Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood – brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.
La barrera blood – brain (BBB) es una interfaz multicelular dinámica que regula el transporte de moléculas entre la circulación y el cerebro. Transcitosis a través de la BBB regula la entrega de hormonas, metabolitos y anticuerpos terapéuticos a la parenquimia del cerebro. Aquí, presentamos un protocolo que combina la inmunofluorescencia de secciones libre-flotante con láser de barrido, microscopia confocal y análisis de imágenes para visualizar organelos subcelulares dentro de las células endoteliales en el BBB. La combinación de este conjunto de datos con software de análisis de imagen en 3D permite la segmentación semiautomática y cuantificación de volumen capilar y superficie, así como el número y la intensidad de los organelos intracelulares en el BBB. La detección de mouse endógena de la inmunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares y su cuantificación en el BBB se utiliza para ilustrar el método. Potencialmente, este protocolo puede aplicarse a la investigación de los mecanismos de control BBB transcitosis de diferentes moléculas en vivo.
La barrera blood – brain (BBB) es una barrera celular continua formada por astrocitos, pericitos, las neuronas y las células endoteliales que separa el sistema nervioso central (SNC) de la circulación de la sangre1. La regulación del transporte a través de la BBB desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y está mediada por las características especializadas de las células endoteliales del cerebro (BECs). La presencia de uniones intercelulares estrechas entre BECs y una baja tasa basal de transcitosis limitar el transporte paracelular y transcelular de moléculas por la sangre, respectivamente2. Recientemente, la vía transcitosis en BECs ha sido aprovechada para mejorar la entrega de grandes moléculas terapéuticas al cerebro3,4. Sin embargo, los mecanismos de la transcitosis a través de la BBB aún no han sido completamente caracterizadas5,6.
Trabajo extenso se ha hecho en vitro para descifrar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el transporte intracelular a través de BECs7,8,9,10, 11, pero estos sistemas no recapitular la compleja arquitectura y fisiología de la unidad neurovascular (NVU). Por otro lado, estudios en vivo12,13 proporcionar información cuantitativa detallada sobre las tarifas de transporte a través de la BBB, pero no proporcionan penetraciones en los mecanismos intracelulares de transporte. Por lo tanto, investigar los componentes celulares e intracelulares de la NVU in vivo y ex vivo sigue siendo muy difícil14. Sólo un número limitado de técnicas es susceptible de analizar estructuras subcelulares dentro de las células del NVU. Mayoría de los estudios utiliza la microscopia electrónica, pero esta técnica está limitada por los protocolos complejos necesarios para preparación de tejido adecuado y manejo de la muestra. Por lo tanto, hemos establecido una metodología basada en microscopía confocal de alta resolución que facilite el procesamiento de muestras de cerebro, el análisis y la cuantificación de compartimentos subcelulares dentro de las células del NVU.
Aquí, describimos un protocolo que utiliza secciones libre-flotante del cerebro de ratón para realizar la proyección de imagen cuantitativa de la BBB y NVU a nivel celular y subcelular. Había probado y validado una serie de anticuerpos de la imagen y reconstruir el NVU en tres dimensiones. Además, este protocolo permite la proyección de imagen en la resolución óptica máxima de difracción limitada de orgánulos dentro de los capilares del cerebro. Junto con análisis de imagen, este protocolo puede utilizarse para investigar el transporte intracelular de macromoléculas a través de la BBB bajo diferentes condiciones experimentales, por ejemplo, en modelos de ratón de la enfermedad de la neurodegeneración.
El protocolo descrito anteriormente describe la preparación de secciones del cerebro flotante, tinción inmunofluorescente, adquisición de imágenes y parámetros de análisis de microscopía de alta resolución de la BBB. Este método se ha utilizado recientemente para investigar la localización del anticuerpo entrega plataformas3, el transporte de IgG endógeno a través de la BBB17y la heterogeneidad de la BBB a pericyte pérdida18. Diferentes pasos en el protocolo pueden ser modificados para adaptarse al objetivo específico del experimento. En primer lugar, el uso de secciones gruesas (100 μm) facilita su manipulación durante el procedimiento de inmunotinción y montaje. También permite para reconstrucción 3D de la red capilar, de la unidad neurovascular y para la generación de capilar y cortes transversales NVU. Sin embargo, penetración de anticuerpos dentro de las secciones de tejido puede variar y algunas manchas del anticuerpo pueden ser restringido a la capa superficial del tejido cerca el cubreobjetos. El protocolo puede modificarse aumentando la concentración de detergente durante el paso de permeabilización o la longitud del paso de permeabilización para mejorar la penetración de anticuerpos en el tejido. En segundo lugar, la calidad de imagen puede verse comprometida cuando se trata de adquisición de imágenes más profundas dentro del tejido (generalmente de 20 a 30 μm por debajo de la superficie) debido a la dispersión de la luz así como aberraciones ópticas de índice de refracción de desajuste. Para superar este problema, nuevos métodos de tejido claro y anticuerpo activa penetración20 pueden combinarse con este protocolo a volúmenes más grandes de la imagen de los tejidos. En tercer lugar, la deconvolución se realiza después de la adquisición de imagen para mejorar la resolución axial de la imagen. La elección del algoritmo de deconvolución ciega utilizado en este protocolo se basó en (i) su facilidad de uso, ya que ningún cálculo previo de la función de punto de propagación se requiere, (ii) su robustez para mejorar la calidad de imagen21y (iii) la falta de artefactos en mIgG estructuras intracelulares después de la implementación. Dependiendo de las estructuras intracelulares visualizadas en la muestra, pueden resultar otros algoritmos de deconvolución en alta calidad de imagen. Las siguientes referencias21,22 proporciona una discusión extensa sobre las ventajas y limitaciones de los algoritmos adicionales para la deconvolución de la imagen. Finalmente, el uso de un paquete de software de análisis de imagen permitió la segmentación de los capilares y estructuras intracelulares en tres dimensiones. Claramente el análisis de imagen no se limita al software descrito en el protocolo y paquetes alternativos, por ejemplo las que se discuten en la referencia23, puede utilizarse para imágenes de segmento. La idoneidad de los programas de software diferentes para el análisis de las estructuras intracelulares a través de la BBB debe ser verificada empíricamente mediante la evaluación de la precisión de la segmentación de la imagen.
Debido a que este método se basa en muestras fijadas, proporciona información directa sobre la dinámica de transcitosis a través de la BBB. Sin embargo, se puede combinar con experimentos del curso del tiempo24, por ejemplo por vía intravenosa inyección de la molécula de interés y midiendo su acumulación dentro de BECs en diferentes momentos después de la inyección, para reconstruir la cinética de transporte intracelular. La ventaja de este enfoque es que permite el análisis de regiones profundas del cerebro, como se muestra en el18, que son actualmente inaccesibles para enfoques imagen vivo intravital. Un paso crítico durante el protocolo es el monitoreo cuidadoso de la fijación del tejido. Fijación con 4% PFA dramáticamente reduce la inmunogenicidad de los organelos intracelulares y de inmunoglobulinas endógenas o administrado periféricamente17 (figura 1B). Una limitación de este protocolo es su requisito de anticuerpos de alta calidad (es decir, bajo tinción inespecífica, baja reactividad cruzada) adecuados para inmunofluorescencia. Siempre que tales reactivos están disponibles, el método puede ser aplicado para investigar la localización intracelular de cualquier proteína de interés. Por ejemplo, el protocolo se utilizó para identificar los lisosomas en las células endoteliales de cerebro17. Debe señalarse también que, puesto que este protocolo se basa en microscopía confocal, la resolución lateral está limitado por difracción y no puede resolver las estructuras más pequeñas de aproximadamente 175 a 250 nm (figura 2).
Estudios previos han realizado un análisis detallado de la composición celular de la unidad neurovascular utilizando microscopía confocal25,26. Sin embargo, investigando el transporte intracelular en el BBB se basa principalmente en el uso de microscopia electrónica de transmisión19,27,28. Mientras que este método ofrece la máxima resolución lateral de estructuras intracelulares, microscopía sigue siendo una técnica difícil con bajo rendimiento. Por otra parte, el número de dianas moleculares diferentes que pueden ser visualizados de EM es muy limitado. Este protocolo ofrece una alternativa accesible para investigar el transporte intracelular en el BBB. El procedimiento completo de colección de cerebro para análisis de imágenes, puede realizarse en 5 a 6 días. Si se dispone de anticuerpos adecuados, inmunofluorescencia permite la detección simultánea de múltiples tipos de célula/moléculas dentro de la misma muestra. Por otra parte, este protocolo podría combinarse con técnicas de microscopía de superresolución para superar las limitaciones de resolución espacial29. En general, el protocolo descrito anteriormente permite la cuantificación de los cambios en la localización intracelular de proteínas de interés dentro de la unidad neurovascular. Su aplicación para diferentes perturbaciones genéticas o farmacológicas permitirá investigar las funciones de estructura y transporte intracelulares de la BBB en vivo.
The authors have nothing to disclose.
R.V. trabajo fue apoyado por una Beca Postdoctoral de la Roche (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |