Aqui nós apresentamos um protocolo baseado em microscopia para imagens de alta resolução e uma reconstrução tridimensional do mouse unidade neurovascular e barreira hemato – encefálica usando seções flutuantes de cérebro. Este método permite a visualização, análise e quantificação das organelas intracelulares no BBB.
A barreira hemato – encefálica (BBB) é uma interface multicelular dinâmica que regula o transporte de moléculas entre o cérebro e a circulação. Transcytosis do outro lado do BBB regula a entrega de anticorpos terapêuticos, metabólitos e hormônios para o parênquima cerebral. Aqui, apresentamos um protocolo que combina imunofluorescência de seções flutuantes com laser de varredura, microscopia confocal e análise de imagem para visualizar as organelas subcelulares dentro das células endoteliais no BBB. Combinar este conjunto de dados com software de análise de imagem 3D permite a segmentação semi-automática e quantificação do volume capilar e área de superfície, bem como o número e intensidade das organelas intracelulares no BBB. A detecção de rato endógeno da imunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares e sua quantificação no BBB é usada para ilustrar o método. Este protocolo potencialmente pode ser aplicado para a investigação dos mecanismos de controlo BBB transcytosis de moléculas diferentes em vivo.
A barreira hemato – encefálica (BBB) é uma barreira celular contínua formada por astrócitos, pericitos, neurônios e células endoteliais que separa a circulação de sangue1sistema nervoso central (SNC). O Regulamento de transporte através do BBB desempenha um papel crucial na manutenção da homeostase do cérebro e é mediado por propriedades especializadas das células endoteliais do cérebro (BECs). A presença de junções intercelulares apertadas entre BECs e uma baixa taxa basal de transcytosis limitar o transporte paracellular e transcellular de moléculas transmitidas pelo sangue, respectivamente2. Recentemente, o caminho de transcytosis na BECs tem sido aproveitado para melhorar a sua prestação de terapêuticas grandes moléculas para o cérebro3,4. No entanto, os mecanismos de transcytosis através do BBB ainda não foram totalmente caracterizado5,6.
Extenso trabalho tem sido feito em vitro para decifrar os mecanismos celulares e moleculares que regulam o transporte intracelular através de BECs7,8,9,10, 11, mas esses sistemas não conseguem recapitular a complexa arquitetura e fisiologia da unidade neurovascular (NVU). Por outro lado, estudos em vivo12,13 fornecem informações quantitativas detalhadas sobre as taxas de transporte através do BBB mas não fornecer insights sobre os mecanismos intracelulares de transporte. Portanto, investigar os componentes celulares e intracelulares do NVU in vivo e ex vivo continua a ser muito desafiador14. Apenas um número limitado de técnicas é aptos para analisar estruturas subcelulares dentro de células do NVU. A maioria dos estudos usar microscopia eletrônica, mas esta técnica é limitada pelos protocolos complexos necessários para a preparação adequada de tecido e manuseio de amostras. Portanto, estabelecemos uma metodologia baseada na microscopia confocal de alta resolução que facilitasse o processamento das amostras de cérebro, a análise e a quantificação dos compartimentos subcellular dentro das células do NVU.
Aqui, descrevemos um protocolo que utiliza as seções flutuantes cérebro do rato para executar quantitativos de imagem do BBB e NVU a nível celular e subcelular. Temos testado e validado um número de anticorpos para imagem e reconstruir o NVU em três dimensões. Além disso, este protocolo permite imagens com a máxima resolução óptica de difração limitada das organelas dentro de capilares do cérebro. Juntamente com a análise de imagem, este protocolo pode ser usado para investigar o transporte intracelular de macromoléculas através do BBB sob diferentes condições experimentais, por exemplo, em modelos de doença de rato de neurodegeneração.
O protocolo descrito acima descreve a preparação das seções flutuantes de cérebro, coloração imunofluorescente, aquisição de imagem e parâmetros de análise para a microscopia de alta resolução do BBB. Este método tem sido usado recentemente para investigar a localização do anticorpo entrega plataformas3, o transporte de IgG endógena através do BBB,17e a heterogeneidade do BBB após Pericito perda18. Diferentes etapas do protocolo podem ser modificadas para adaptar-se ao objetivo específico do experimento. Primeiro, o uso de espessura (100 µm) seções facilita a sua manipulação durante os procedimentos de imunocoloração e montagem. Ele também permite a reconstrução 3D da rede capilar, a unidade neurovascular e para a geração de capilar e secções transversais NVU. No entanto, penetração de anticorpos dentro as secções de tecido pode variar e algumas mancha do anticorpo pode ser restrito à camada superficial do tecido perto da lamela. O protocolo pode ser modificado através do aumento da concentração de detergente durante a etapa de permeabilização e/ou o comprimento do passo permeabilização para melhorar a penetração do anticorpo no tecido. Em segundo lugar, a qualidade de imagem pode ser comprometida ao tentar adquirir imagens mais profundas dentro do tecido (geralmente de 20 a 30 µm abaixo da superfície), devido à dispersão da luz, bem como aberrações ópticas de incompatibilidade de índice de refração. Para superar este problema, novos métodos para tecido de compensação e de penetração de anticorpo ativo20 podem ser combinados com este protocolo de imagem maiores volumes de tecido. Em terceiro lugar, deconvolução é realizada após a aquisição de imagens para melhorar a resolução axial da imagem. A escolha do algoritmo de deconvolução cega usado neste protocolo baseou-se (i) a sua facilidade de uso, como sem pre-cálculo da função de ponto-propagação é necessária, (ii) a sua robustez para melhorar a qualidade de imagem21e (iii) a ausência de artefatos na mIgG estruturas intracelulares após a implementação. Dependendo das estruturas intracelulares visualizadas na amostra, outros algoritmos de deconvolução podem resultar em maior qualidade de imagem. As seguintes referências21,22 fornecem uma ampla discussão sobre as vantagens e limitações de algoritmos adicionais para deconvolução da imagem. Finalmente, o uso de um pacote de software de análise de imagem permitiu a segmentação de capilares e estruturas intracelulares em três dimensões. Claramente, análise de imagem não se restringe ao software descrito no protocolo e pacotes alternativos, por exemplo aqueles discutidos em referência23, pode ser usado para imagens de segmento. A adequação dos programas de software diferente para a análise das estruturas intracelulares através do BBB deve ser verificada empiricamente por avaliar a precisão da segmentação de imagens.
Desde que este método é baseado em amostras de fixas, ele não fornece informações directas sobre a dinâmica de transcytosis através do BBB. No entanto, pode ser combinada com as experiências do tempo-curso24, por exemplo por via intravenosa, injetando a molécula de interesse e medindo sua acumulação dentro BECs em pontos diferentes de tempo após a injeção, para reconstruir a cinética de transporte intracelular. A vantagem dessa abordagem é que ela permite a análise de regiões profundas do cérebro, como mostrado em18, que são atualmente inacessíveis para intravital abordagens de imagens ao vivo. Um passo crítico durante o protocolo é o monitoramento cuidadoso de fixação de tecidos. Fixação com 4% PFA reduz drasticamente a imunogenicidade de organelas intracelulares e de imunoglobulinas endógeno ou administrado perifericamente17 (figura 1B). Uma limitação do presente protocolo é sua exigência de qualidade anticorpos(ou seja, baixa mancha não específica, baixa reatividade cruzada) apropriados para imunofluorescência. Desde que tais reagentes estão disponíveis, o método pode ser aplicado para investigar a localização intracelular de qualquer proteína de interesse. Por exemplo, o protocolo foi usado para identificar os lisossomos no cérebro células endoteliais17. Também deve ser notado que, desde que este protocolo baseia-se na microscopia confocal, a resolução lateral é limitada pela difração e não é possível resolver estruturas menores que cerca de 175 a 250 nm (Figura 2).
Estudos anteriores têm realizado uma análise detalhada da composição celular da unidade neurovascular usando microscopia confocal25,26. No entanto, investigar transporte intracelular no BBB se baseia principalmente na utilização de microscopia eletrônica de transmissão19,,27,28. Enquanto esse método oferece a mais alta resolução lateral das estruturas intracelulares, microscopia eletrônica continua a ser uma técnica desafiadora com baixa taxa de transferência. Além disso, o número de diferentes alvos moleculares que podem ser visualizadas por EM é muito limitado. Este protocolo oferece uma alternativa acessível para investigar o transporte intracelular no BBB. O procedimento completo, da coleção do cérebro para análise de imagem, pode ser executado em 5 a 6 dias. Se os anticorpos apropriados estão disponíveis, imunofluorescência permite a detecção simultânea de vários tipos de célula/moléculas dentro da mesma amostra. Além disso, esse protocolo poderia ser combinado com técnicas de microscopia Super-resolução para superar as limitações na resolução espacial29. No geral, o protocolo descrito acima permite a quantificação de alterações a localização intracelular de proteínas de interesse dentro da unidade neurovascular. Sua aplicação para diferentes perturbações genéticas ou farmacológicas permitirá investigar as funções de estrutura e transporte intracelulares do BBB na vivo.
The authors have nothing to disclose.
R.V. trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos de pós-doutorado de Roche (2014-2017).
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |