Her presenterer vi en mikroskopi-basert protokoll for høy oppløsning bilder og en 3-dimensjonal modell av musen nevrovaskulære enhet og blod – hjerne barrieren bruker hjernen frittflytende deler. Denne metoden gjør det visualisering, analyse og kvantifisering av intracellulær organeller på BBB.
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk flercellet grensesnitt som regulerer transport av molekyler mellom sirkulasjonen og hjernen. Transcytosis over BBB regulerer levering av hormoner, metabolitter og terapeutiske antistoffer til hjernen parenchyma. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer immunofluorescence av frittflytende deler med laserskanning AC confocal mikroskopi og bildeanalyse å visualisere subcellular organeller innen endotelceller på BBB. Kombinere datasettet med 3D image analyseprogramvare gir halvautomatisk segmenteringen kvantifisering av kapillær volum og areal, samt antallet og intensiteten av intracellulær organeller på BBB. Gjenkjenning av musen endogene immunglobulin (IgG) intracellulær blemmer og kvantifisering på BBB brukes til å illustrere metoden. Denne protokollen kan potensielt brukes til granskingen av mekanismer som styrer BBB transcytosis av ulike molekyler i vivo.
Blod – hjerne barrieren (BBB) er en kontinuerlig mobilnettet barriere dannet av astrocyttene, pericytes, nerveceller og endotelceller som skiller sentralnervesystemet (CNS) fra blod sirkulasjon1. Regulering av transport over BBB spiller en avgjørende rolle i å opprettholde hjernen homeostase og er formidlet av spesialiserte egenskaper av hjernen endotelceller (BECs). Tilstedeværelse av tett intercellulære veikryss mellom BECs og en lav basale rate av transcytosis begrense paracellular og transcellular transport av blodbårne molekyler, henholdsvis2. Transcytosis veien i BECs har nylig blitt brukt til å forbedre levering av terapeutiske store molekyler til hjernen3,4. Men er mekanismer for transcytosis over BBB ennå ikke fullt preget5,6.
Omfattende arbeid har blitt gjort i vitro dechiffrere cellulære og molekylære mekanismer regulere intracellulær transport over BECs7,8,9,10, 11, men slike systemer ikke klarer å recapitulate komplekse arkitekturen og fysiologi av nevrovaskulære (NVU). På den annen side, studier i vivo12,13 gir detaljert kvantitativ informasjon om transport priser over BBB men gir ikke innsikt i intracellulær mekanismer for transport. Derfor fortsatt undersøke mobilnettet og intracellular komponentene i NVU i vivo og ex vivo svært utfordrende14. Bare et begrenset antall teknikker er mottagelig for å analysere subcellular strukturer i cellene i NVU. De fleste studier bruker elektronmikroskop, men denne teknikken er begrenset av komplekse protokollene som kreves for riktig vev forberedelse og prøve håndtering. Derfor etablerte vi en metode basert på høy oppløsning AC confocal mikroskopi som vil lette behandlingen av hjernen prøver, analyse og kvantifiseringen subcellular rom i celler av NVU.
Her beskriver vi en protokoll som benytter musen hjernen frittflytende inndelinger for å utføre kvantitativ bildebehandling av BBB og NVU på mobilnettet og subcellular. Vi testet og godkjent flere antistoffer mot image og rekonstruere NVU i tre dimensjoner. Videre kan denne protokollen imaging maksimal optisk Diffraksjon-begrenset oppløsning organeller i hjerne blodkar. Sammen med bildeanalyse, kan denne protokollen brukes til å undersøke intracellulær transport av makromolekyler over BBB under forskjellige eksperimentelle forhold, for eksempel i musen sykdom modeller av neurodegeneration.
Protokollen skissert ovenfor beskriver utarbeidelse av hjernen frittflytende deler, immunofluorescent flekker, bildeopptak og analyseparametrene for høy oppløsning mikroskopi av BBB. Denne metoden er brukt nylig å undersøke lokaliseringen av antistoff levering plattformer3, transport av endogene IgG over de BBB17og heterogenitet av BBB på pericyte tap18. Fremgangsmåten i protokollen kan endres for å tilpasse bestemte målet av eksperimentet. Først forenkler bruken av tykk (100 µm) deler deres behandling under immunostai- og montering prosedyrene. Det kan også for 3D rekonstruksjon av capillary nettverket, nevrovaskulære enheten, og for generering av kapillær og NVU tverrsnitt. Men penetrasjon av antistoffer i delene vev kan variere og noen antistoff flekker kan begrenses til overfladiske laget av vev nær dekkglassvæske. Protokollen kan endres ved å øke konsentrasjonen av vaskemiddel i permeabilization trinn og/eller lengden på permeabilization skritt for å forbedre antistoff gjennomtrengning i vevet. Andre bli bildekvaliteten skadet når du prøver å hente bilder dypere i vevet (vanligvis 20 til 30 µm under overflaten) på grunn av lysspredning samt optisk avvik fra brytningsindeks feil. Du løser dette problemet, kan nye metoder for vev clearing og aktive antistoff penetrasjon20 kombineres med denne protokollen for bildet større mengder vev. Tredje utføres deconvolution etter bildeopptak å forbedre aksial oppløsningen til bildet. Valg av blind deconvolution algoritmen som brukes i denne protokollen var basert på (i) dens lette av bruk, ingen før beregning av spilltilbud funksjonen er nødvendig, (ii) dens robustness for å forbedre bildet kvalitet21, og (iii) mangel på gjenstander på mIgG intracellulær strukturer etter implementering. Avhengig av intracellulær strukturene visualisert i utvalget, kan andre deconvolution algoritmer resultere i høyere bildekvalitet. De følgende referanser21,22 gir en omfattende diskusjon om fordeler og begrensninger av flere algoritmer for bildet deconvolution. Til slutt, bruk av en bildet analyse programvarepakke tillatt oppdeling av kapillærene og intracellulær strukturer i tre dimensjoner. Tydelig bildeanalyser er ikke begrenset til programvaren som beskrives i protokollen og alternative pakker, for eksempel de i referanse23, kan brukes til segmentet bilder. Hensiktsmessigheten av ulik programvare for analyse av intracellulær strukturer på tvers av BBB bør være bekreftet empirisk ved å vurdere nøyaktigheten av bildesegmentering.
Siden denne metoden er basert på faste prøver, gir den ikke direkte informasjon om dynamikken i transcytosis over BBB. Men kan det kombineres med tid-retters eksperimenter24, for eksempel ved intravenøst injisering molekylet rundt og måle opphopning i BECs på ulike tidspunkt etter injeksjon, å rekonstruere the kinetics av intracellulær transport. Fordelen med denne tilnærmingen er at det tillater for analyse av dypt hjernen regioner, som vist i18, som er foreløpig utilgjengelig for intravital live bildebehandling tilnærminger. En kritisk trinn i protokollen er nøye overvåking av vev fiksering. Fiksering med 4% PFA dramatisk reduserer immunogenisitet intracellulær organeller og endogene eller perifert administrert immunglobuliner17 (figur 1B). En begrensning av denne protokollen er dens krav av høy kvalitet antistoffer (dvs.lav uspesifisert flekker, lav kryssreaktivitet) egnet for immunofluorescence. Forutsatt at det finnes slike reagenser, kan metoden brukes for å undersøke den intracellulære lokaliseringen av eventuelle protein av interesse. For eksempel ble protokollen brukt til å identifisere lysosomer i hjernen endotelceller17. Det bør også bemerkes at siden denne protokollen er basert på AC confocal mikroskopi, lateral oppløsningen er begrenset av Diffraksjon og kan ikke løse strukturer mindre enn ca 175 til 250 nm (figur 2).
Tidligere studier har utført detaljert analyse av mobilnettet sammensetningen av nevrovaskulære bruker AC confocal mikroskopi25,26. Imidlertid avhengig undersøke intracellulær transport på BBB av bruken av overføring elektronmikroskop19,27,28. Mens denne metoden tilbyr den høyeste lateral oppløsningen av intracellulær strukturer, forblir elektronmikroskop en utfordrende teknikk med lav overføringshastighet. Videre er antall forskjellige molekylære mål som kan visualiseres EM svært begrenset. Denne protokollen tilbyr et tilgjengelig alternativ for å undersøke intracellulær transport på BBB. Den komplette prosedyren, fra hjernen samling bildet analyse, kan utføres i 5-6 dager. Hvis egnet antistoffer er tilgjengelige, kan immunofluorescence samtidige påvisning av flere cellen typer/molekyler innenfor samme prøven. Videre kan denne protokollen kombineres med super-oppløsning mikroskopi teknikker for å overvinne begrensningene i romlig oppløsning29. Samlet kan protokoll beskrevet ovenfor kvantifisering av endringer i den intracellulære lokaliseringen av proteiner av interesse i nevrovaskulære enheten. Sin søknad om forskjellige genetisk eller farmakologiske forstyrrelser kan undersøke intracellulær struktur og transport funksjonene av BBB i vivo.
The authors have nothing to disclose.
R.V. arbeid ble støttet av Roche doc. (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |