microscopie die de verwerking van de monsters van de hersenen, de analyse en de kwantificering van subcellular compartimenten binnen cellen van de NVU vergemakkelijken zou.
Hier beschrijven we een protocol die gebruik maakt van de muis hersenen vrij zwevende secties voor het uitvoeren van kwantitatieve beeldvorming van de BBB en NVU de cellulaire en subcellular niveau. We geteste en gevalideerde een aantal antilichamen beeld te reconstrueren van de NVU in drie dimensies. Bovendien staat dit protocol beeldvorming bij de maximale optische resolutie van de diffractie-limited van organellen binnen de hersenen haarvaten. Samen met beeldanalyse, kan dit protocol worden gebruikt om te onderzoeken het intracellulair transport van macromoleculen in de BBB onder verschillende experimentele omstandigheden, bijvoorbeeld in muismodellen van de ziekte van neurodegeneratie.
Protocol
ethische goedkeuring voor deze studie werd verzorgd door de federale voedselveiligheid en Veterinair Bureau van Zwitserland. Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte naleving van de Zwitserse federale ordinance over dierenbescherming en – welzijn en volgens de regels van de vereniging voor de beoordeling en de accreditatie van Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. generatie van hersenen Free-floating secties
- om optimale monster kwaliteit, bereid een verse oplossing van 2% paraformaldehyde (PFA) in een fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) op de dag van de perfusie.
Let op: PFA is matig toxische door contact met de huid en waarschijnlijk kankerverwekkend te worden ingedeeld. Nitril handschoenen gebruiken om te behandelen PFA en bereid de oplossing onder een chemische zuurkast.- Bereiden van PFA per dier 60 mL.
- Bring PFA in oplossing door het verhogen van de pH met 180-200 µL van een 5 M KOH-oplossing voor elke 100 mL PBS en verwarming van de oplossing tot 60 ° C.
Opmerking: NaOH mag niet worden gebruikt als het een negatieve invloed weefsel behoud bij fixatie. - Laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur en breng de pH tot 7.4 met behulp van HCl. Filter de oplossing met behulp van filtreerpapier (Zie Tabel of Materials).
- Een hele muis fixatie via transcardial perfusie uitvoeren als eerder beschreven 15 met enkele wijzigingen. Eerst, het bloed van de therapieën met 20 mL PBS spoelen dan perfuse met 40 mL 2% PFA.
- Verwijderen van de hersenen van de schedel als eerder beschreven 15.
- Immerse een vers 2% PFA-geperfundeerd hersenen in 20 mL 2% PFA gedurende 7 uur bij 4 ° C voor na fixatie.
Opmerking: Verhoging van de incubatie in PFA wordt niet aanbevolen omdat het voorkomen de detectie van intracellulaire structuren dat kan. - Uitgebreid wassen de hersenen met ijskoude PBS.
- Embed vaste hersenen in agarose.
- Voorbereiden een 3% agarose oplossing in PBS met behulp van een magnetron voor verwarming. Zachtjes swirl de oplossing om het afkoelen maar voorkomen van stollen.
- Droog uit de overmaat van PBS rond de hersenen voor onderdompeling in de agarose oplossing in een kunststoffles. Draaien van de hersenen in de agarose luchtbellen te verwijderen. Toestaan dat de agarose te stollen door afkoeling op ice.
- Zorgvuldig verwijderen van het agarose blok uit de plastic container en snijd een kubus rond de hersenen met behulp van een scheermesje. Monteren van de hersenen op een monsterhouder vibratome (Zie Tabel van materialen) met behulp van Cyanoacrylaat lijm (Zie Tabel van materialen). Voldoende tijd voor de lijm te stollen voordat u verdergaat met het segmenteren.
- Overdracht de hersenen in de monsterhouder aan het Dienblad van de buffer vibratome gevuld met PBS. Gebruik de vibratome om de afdeling 100 µm hersenen segmenten (Sagittaal of coronale). Verzamelen van hersenen secties in een 6-well-plate eerder gevuld met PBS.
- Op afwerking hersenen afdelen, zorgvuldig PBS Verwijder en vervang door een oplossing van 1:1 van PBS/glycerol.
- Secties in PBS/glycerol worden opgeslagen bij -20 ° C.
2. Cel of organel etikettering door immunofluorescentie kleuring
- zorgvuldig overdracht een gedeelte van de hersenen in een putje van de plaat van een 24-well eerder gevuld met 500 µL van PBS per well. De sectie blijft tot het einde van de procedure in de zelfde put.
- Spoel de sectie tweemaal met 500 µL van PBS voor 5 min onder zachte agitatie.
- Verwijderen van de PBS en het uitvoeren van gelijktijdige blokkeren en permeabilization van hersenen segmenten.
- Voorbereiden een blokkeren en permeabilization oplossing met 0,3% Triton-X en 10% serum van ezel in PBS.
Opmerking: Donkey serum kan worden vervangen door geit serum overeenkomt met de host-soorten van de specifieke secundaire antilichamen gebruikt. - Broeden secties met 250 µL van blokkeren en permeabilization oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder zachte agitatie.
- Voorbereiden een blokkeren en permeabilization oplossing met 0,3% Triton-X en 10% serum van ezel in PBS.
- De oplossing verwijderen en toevoegen van een oplossing van de PBS met 5% ezel serum en het primaire antilichaam bij een juiste verdunning (b.v., 1:100 tot 1:1, 000). Na een nacht bebroeden bij 4 ° C onder zachte agitatie.
Opmerking: Zie de Tabel van materialen voor een lijst van antilichamen die met succes het label van de verschillende soorten cellen voor de NVU met dit protocol. De optimale verdunning van primaire antilichamen moet empirisch worden bepaald. Verdun voor gelijktijdige etikettering van verschillende antigenen, alle primaire antilichamen in dezelfde oplossing. Alle primaire antilichamen moeten worden opgetrokken in verschillende soorten. Ter verbetering van antilichaam penetratie, monsters kunnen worden ge¨ uncubeerd maximaal 72 uur bij 4 ° C. - Verwijderen antilichaam oplossing en wassen secties driemaal voor 10 min in PBS onder zachte agitatie bij kamertemperatuur. Verwijder PBS en voeg 250 µL PBS oplossing met 5% ezel serum en de juiste soortspecifieke fluorescently geëtiketteerde secundair antilichaam. Incubeer secties bij kamertemperatuur gedurende 1 uur onder zachte agitatie.
- Zie Tabel van materialen voor een lijst van de secundaire antilichamen gebruik met dit protocol.
- In de secties voor antilichaam-oplossing en wassen drie keer, gedurende 10 min in PBS verwijderen onder zachte agitatie bij kamertemperatuur.
- Verwijderen van PBS en voeg 250 µL van een 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oplossing met een eindconcentratie van 1 µg/mL. Incubeer secties bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder zacht agitatie. Verwijderen van de DAPI oplossing en wassen secties 3 keer voor 5 min met PBS.
- Monteren de hersenen-sectie op het verlijmen van microscopie dia's (bijvoorbeeld histo-bond glas dia's). Verwijder voorzichtig de overtollige PBS rond de sectie op de dia. Voeg een druppel van montage medium (zie tabel van materialen) op de top van de sectie van de hersenen en zorgvuldig bedek het met een dekglaasje 0,17 mm (nr. 1.5) borosilicaatglas aan.
- Opslaan van monsters bij 4 ° C beschermd tegen licht tot het uitvoeren van de Beeldacquisitie.
3. Hoge resolutie Confocal Imaging van de bloed - hersenbarrière
- Beeldacquisitie uitvoeren met een geschikt laser-scanning confocal microscoop (Zie Tabel van materialen) met laserlijnen onder 405, 488, 561 en 633 nm voor excitatie van fluorophores in de blauwe, groene, oranje en rode gebieden van het Lichtspectrum. Voor Beeldacquisitie, een 63 X olie doelstelling te gebruiken met een numerieke opening van 1.4.
- In de overname van de software die de Microscoop regelt, menureeks de afbeelding overname parameters. In het drop-down menu van ‘ Afbeeldingsgrootte ’, selecteert u een waarde van 1024 x 1024 pixels. Wijzig de pixelgrootte op een waarde tussen 200 en 300 nm door aanpassing van de waarde van de ‘ Zoom ’ menu. ”
Opmerking: voor de analyse van intracellulaire structuren, de pixelgrootte te reduceren tot 75 nm. Deze instelling voor het paginaformaat van afbeelding aanzienlijk verhoogt de Acquisitietijd en kan worden teruggebracht tot 512 x 512 pixels te verminderen de Acquisitietijd door imaging een kleiner gezichtsveld. - In de ' overname snelheid ' drop-down menu, selecteer een waarde van 400 Hz, dat wil zeggen 400 lijnen per seconde. In de ' systemen instellingen & #39; menu, selecteer het ' pixeldiepte ' drop-down menu, en verander de waarde naar 12 bit.
- In de Microscoop software, binnen de ' overname ' tabblad/uitschakelen op de optie voor overname van de sequentiële frame. De dikte van de optische sectie ingesteld op een waarde tussen 0,75 en 1 µm voor elk kanaal door het wijzigen van de waarde in het ' Pinhole ' menu.
- In het deelvenster voor fluorescerende excitatie, activeren de laser moet optimaal prikkelen de fluorophores in de steekproef, bijvoorbeeld een 488 nm laser lijn voor een groen-uitstotende fluorophore.
Opmerking: Gebruik een fluorophore spectra viewer (Zie Tabel van materialen) om te selecteren van de laser voldoende excitatie. - In het deelvenster voor fluorescerende detectie, de schuifregelaar om te selecteren de golflengtes die zal worden gemeten in elk kanaal, bijvoorbeeld tussen 510 en 550 nm voor een groen-uitstotende fluorophore.
Opmerking: Gebruik een fluorophore spectra viewer (Zie Tabel van materialen) om te kiezen van de passende detectie golflengtes. - Voeg een druppel immersie-olie met een brekingsindex van 1.52 bovenop het dekglaasje aan met het gedeelte van de hersenen aan de brekingsindex van de doelstelling en glas dekglaasje aan. Leg het monster in de Microscoop en inschakelen van de lamp van de epifluorescerende tot het visualiseren van het monster met behulp van de Microscoop verrekijkers.
- Het filterwiel om een geschikt is voor het visualiseren van de DAPI gebeitste kernen filter selecteert met behulp van de knoppen op de stand van de Microscoop, wijzigen. Gebruik de grof focus om het signaal van de DAPI gebeitste kernen in focus.
- Filters om te visualiseren het signaal van vasculaire markeringen (bijvoorbeeld CollagenIV of CD31) en het centrum van het gezichtsveld op een individuele capillaire segment wijzigen met behulp van de knoppen op de stand van de Microscoop,.
- Druk op de knop om te beginnen met de live-scan-modus. Tijdens het scannen pas de intensiteit van de winst en laser voor elk kanaal om te maximaliseren van het dynamisch bereik van de beelden en vermijden van pixel verzadiging.
Opmerking: Gebruik een look-up tabel waarmee labels verzadigde pixels om het visueel beoordelen van overmatige verzadiging. Om te voorkomen dat signaal overmatige verzadiging, pas de instellingen aan met het monster die naar verwachting hebben de hoogste fluorescent signaal. - Stelt u de waarde voor regel gemiddeld 2.
Opmerking: Bij gebruik van hogere snelheden van de overname, verhogen deze waarde verminderen lawaai. - Stellen begint en eindigt secties voor het uitvoeren van optische z-stacks die zich uitstrekken over het hele volume van het capillair. Gebruik een stap grootte van 0,45 µm.
Opmerking: Als afbeeldingen wordt gebruikt voor de daaropvolgende kwantificering, houd de dezelfde overname-instellingen voor de volledige gegevensset. - Voor kwantificering, krijgt 10 tot 20 z-stacks per sectie van ten minste drie verschillende muizen voor statistische vergelijkingen.
Opmerking: Het verwerven van de volledige gegevensset in dezelfde sessie om de variabiliteit die voortvloeien uit monster bleken en laser intensiteit schommelingen.
4. Afbeelding van verwerking en 3D-reconstructie van de neurovasculaire eenheid
- (optioneel) te verhogen van de resolutie van de axiale van de verworven z-stacks, deconvolutie van de gegevensset van de afbeelding met behulp van de juiste software uit te voeren (Zie tabel van materialen ).
- In de deconvolutie software, wijzig de instellingen voor het uitvoeren van " Blind " deconvolutie, (dat wil zeggen, met behulp van een adaptieve functie punt-spread).
- In de deconvolutie software-instellingen, knevel op de optie voor het verwijderen van de achtergrond; deze optie bepaalt u de kleinste intensiteitswaarde in de afbeeldingsstapel en het aftrekken van de intensiteitswaarden van alle pixels in de afbeelding.
- In de deconvolutie software-instellingen, weg van een knevel de opties voor het herschalen van intensiteit en vergroten/verkleinen tot 16 bit diepte; deze opties blijft de originele intensiteitswaarden en het dynamisch bereik van de beelden.
- In het menu van ' Refractive index ', de waarde instelt op 1.52. In de ' Set golflengte ' menu, selecteer de uitstoot voor elk kanaal van de afbeelding waarden. Bijvoorbeeld, selecteer 520 voor een groen-uitstotende fluorophore.
- Open de afbeelding gegevensset met behulp van software geschikt voor visualisatie en analyse van 3-dimensionale datasets (Zie Tabel van materialen). In de software van de analyse van de afbeelding, drukt u op de " Surpass " knop weer te geven van het 3D-volume van haarvaten.
- In de afbeelding analyse software pers de " toevoegen nieuwe oppervlak " knop segmenten van de capillaire oppervlak. Gebruik van de bodem pijlen om te schakelen tussen de stappen in de wizard oppervlakte maken.
- In de ' maken ' tab ingesteld, het bronkanaal naar het kanaal met capillaire marker, bijvoorbeeld CollagenIV, en het detail van de oppervlakte tot een waarde van 0,5 µm.
Opmerking: De laatste optie een Gaussiaans filter toegepast op de afbeelding en de gladheid van het oppervlak bepaalt. - In de ' maken ' tabblad/uitschakelen op de optie voor absolute intensiteit drempel.
Opmerking: Deze optie wordt een oppervlak gemaakt door het genereren van een masker op basis van de absolute intensiteit van het geselecteerde kanaal in de afbeelding. - Op de volgende stap in de wizard oppervlakte maken, passen de lagere intensiteit drempel voor het oppervlak door het bewegen van het schuifraam over het histogram intensiteit totdat het gesmolten masker het hele capillair in de afbeelding dekt. Het waardebereik voor deze parameter empirisch voor iedere gegevensverzameling bepalen.
- Op de laatste stap van de wizard oppervlakte maken, klik op het drop-down menu onder " Type Filter " en selecteer de optie ' nummer van Voxels '. Het minimum aantal voxels ingesteld op een waarde tussen 1.0e5 te 2.0e5.
Opmerking: Deze optie zal het uitsluiten van oppervlakken met een klein aantal voxels, bijvoorbeeld, kleine segmenten van haarvaten aan de rand van het frame. - De oppervlakte creatie wizard hebt voltooid en sla de oprichting parameters door te klikken op " parameters te onthouden " op het tabblad van de reconstructie van het oppervlak menu.
- Herhaal de procedure voor de hele gegevensset imaging door het laden van de parameter is ingesteld voor de eerste afbeelding gebruikt. Aanpassen van de parameters voor de intensiteit, de drempel, en het minimum aantal voxels voor elke afbeelding die verschillen in achtergrond intensiteit en capillaire morfologie, voor hun rekening respectievelijk.
- In de ' maken ' tab ingesteld, het bronkanaal naar het kanaal met capillaire marker, bijvoorbeeld CollagenIV, en het detail van de oppervlakte tot een waarde van 0,5 µm.
- Te segmenteren intracellulaire vesiculaire structuren (bv, immunoglobulin gevulde Endosomen), maakt eerst een nieuw kanaal die uitsluitend fluorescent signaal van binnen het capillair bevat.
Opmerking: Dit proces zal definiëren een regio van belang door het creëren van een masker met behulp van de capillaire oppervlak gemaakt in stap 4.3- Selecteer de ' bewerken ' menu in de ' capillaire oppervlak ' paneel. Onder ' maskeren eigenschappen ', klik op " masker alle ". Selecteer het kanaal waarin de intracellulaire vesikel signaal als de ' bronkanaal ' en knevel op de optie " kanaal dupliceren alvorens masker ".
- In de ' mask instellingen ' kolom, selecteer " Constant binnen/buiten " en " Set voxels buitenoppervlak aan: " en stel de waarde 0,00.
Opmerking: Hiermee maakt u een extra kanaal in de afbeelding waar alle voxels buiten de capillaire masker een intensiteitswaarde van 0 zal hebben. Kwantificeren van de gebeurtenissen buiten het capillair (dat wil zeggen, in de hersenen parenchym), kiest u " instellen voxels binnen oppervlak aan: " en stel de waarde 0,00. - Te segmenteren vesiculaire structuren, druk op de knop om te beginnen de " toevoegen nieuwe Spots " wizard. Gebruik van de bodem pijlen om te schakelen tussen de stappen in de wizard oppervlakte maken.
- In het tabblad maken, gebruik de drop-down menu onder " bronkanaal " om te selecteren van het intracellulaire gemaskerde kanaal gemaakt in stap 4.4.4.
- In het tabblad maken, onder de " ter plaatse detectie " afdeling, de geschatte diameter van de XY ingesteld op een waarde tussen 0,5 en 1 µm, afhankelijk van de gemiddelde grootte van blaasjes waargenomen het experiment. Deze optie bepaalt u de kleinste grootte die zal worden gedetecteerd door de segmentatie algoritme.
- In het tabblad maken, onder de " ter plaatse detectie " sectie, knevel op de optie voor " achtergrond aftrekken ".
Opmerking: Deze optie wordt de afbeelding glad met een Gaussiaans filter van 0,75 plek straal (van de waarde die is geselecteerd in stap 4.4.7) en dan aftrekken van de intensiteit van de oorspronkelijke afbeelding Gaussiaans gefilterd door 0.88 plek straal. - In de ' maken ' tabblad, druk op de dropdown menu onder ' Type Filter ' en selecteer " kwaliteit ". Merk op dat dit het beeld segment zal door het toepassen van drempels op basis van de intensiteit in het midden van de plekken. De lagere intensiteit drempel aanpassen door het bewegen van het schuifraam in de ' kwaliteit ' histogram tot de meerderheid van de identificeerbare blaasjes zijn geëtiketteerd.
Opmerking: Het waardebereik voor deze parameter moet empirisch worden vastgesteld voor iedere gegevensverzameling. - Voltooien van de wizard ter plaatse maken en opslaan van de parameters creëren door op de knop " onthouden van parameters " op het tabblad van de reconstructie van het oppervlak menu.
- Herhaal de procedure voor de hele gegevensset imaging door het laden van de parameter is ingesteld voor de eerste afbeelding gebruikt. Aanpassen van de parameters voor de ' kwaliteit intensiteit drempel ' voor elke afbeelding ter verantwoording voor verschillen in achtergrond intensiteit.
5. Kwantificering van intracellulair Transport op de BBB
- kwantificeren het volume (in µm 3) en de ruimte (in µm 2) van de capillaire segment. In de analysesoftware, toegang krijgen tot het panel van de statistieken van de vasculaire oppervlak in 4.3 stap hebt gemaakt. Selecteer de ' gedetailleerd ' tab, en gebruik de drop-down menu om te selecteren " alle waarden " zoeken naar de waarden voor volume en oppervlakte.
- Kwantificeren het aantal blaasjes in het capillaire segment. In de analysesoftware, toegang krijgen tot het panel van de statistieken van de vlekken gemaakt in stap 4.4. Selecteer de ' algemene ' tabblad vindt u de waarde van het totale aantal plekken in de afbeelding. Het aantal plekken normaliseren
- voor het berekenen van het aantal blaasjes per capillaire volume, voor elke afbeelding door het volume berekend in stap 5.1. Deze waarde vermenigvuldig met 1.000 te krijgen het aantal blaasjes per 1.000 µm 3 van de capillaire volume.
- Te kwantificeren van de totale intensiteit binnen het capillair maken een nieuw oppervlak dat betrekking heeft op de hele afbeelding volgens de instructies in stappen 4.3 met de volgende wijzigingen beschreven. Selecteer het kanaal dat het relevante signaal (bijvoorbeeld, mIgG) als bronkanaal bevat en stel de waarde van het detailniveau van de oppervlakte op 5 µm. Als u een oppervlak dat de hele afbeelding bedekt, stelt de waarde van de lagere intensiteit drempel op 0.
- In de analysesoftware, toegang krijgen tot het panel van de statistieken van het oppervlak in stap 5.4 gemaakt. Selecteer de " gedetailleerd " tab, en gebruik de drop-down menu om te selecteren " alle waarden ". Opnemen van de waarden voor ' intensiteit som ' voor de kanalen van belang; Deze parameter komt overeen met de som van de individuele intensiteitswaarden over alle pixels.
Opmerking: Voor een intracellulair signaal, dit komt overeen met het gedupliceerde kanaal met voxels buitenoppervlak ingesteld op 0.0. Een signaal in de hersenen parenchym, komt dit overeen met het gedupliceerde kanaal met voxels binnen oppervlak ingesteld op 0.0. - Voor de berekening van de intensiteit van de fluorescentie per capillaire volume, voor elke afbeelding normaliseren de intensiteit door het volume berekend in stap 5.1. Deze waarde vermenigvuldig met 1.000 te krijgen van de fluorescentie intensiteitswaarde per 1.000 µm 3 van de capillaire volume.
Opmerking: Voor fluorescerende signalen in de hersenen parenchym, de waarden van het totale beeld volume minus het capillaire volume normaliseren en vermenigvuldig met 1.000 te krijgen van de totale intensiteit per 1.000 µm 3 van hersenen parenchym. - Herhaal de procedure voor de hele gegevensset en gebruiken van geschikte software voor het uitvoeren van statistische analyse van de gegevens.
Representative Results
Als representatieve voorbeelden van afbeeldingen zijn verkregen van het protocol beschreven hier, muis hersenen secties werden gekleurd met antistoffen herkennen van de verschillende onderdelen van de NVU met inbegrip van de kelder membraan, astrocyten, pericytes, en endotheliale cellen (Zie Tabel van materialen voor specifieke antilichamen gebruikt) (figuur 1A, D, en E). Bij deze resolutie is het mogelijk om te onderscheiden van de afzonderlijke astrocytic processen en einde-voeten die in direct contact met de haarvaten.
Nadruk wordt gelegd op de geschiktheid van dit protocol voor de detectie van intracellulaire structuren, werden secties van de hersenen van dieren ook ingespoten met de menselijke anti-Tau mAb86 antilichaam16 gekleurd met een fluorescently geëtiketteerde anti-menselijke antilichaam ( Figuur 1B). mAb86 is bekend dat specifiek doel neuronen uitdrukken van een pathologische vorm van Tau16. Met het protocol beschreven hierin, werd mAb86 met diffractie-beperkte resolutie binnen individuele vesiculaire structuren binnen neuronen (Figuur 1-B-C) ontdekt. Bovendien, werd endogene muis IgG ontdekt in de intracellulaire structuren binnen endotheliale cellen maar niet in pericytes (Figuur 1D-E en Figuur 2).
De overname van high-resolution confocal z-stapels van de therapieën van de hersenen zorgt voor driedimensionale segmentatie van de haarvaten en intracellulaire vesikels bij de BBB. Figuur 2 toont een voorbeeld van het proces van opbouw en segmenteren van een capillair gekenmerkt met CollagenIV en muis IgG-positief intracellulaire vesikels. Door het kwantificeren van een volledige dataset van gesegmenteerde afbeeldingen, bijvoorbeeld door het meten van het aantal blaasjes per capillaire volume, is het mogelijk om te bestuderen van de veranderingen in intracellulair transportprocessen onder verschillende omstandigheden. Figuur 3 B-C toont de verschillen in mIgG blaasje nummer en fluorescentie intensiteit overeenkomt met mIgG op de hersenen parenchym, respectievelijk, na uitputting van het pericyte in de pdgf-bret/ret muismodel als eerder gemeld 17. dezelfde aanpak werd onlangs ook gebruikt voor het analyseren van wijzigingen in intracellulair transport op de BBB tussen verschillende hersenen regio's18.
Figuur 1: Etikettering van meerdere celtypen en subcellular structuren van de neurovasculaire apparaat Representatieve beelden van de neurovasculaire eenheid (A en D) en de intracellulaire vesikels neuronen (B) deel uitmaakt of de endotheliale cellen (E) verkregen met dit protocol. De maximale intensiteit projectie afbeelding in A (boven) toont de verdeling van GFAP-positieve astrocyten (rood) omliggende haarvaten geëtiketteerd door CollagenIV (groen). Pijlen wijzen naar afzonderlijke astrocytic processen. Schaal bar = 20 µm. Bij deze resolutie zijn de individuele Astrocyt processen en einde-voeten duidelijk zichtbaar, zoals in het gezoomde beeld van de boxed Gewest (onder). Pijlpunten wijs astrocytic einde-voeten. Schaal bar = 10 µm. De afbeelding b toont de accumulatie van een antilichaam ook geïnjecteerd, mAb86 (groen), binnen een hippocampal neuron. Individuele mAb86-positieve blaasjes wijs pijlpunten. Schaal bar = 10 µm. De grafiek in C toont de lijn profiel intensiteit van een enkele blaasje. De grootte van het vesikel was geraamd helft maximaal een Gaussiaanse pasvorm (zwarte ononderbroken lijn) van de curve van de intensiteit (groene lijn en cirkels) uit de volle breedte. De afbeeldingen in D tonen een drie-dimensionale reconstructie van een endothelial cel (groen), omringd door een pericyte (rood) binnen de basale lamina (CollagenIV, grijs). De lagere panelen tonen de individuele fluorescentie-kanalen. Schaal bar = 10 µm. De afbeeldingen in E tonen de lokalisatie van mIgG (rood) in intracellulaire vesikels binnen endotheliale cellen (links paneel, CD31 in het groen) maar niet in pericytes (juiste paneel, CD13 in het groen). DAPI gekleurd kernen worden in alle afbeeldingen weergegeven in blauw. Schaal bar = 5 µm. panelen D en E zijn gewijzigd van17van de referentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Driedimensionale weergave van haarvaten en intracellulaire vesikels bij de bloed - hersenbarrière. Met het protocol beschreven, confocal resolutieafbeeldingen van CollagenIV-positieve haarvaten (groen) en muis IgG intracellulaire vesikels (rood) werden verworven (A). Het linker paneel toont een interne optische sectie met dwarsdoorsneden. De pijlen wijzen naar de afzonderlijke mIgG-positieve blaasjes binnen endothelial hersencellen. Het panel voor de juiste toont de 3D reconstructie van het gebruik van de volledige z-stack beeld processing software (Zie Tabel van materialen). De capillaire volume (B) en individuele blaasjes (C) werden weergegeven in drie dimensies en gekwantificeerd aan de hand van beeld processing software (Zie Tabel van materialen). DAPI gekleurd kernen worden in alle afbeeldingen weergegeven in blauw. Schaal bars = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Kwantificering van de intracellulaire lokalisatie van de mIgG op de BBB. Representatieve afbeeldingen tonen (A) driedimensionele reconstructies van haarvaten (voorzien van collagenIV, groen) en de verdeling van de mIgG (rood) in C57BL/6 muizen en pdgf-bret/ret pericyte uitgeput muizen eerder beschreven in19. Schaal bars = 10 µm. De afbeeldingen in B tonen de segmentatie van intracellulaire vesikels binnen het CollagenIV masker. The grafiek b toont de kwantificering en de vergelijking van mIgG blaasje nummer per volume capillair. Elk punt vertegenwoordigt metingen van afzonderlijke capillaire segmenten. De ononderbroken lijn toont het gemiddelde en de foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van de gegevens. De afbeeldingen in C Toon de mIgG fluorescentie signaal buiten het CollagenIV masker. Ook de grafiek in C toont de kwantificering en de vergelijking van mIgG fluorescentie intensiteit in de hersenen parenchym tussen C57BL/6 muizen en pdgf-bret/ret pericyte uitgeput muizen. Fluorescentie intensiteit eenheden waren genormaliseerd door de gemiddelde mIgG parenchym intensiteit, gemeten in alle C57BL/6 muizen. Dit cijfer is gewijzigd van referentie17. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het hierboven beschreven protocol beschrijft de voorbereiding van de vrij zwevende secties van de hersenen, immunefluorescentie kleuring Beeldacquisitie en analyse gebruikte parameters voor hoge resolutie microscopie van de BBB. Deze methode is onlangs gebruikt om te onderzoeken van de lokalisatie van antilichaam levering platformen3, het vervoer van endogene IgG over de BBB-17en de heterogeniteit van de BBB op pericyte verlies18. Verschillende stappen in het protocol kunnen worden gewijzigd om aan te passen aan de specifieke doel van het experiment. Eerst, vergemakkelijkt het gebruik van dikke (100 µm) secties hun behandeling tijdens de procedures voor immunokleuring en montage. Het staat ook voor 3D reconstructie van het capillaire netwerk, de neurovasculaire eenheid, en voor de generatie van capillaire en NVU dwarsdoorsneden. Echter penetratie van antilichamen binnen de weefselsecties kan variëren en sommige antilichaam kleuring kan worden beperkt tot de oppervlakkige laag van het weefsel dicht bij het dekglaasje aan. Het protocol kan worden gewijzigd door verhoging van de concentratie van wasmiddel tijdens de stap van de permeabilization en/of de lengte van de permeabilization stap ter verbetering van antilichaam penetratie in het weefsel. Ten tweede kan beeldkwaliteit worden aangetast wanneer probeert te verwerven beelden dieper in het weefsel (meestal 20 tot 30 µm onder het oppervlak) wegens lichtverstrooiing evenals optische aberraties van brekingsindex wanverhouding. Om dit probleem te verhelpen, kunnen nieuwe methoden voor weefsel clearing en actieve antilichaam penetratie20 worden gecombineerd met dit protocol tot de grotere volumes afbeelding van weefsel. Ten derde, deconvolutie wordt uitgevoerd na Beeldacquisitie ter verbetering van de axiale resolutie van de afbeelding. De keuze van het algoritme van de blinde deconvolutie gebruikt in dit protocol was gebaseerd op (i) het gebruiksgemak, zoals geen voorafgaande berekening van de punt-spread functie vereist is, (ii) zijn robuustheid voor verbetering van de beeld kwaliteit21, en (iii) het ontbreken van artefacten op mIgG intracellulaire structuren na implementatie. Afhankelijk van de intracellulaire structuren gevisualiseerd in de steekproef, andere deconvolutie algoritmen kunnen leiden tot hogere beeldkwaliteit. De volgende verwijzingen21,22 bieden een uitgebreide discussie over de voordelen en beperkingen van aanvullende algoritmen voor afbeelding deconvolutie. Tot slot, het gebruik van de softwarepakket van een beeld-analyse toegestaan de segmentatie van haarvaten en intracellulaire structuren in drie dimensies. Duidelijk beeldanalyse is niet beperkt tot de software zoals beschreven in het protocol en de alternatieve pakketten, bijvoorbeeld die wordt besproken in referentie23, kan worden gebruikt om afbeeldingen van het segment. De geschiktheid van verschillende software programma's voor de analyse van intracellulaire structuren in de BBB moet empirisch worden geverifieerd door de beoordeling van de juistheid van beeldsegmentatie.
Aangezien deze methode is gebaseerd op vaste monsters, biedt geen rechtstreekse informatie over de dynamiek van transcytosis over de BBB. Echter, het kan worden gecombineerd met tijdsverloop experimenten24, bijvoorbeeld door het intraveneus injecteren de molecule van belang en het meten van de accumulatie binnen BECs op verschillende tijdstippen na injectie, te reconstrueren de kinetiek van intracellulair transport. Het voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk voor de analyse van diepe hersengebieden, maakt zoals in18, dat momenteel niet toegankelijk zijn voor intravital levende imaging benaderingen. Een belangrijke stap tijdens het protocol is de zorgvuldige controle van weefsel fixatie. Fixatie met 4% PFA drastisch vermindert de immunogeniciteit van intracellulaire organellen en endogene of ook door de overheid gereguleerde immunoglobulinen17 (figuur 1B). Een beperking van dit protocol is de eis van kwalitatief hoogwaardige antistoffen (d.w.z., lage niet-specifieke kleuring, lage Kruisallergie) geschikt voor immunofluorescentie. Mits dergelijke reagentia beschikbaar zijn, kan de methode kan worden toegepast om te onderzoeken de intracellulaire lokalisatie van een proteïne van belang. Bijvoorbeeld, is het protocol gebruikt voor het identificeren van lysosomen in hersenen endotheliale cellen17. Ook opgemerkt moet worden dat aangezien dit protocol is gebaseerd op confocale microscopie, de laterale resolutie wordt beperkt door diffractie en niet structuren kleiner is dan ongeveer 175 tot 250 oplossen nm (Figuur 2).
Eerdere studies hebben gedetailleerde analyse van de cellulaire samenstelling van de eenheid van de neurovasculaire met behulp van de confocal microscopie25,26uitgevoerd. Echter berust onderzoeken intracellulair transport op de BBB meestal op het gebruik van Transmissie Electronenmicroscopie19,27,28. Hoewel deze methode de hoogste laterale resolutie van intracellulaire structuren biedt, blijft elektronenmicroscopie een uitdagende techniek met lage doorvoersnelheid. Bovendien is het aantal verschillende moleculaire doelwitten die kunnen worden gevisualiseerd door EM is zeer beperkt. Dit protocol biedt een toegankelijke alternatief om te onderzoeken van intracellulair transport op de BBB. De volledige procedure, uit hersenen collectie aan beeldanalyse, kan worden uitgevoerd in 5 à 6 dagen. Als geschikt antilichamen beschikbaar zijn, kan immunofluorescentie simultane detectie van meerdere cel typen/moleculen binnen hetzelfde monster. Bovendien kan dit protocol worden gecombineerd met super resolutie microscopie technieken te overwinnen van de beperkingen in ruimtelijke resolutie29. Globaal, kunnen via het protocol zoals hierboven beschreven de kwantificering van veranderingen in de intracellulaire lokalisatie van proteïnen van belang binnen de neurovasculaire eenheid. De toepassing ervan voor verschillende genetische of farmacologische verstoringen zal toestaan de intracellulaire structuur en transport functies van de BBB in vivoonderzoeken.
Disclosures
Auteurs zijn in loondienst van Roche.
Acknowledgments
R.V. werk werd gesteund door een Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
