Här presenterar vi ett mikroskopi-baserat protokoll för högupplöst avbildning och en tredimensionell rekonstruktion av musen neurovaskulära enhet och blod – hjärnbarriären använder hjärnan friflytande sektioner. Denna metod tillåter för visualisering, analys och kvantifiering av intracellulära organeller på BBB.
På blod – hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk flercelliga gränssnitt som reglerar transport av molekyler mellan cirkulationen och hjärnan. Transcytos över BBB reglerar leveransen av hormoner, metaboliter och terapeutiska antikroppar till hjärnparenkymet. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar immunofluorescens friflytande avsnitt med laserscanning konfokalmikroskopi och bildanalys att visualisera subcellulär organeller inom endotelceller på BBB. Att kombinera detta data-set med 3D bild analys programvara möjliggör halvautomatisk segmentering och kvantifiering av kapillär volym och yta, samt antalet och intensiteten av intracellulära organeller på BBB. Påvisande av mus endogena immunglobulin (IgG) inom intracellulära blåsor och deras kvantifiering på BBB används för att illustrera metoden. Detta protokoll kan potentiellt användas till utredningen av de mekanismer som styr BBB transcytos av olika molekyler i vivo.
På blod – hjärnbarriären (BBB) är en kontinuerlig cellulära barriär bildas av astrocyter, pericyter, nervceller och endotelceller som separerar det centrala nervsystemet (CNS) från blodcirkulationen1. Reglering av transport över BBB spelar en avgörande roll i att upprätthålla hjärnan homeostas och medieras av specialiserade egenskaper av hjärnan endotelceller (grundstrategi). Förekomsten av snäva intercellulära junctions mellan grundstrategi och låg basal hastighet transcytos begränsa paracellular och transcellular transport av blodburna molekyler, respektive2. Nyligen, transcytos clearanceväg grundstrategi har varit utnyttjas för att förbättra leveransen av terapeutiska stora molekyler i hjärnan3,4. Mekanismerna för transcytos över BBB har dock ännu inte har fullt kännetecknas5,6.
Omfattande arbete har gjorts i vitro att dechiffrera de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar intracellulära transport över grundstrategi7,8,9,10, 11, men sådana system misslyckas med att sammanfatta komplexa arkitektur och fysiologi av neurovaskulära enheten (NVU). Däremot, studier i vivo12,13 lämna detaljerade kvantitativa uppgifter om taxor över BBB men ger inte insikter i de intracellulära mekanismerna för transport. Därför förblir undersöker de cellulära och intracellulära komponenterna för NVU i vivo och ex vivo mycket utmanande14. Endast ett begränsat antal tekniker är mottagliga för analysera subcellulära strukturer i cellerna i NVU. De flesta studier använda elektronmikroskopi men denna teknik är begränsad av de komplexa protokoll som krävs för korrekt vävnad förberedelse och provhantering. Därför har vi etablerat en metod baserad på hög upplösning konfokalmikroskopi som skulle underlätta bearbetning av hjärnan prover, analysen och kvantifiering av subcellulär fack inom celler i NVU.
Här beskriver vi ett protokoll som använder mus hjärnan friflytande sektioner för att utföra kvantitativa imaging av BBB och NVU på cellulär och subcellulär nivå. Vi testade och validerade ett antal antikroppar mot bild och rekonstruera NVU i tre dimensioner. Dessutom tillåter detta protokoll imaging med maximal optisk diffraktion begränsad upplösning av organeller inom hjärnan kapillärerna. Tillsammans med bildanalys, kan detta protokoll användas för att undersöka intracellulär transport av makromolekyler över BBB under olika experimentella förhållanden, till exempel i mus sjukdomsmodeller för neurodegeneration.
Protokollet beskrivs ovan beskriver utarbetandet av hjärnan friflytande sektioner, Immunofluorescerande färgning, bild förvärv och analysparametrar för högupplösande mikroskopi av BBB. Denna metod har använts nyligen att undersöka localizationen av antikropp leverans plattformar3transport av endogent IgG över BBB17, BBB på pericyt förlust18heterogenitet. Olika steg i protokollet kan ändras för att anpassa sig till det specifika målet av experimentet. Först, underlättar deras hantering under förfarandena som immunfärgning och montering av tjock (100 µm) sektioner. Det gör också för 3D rekonstruktion av kapillär nätet, neurovaskulära enheten, och för generering av kapillär och NVU tvärsnitt. Dock penetration av antikroppar inom avsnitten vävnad kan variera och vissa antikroppar färgning kan begränsas till det ytliga lagret av vävnad nära täckglaset. Protokollet kan ändras genom att öka koncentrationen av rengöringsmedel under vilket steg eller längden på det permeabilisering steget för att förbättra antikropp penetration in i vävnaden. Bildkvaliteten kan andra äventyras när du försöker hämta bilder djupare i vävnaden (vanligtvis 20 till 30 µm under ytan) på grund av ljusspridning samt optiska avvikelser från brytningsindex mismatch. För att lösa detta problem, kan nya metoder för vävnad clearing och aktiva antikropp penetration20 kombineras med detta protokoll till bilden större volymer av vävnad. Det tredje utförs deconvolution efter bild förvärv att förbättra axiella upplösningen på bilden. Valet av den blinda deconvolution algoritm som används i detta protokoll var baserat på dess användarvänlighet, eftersom ingen före beräkning av funktionen point-spread krävs, (ii) dess robusthet för att förbättra bild kvalitet21, och (iii) avsaknaden av artefakter på mIgG intracellulära strukturer efter genomförandet. Beroende på de intracellulära strukturer som visualiseras i provet, kan andra deconvolution algoritmer resultera i högre bildkvalitet. Följande referenser21,22 ger en omfattande diskussion om fördelar och begränsningar av ytterligare algoritmer för bild deconvolution. Slutligen ett avbildningspaket analys programvara tillåtet segmentering av kapillärer och intracellulära strukturer i tre dimensioner. Tydligt bildanalys är inte begränsad till den programvara som beskrivs i protokollet och alternativa paket, till exempel de som diskuteras i referens23, kan användas till segmentet bilder. Lämpligheten av olika program för analys av intracellulära strukturer över BBB bör verifieras empiriskt genom att bedöma riktigheten av bild segmentering.
Eftersom denna metod är baserad på fasta prover, ger den inte direkt information om dynamiken av transcytos över BBB. Men kan det kombineras med tid-rätters experiment24, till exempel genom intravenöst injicerat molekyl av intresse och mäta dess ackumulation inom grundstrategi vid olika tidpunkter efter injektionen, att rekonstruera kinetiken för intracellulära transport. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det tillåter för analys av djupa hjärnregioner, som visas i18, som är för närvarande otillgänglig till intravital levande bildgivande metoder. Ett avgörande steg under protokollet är noggrann övervakning av vävnad fixering. Fixering med 4% PFA dramatiskt minskar immunogeniciteten av intracellulära organeller och endogen eller perifert administrerade immunglobuliner17 (figur 1B). En begränsning av detta protokoll är dess krav av hög kvalitet antikroppar (dvs, låg icke-specifik färgning, låg korsreaktivitet) lämplig för immunofluorescens. Förutsatt att sådant reagens är tillgängliga, kan metoden användas för att undersöka den intracellulära lokaliseringen av något protein av intresse. Exempelvis användes protokollet att identifiera lysosomer i hjärnan endotelceller17. Det bör också noteras att eftersom detta protokoll baseras på konfokalmikroskopi, laterala resolutionen begränsas av diffraktion och inte kan lösa strukturer mindre än ca 175 till 250 nm (figur 2).
Tidigare studier har utfört detaljerad analys av cellulära sammansättningen av neurovaskulära enheten med konfokalmikroskopi25,26. Dock bygger undersöka intracellulära transport på BBB mestadels på användningen av överföring elektronmikroskopi19,27,28. Denna metod erbjuder den högsta laterala upplösningen av intracellulära strukturer, elektronmikroskopi fortfarande är en utmanande teknik med låg genomströmning. Antalet olika molekylära mål som kan visualiseras av EM är dessutom mycket begränsad. Detta protokoll erbjuder ett tillgängligt alternativ för att undersöka intracellulära transport på BBB. Den fullständiga proceduren, från hjärnan insamling och bildanalys, kan utföras i 5 till 6 dagar. Om det finns lämplig antikroppar kan immunofluorescens samtidiga flera cell typer/molekyler inom samma prov. Detta protokoll kan dessutom kombineras med super-resolution mikroskopi tekniker för att övervinna begränsningarna i rumslig upplösning29. Övergripande, det protokoll som beskrivs ovan möjliggör kvantifiering av förändringar i den intracellulära lokaliseringen av proteiner av intresse inom neurovaskulära enheten. Dess tillämpning för olika genetiska eller farmakologiska störningar kommer att tillåta undersöker de intracellulära struktur och transport funktionerna av BBB i vivo.
The authors have nothing to disclose.
R.V. arbetet stöddes av en Roche postdoktorsstipendium (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |