Hier presenteren we een microscopie gebaseerde protocol voor hoge resolutie beeldvorming en een drie-dimensionale reconstructie van de muis neurovasculaire eenheid en bloed – hersen barrière met behulp van vrij zwevende secties van de hersenen. Deze methode zorgt voor de visualisatie, analyse en kwantificering van intracellulaire organellen op de BBB.
De bloed – hersenbarrière (BBB) is een dynamische meercellige interface die het vervoer van moleculen tussen het verkeer en de hersenen regelt. Transcytosis over de BBB regelt de levering van hormonen, metabolieten en therapeutische antistoffen aan de hersenen parenchym. Hier presenteren we een protocol dat immunofluorescentie van vrij zwevende secties met laser scannen confocale microscopie en beeldanalyse combineert te visualiseren subcellular organellen binnen endotheliale cellen bij de BBB. Deze gegevensset te combineren met de software van de analyse van de 3D-afbeelding staat voor de semi-automatische segmentatie en kwantificering van capillaire volume en oppervlakte, alsmede het aantal en de intensiteit van intracellulaire organellen op de BBB. De detectie van de muis endogene immunoglobuline (IgG) binnen de intracellulaire vesikels en hun kwantificering op de BBB wordt gebruikt ter illustratie van de methode. Dit protocol kan mogelijk worden toegepast op het onderzoek naar de beheersing van BBB transcytosis van verschillende moleculen in vivomechanismen.
De bloed – hersenbarrière (BBB) is een continue cellulaire barrière gevormd door astrocyten, pericytes, neuronen en endotheliale cellen die het centrale zenuwstelsel (CNS) de bloed omloop1 scheidt. De verordening van het vervoer over de BBB speelt een cruciale rol bij het handhaven van de homeostase van de hersenen en is bemiddeld door gespecialiseerde eigenschappen van endothelial hersencellen (BECs). De aanwezigheid van strakke intercellulaire kruispunten tussen BECs en een lage basale snelheid van transcytosis beperken de paracellular en transcellulair vervoer van bloed overgedragen moleculen, respectievelijk2. Onlangs, heeft het transcytosis traject in BECs zijn aangewend om te verbeteren van therapeutische grote moleculen naar de hersenen3,4. Echter zijn de mechanismen van transcytosis over de BBB nog niet volledig gekenmerkt5,6.
Uitgebreide werk verricht in vitro om te ontcijferen van de cellulaire en moleculaire mechanismen tot regeling van intracellulair transport over BECs7,8,9,10, 11, maar dergelijke systemen niet recapituleren de complexe architectuur en de Fysiologie van de neurovasculaire eenheid (NVU). Aan de andere kant, studies in vivo12,13 verstrekken gedetailleerde kwantitatieve informatie over vrachtprijzen over de BBB maar bieden geen inzicht in de intracellulaire mechanismen van vervoer. Onderzoek naar de cellulaire en intracellulaire componenten van de NVU blijft in vivo en ex vivo derhalve zeer uitdagend14. Slechts een beperkt aantal technieken zijn vatbaar voor het analyseren van subcellular structuren binnen cellen van de NVU. De meeste studies gebruik elektronenmicroscopie, maar deze techniek is beperkt door de complexe protocollen die nodig zijn voor goede weefsel voorbereiding en behandeling van het monster. Daarom we ingesteld een methode gebaseerd op hoge resolutie confocale microscopie die de verwerking van de monsters van de hersenen, de analyse en de kwantificering van subcellular compartimenten binnen cellen van de NVU vergemakkelijken zou.
Hier beschrijven we een protocol die gebruik maakt van de muis hersenen vrij zwevende secties voor het uitvoeren van kwantitatieve beeldvorming van de BBB en NVU de cellulaire en subcellular niveau. We geteste en gevalideerde een aantal antilichamen beeld te reconstrueren van de NVU in drie dimensies. Bovendien staat dit protocol beeldvorming bij de maximale optische resolutie van de diffractie-limited van organellen binnen de hersenen haarvaten. Samen met beeldanalyse, kan dit protocol worden gebruikt om te onderzoeken het intracellulair transport van macromoleculen in de BBB onder verschillende experimentele omstandigheden, bijvoorbeeld in muismodellen van de ziekte van neurodegeneratie.
Het hierboven beschreven protocol beschrijft de voorbereiding van de vrij zwevende secties van de hersenen, immunefluorescentie kleuring Beeldacquisitie en analyse gebruikte parameters voor hoge resolutie microscopie van de BBB. Deze methode is onlangs gebruikt om te onderzoeken van de lokalisatie van antilichaam levering platformen3, het vervoer van endogene IgG over de BBB-17en de heterogeniteit van de BBB op pericyte verlies18. Verschillende stappen in het protocol kunnen worden gewijzigd om aan te passen aan de specifieke doel van het experiment. Eerst, vergemakkelijkt het gebruik van dikke (100 µm) secties hun behandeling tijdens de procedures voor immunokleuring en montage. Het staat ook voor 3D reconstructie van het capillaire netwerk, de neurovasculaire eenheid, en voor de generatie van capillaire en NVU dwarsdoorsneden. Echter penetratie van antilichamen binnen de weefselsecties kan variëren en sommige antilichaam kleuring kan worden beperkt tot de oppervlakkige laag van het weefsel dicht bij het dekglaasje aan. Het protocol kan worden gewijzigd door verhoging van de concentratie van wasmiddel tijdens de stap van de permeabilization en/of de lengte van de permeabilization stap ter verbetering van antilichaam penetratie in het weefsel. Ten tweede kan beeldkwaliteit worden aangetast wanneer probeert te verwerven beelden dieper in het weefsel (meestal 20 tot 30 µm onder het oppervlak) wegens lichtverstrooiing evenals optische aberraties van brekingsindex wanverhouding. Om dit probleem te verhelpen, kunnen nieuwe methoden voor weefsel clearing en actieve antilichaam penetratie20 worden gecombineerd met dit protocol tot de grotere volumes afbeelding van weefsel. Ten derde, deconvolutie wordt uitgevoerd na Beeldacquisitie ter verbetering van de axiale resolutie van de afbeelding. De keuze van het algoritme van de blinde deconvolutie gebruikt in dit protocol was gebaseerd op (i) het gebruiksgemak, zoals geen voorafgaande berekening van de punt-spread functie vereist is, (ii) zijn robuustheid voor verbetering van de beeld kwaliteit21, en (iii) het ontbreken van artefacten op mIgG intracellulaire structuren na implementatie. Afhankelijk van de intracellulaire structuren gevisualiseerd in de steekproef, andere deconvolutie algoritmen kunnen leiden tot hogere beeldkwaliteit. De volgende verwijzingen21,22 bieden een uitgebreide discussie over de voordelen en beperkingen van aanvullende algoritmen voor afbeelding deconvolutie. Tot slot, het gebruik van de softwarepakket van een beeld-analyse toegestaan de segmentatie van haarvaten en intracellulaire structuren in drie dimensies. Duidelijk beeldanalyse is niet beperkt tot de software zoals beschreven in het protocol en de alternatieve pakketten, bijvoorbeeld die wordt besproken in referentie23, kan worden gebruikt om afbeeldingen van het segment. De geschiktheid van verschillende software programma’s voor de analyse van intracellulaire structuren in de BBB moet empirisch worden geverifieerd door de beoordeling van de juistheid van beeldsegmentatie.
Aangezien deze methode is gebaseerd op vaste monsters, biedt geen rechtstreekse informatie over de dynamiek van transcytosis over de BBB. Echter, het kan worden gecombineerd met tijdsverloop experimenten24, bijvoorbeeld door het intraveneus injecteren de molecule van belang en het meten van de accumulatie binnen BECs op verschillende tijdstippen na injectie, te reconstrueren de kinetiek van intracellulair transport. Het voordeel van deze aanpak is dat het mogelijk voor de analyse van diepe hersengebieden, maakt zoals in18, dat momenteel niet toegankelijk zijn voor intravital levende imaging benaderingen. Een belangrijke stap tijdens het protocol is de zorgvuldige controle van weefsel fixatie. Fixatie met 4% PFA drastisch vermindert de immunogeniciteit van intracellulaire organellen en endogene of ook door de overheid gereguleerde immunoglobulinen17 (figuur 1B). Een beperking van dit protocol is de eis van kwalitatief hoogwaardige antistoffen (d.w.z., lage niet-specifieke kleuring, lage Kruisallergie) geschikt voor immunofluorescentie. Mits dergelijke reagentia beschikbaar zijn, kan de methode kan worden toegepast om te onderzoeken de intracellulaire lokalisatie van een proteïne van belang. Bijvoorbeeld, is het protocol gebruikt voor het identificeren van lysosomen in hersenen endotheliale cellen17. Ook opgemerkt moet worden dat aangezien dit protocol is gebaseerd op confocale microscopie, de laterale resolutie wordt beperkt door diffractie en niet structuren kleiner is dan ongeveer 175 tot 250 oplossen nm (Figuur 2).
Eerdere studies hebben gedetailleerde analyse van de cellulaire samenstelling van de eenheid van de neurovasculaire met behulp van de confocal microscopie25,26uitgevoerd. Echter berust onderzoeken intracellulair transport op de BBB meestal op het gebruik van Transmissie Electronenmicroscopie19,27,28. Hoewel deze methode de hoogste laterale resolutie van intracellulaire structuren biedt, blijft elektronenmicroscopie een uitdagende techniek met lage doorvoersnelheid. Bovendien is het aantal verschillende moleculaire doelwitten die kunnen worden gevisualiseerd door EM is zeer beperkt. Dit protocol biedt een toegankelijke alternatief om te onderzoeken van intracellulair transport op de BBB. De volledige procedure, uit hersenen collectie aan beeldanalyse, kan worden uitgevoerd in 5 à 6 dagen. Als geschikt antilichamen beschikbaar zijn, kan immunofluorescentie simultane detectie van meerdere cel typen/moleculen binnen hetzelfde monster. Bovendien kan dit protocol worden gecombineerd met super resolutie microscopie technieken te overwinnen van de beperkingen in ruimtelijke resolutie29. Globaal, kunnen via het protocol zoals hierboven beschreven de kwantificering van veranderingen in de intracellulaire lokalisatie van proteïnen van belang binnen de neurovasculaire eenheid. De toepassing ervan voor verschillende genetische of farmacologische verstoringen zal toestaan de intracellulaire structuur en transport functies van de BBB in vivoonderzoeken.
The authors have nothing to disclose.
R.V. werk werd gesteund door een Roche Postdoctoral Fellowship (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |