Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56412
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 1
1Institute of Bioprocess and Biosystems Engineering, Hamburg University of Technology, 2Institute of Biotechnology, Department Medical Biotechnology, Technische Universität Berlin, 3TissUse GmbH

Summary

שיטה לקביעת חדירות קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב, סיליקו פרמטר אופטימיזציה עבור החישוב של מקדמים דיפוזיה באמצעות סימולציה מוצגים.

Abstract

במבחנה מגידולי העור מודלים הפכו יותר ויותר רלוונטי עבור יישומים התרופות, הקוסמטיקה, משמשים גם פיתוח תרופות, כמו גם חומר בדיקה. מודלים אלה בעיקר המטופחים במערכות ממברנה-הוספה, חדירות שלהם כלפי חומרים שונים להיות גורם חיוני. בדרך כלל, השיטות יישומית לקביעת פרמטרים אלה דורשות לרוב גדלי מדגם גדולים (למשל, פרנץ דיפוזיה תא) או ציוד מפרך (למשל, קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר photobleaching (FRAP)). מחקר זה מציג שיטה לקביעת מקדמי חדירות ישירות במערכות ממברנה-הוספה עם קוטר בגדלים של 4.26 מ"מ ו 12.2 מ"מ (טיפוח אזור). השיטה אומתה עם agarose, ג'לים קולגן, כמו גם מודל תא קולגן המייצג העור מודלים. התהליכים הסתננות של חומרים בגדלים שונים מולקולרית, הסתננות דרך מודלים תאים שונים (המורכב של קולגן ג'ל, פיברובלסט HaCaT) תוארו במדויק.

יתר על כן, כדי לתמוך בשיטה ניסויית שלעיל, הוקמה סימולציה. הסימולציה מתאים המידע מהניסוי היטב עבור חומרים עם גודל מולקולרי קטן, עד כדי 14 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (4,000 מגה-וואט), ולכן הוא כלי מבטיח כדי לתאר את המערכת. יתר על כן, הסימולציה יכול להפחית במידה ניכרת המאמצים ניסיוני, יציבה מספיק כדי להיות מורחב או סוגל setups מורכבים יותר.

Introduction

אורגניות טיפוסי תרבויות 3D הפכו כלים רבי-עוצמה עבור פיתוח תרופות, חומר בדיקה1. במובן זה, העור האנושי הדוגמניות עניין מיוחד עקב דרישות רגולטוריות, כגון אלה בתעשיית הקוסמטיקה. הם הובילו בהמשך פיתוח מודלים 3D עור רבים, לשימוש או על תרבויות יחיד-איבר משלהם כמו צלחות רב טוב, או מולטי-organ-צ'יפס בשילוב עם מודלים איברים נוספים, למשל, את הכבד2.

לגבי טיפוח של מקבילה העור, הממשק אוויר נוזלי (עלי) הוא מרכיב חיוני עבור נאות בידול באפידרמיס3. תא תרבות מוסיף המורכב כלי קיבול עם קרום חדיר נוזלים בתחתית משמשים בדרך כלל להקים של עלי. ALIs מנוצלים נרחב זמינים מסחרית העור דגמים כמו EpiDerm4, Phenion5ו – Episkin6, על התרבות של העור דגמים עם גדלים מ 96-ובכן (4.26 מ"מ קוטר) עד 12-טוב (12.2 מ"מ קוטר) צלחות. השיטה המתוארת כאן קובע את הסתננות של חומרים במערכת הוספה ממברנה.

המקדם חדירות הוא פרמטר משמעותי להערכת האיכות של כל עור-דגם בתרבית לעומת עור מקורי5, והוא משמש כדי להעריך כמה מהר חומרים פעילים להעביר דרך העור. במיוחד אם סמים או קוסמטיקה מוצרי צריך להיות מוחל על העור, פרמטר זה חיוני להבין מתי בדיוק סוכנים פעילים עוברים. הדמיה נוספות יכול לעזור לחזות את אופן הפעולה של המערכת, לאחר מכן להפחית את המאמץ הדרוש ניסיוני גוזלת זמן, במיוחד כאשר קבוצה גדולה של חומרים מעורב.

התא דיפוזיה פרנץ היא המדינה-of-the-art הסתננות ניסויים עם העור, העור מודלים5,6,7,8,9. מכשיר זה כולל שני תאים עם מדגם קבוע (מחסום דיפוזיה) בין לבין. החומר להיבדק מוחל ישירות לחלק העליון של המדגם (התורם תא), הריכוז של המתחם חודרני ניתן להבחין ב התא הנגדי (מקבל). בצד מקבל, טמפרטורה קבועה וריכוז חומר הומוגני מובטחים דרך תא טמפרטורה של פגים. ניתן לקחת דגימות של זרוע דגימה בצד מקבל התא פרנץ. עם מגוון גובה 19 ס"מ בין 179 ס מ, מערכת זו היא גדולה יחסית10,11. שיטה נוספת לקביעת מקדמי דיפוזיה של חומרים דמוי ג'ל ורקמות היא FRAP. שיטה זו משתמשת העיקרון של הלבנת fluorescently שכותרתו חלקיקי הג'ל, ואז לקבוע את זמן ההחלמה של האזור מולבן לחישוב13,1412,מקדם דיפוזיה.

יתר על כן, ספקטרוסקופיית פורייה-המרה-תת-אדום (FTIR) ניתן להשתמש כדי לזהות תנועה של חלקיקים עם ספיגת האור האינפרא-אדום על מנת לקבוע את תהליך הסתננות של חומרים לעור15,16. עם זאת, אלה או שיטות הדמיה אחרות (למשל, שני הפוטונים פלורסצנטיות המתאם ספקטרוסקופיה17) צריך לעלות מכשירים אינטנסיבית.

במאמר זה, שיטה מוצג ישירות מודדים את החדירות של מחסום בתוך מערכת הוספה ממברנה, איפה מודל העור יכול להיות מעובד. שיטה זו מאפשרת חדירות ניסויים כדי לפעול עם מספר רב של דוגמאות קטנות (טוב גודל למעלה מ"מ 4.26) עוד מערכת קומפקטית. זאת בניגוד פרנץ דיפוזיה התא, איפה מכשיר נפרד נדרש עבור כל בדיקה, אשר חייב להיות מותקן על המכשיר קשה להבין עבור מדגמים קטנים (גודל של 4.26 מ מ). יתר על כן, מאז השיטה אינה דורשת מכשור הגדולות (למשל, מיקרוסקופ קונפוקלי או multiphoton), צמצום זמן ועלות מושגת.

כל הניסויים בוצעו ב נקבובי ממברנה להוסיף מערכות עם דגימה (מכשול) המורכב agarose ג'ל או מודל תא קולגן נוסדה בהקרום. חומרים פלורסנט (תורם) עם משתנה גדלים מולקולרית יושמו לחלק העליון של המדגם, הריכוז של חומר חילחלו זוהה בתחתית (מקבל) שימוש בקורא צלחת קרינה פלואורסצנטית (ראה איור 1). על מנת לאמת את שיטת ולבדוק את הדיוק של סימולציה זה, ג'לים agarose היו המיוצר, משמש כמחסום. Hydrogels משמשים בדרך כלל עבור החקירה של תהליכי דיפוזיה, הסתננות במדיום נקבובי ביולוגיים.13. השיטה נבחנה אז נזרע תא מערכת המורכבת קולגן מטריצה של fibroblasts ראשי ו למבוגרים נמוך סידן גבוהה טמפרטורה keratinocytes (HaCaT) תאים אנושיים (מטריצה תא מודל), אשר עור מפושטת דגם18,19 .

בנוסף, תהליך הסתננות היה מדומה בעזרת סימולציות זרימה עם חישובית דינמיקה של נוזלים. נמצא כי, על-ידי הפרמטר אופטימיזציה, מקדם דיפוזיה יכול לחשב מתוך המידע מהניסוי. באופן כללי, סימולציה זה מציעה יישומים שונים; למשל, ניתן לחזות תהליך הסתננות המבוסס על ניסויים קצר, הסימולציה להפחית באופן משמעותי את מספר ניסויים.

השיטה הניסיונית וסימולציות תוכננו עבור היישום מערכת איברים-על-שבב1,20,21,1,22, פותחה במיוחד 2 האיברים-צ'יפס-(2-OC) 23,24,25. בעקרון, ניתן לתאר את תהליך הסתננות של כל דגם אורגן המבוסס על רפידה הוספה מערכות בדרך זו.

Protocol

1. מכינים את המדגם ללימודי חדירות

הערה: על מנת לוודא הסתננות מדידות וסימולציות, מדגם המורכב agarose ג'ל או מודל מטריקס תא המבוסס על הטיפוח-תרגול של המודל העור שימש.

  1. Agarose ג'ל
    1. להמיס 0.2 גר' אבקת agarose ברזולוציה גבוהה ב- 10 מ"ל של H2O (מים מזוקק פעמיים).
    2. לערבב את הפתרון, אחמם את זה עד 80 ° C. לשמור על הטמפרטורה במשך 8 דקות.
    3. למרוח ג'ל agarose µL 28.6 הקרום של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה (4.26 מ"מ קוטר) או שימוש 226 µL על קרום טוב 12 להוסיף מערכת (12 מ"מ קוטר) (למשל, מערכת Transwell).
    4. לחכות 10 דקות הג'ל הוא פני השטח למוצק.
  2. ג'ל קולגן
    הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים סטריליים, הפתרונות נשמרים בקירור כדי להאט את פלמור של הג'ל קולגן.
    1. מערבבים 125 µL של מאוזנת מלח פתרון (HBSS הנקס) עם 1 מ"ל של 0.4% קולגן R פתרון (עכבר זנב קולגן).
    2. Titrate הפתרון עם NaOH M 1 (סודיום הידרוקסיד) (~ 6 µL) עד לצבע של פנול אדום משתנה מצהוב לאדום.
    3. להוסיף הג'ל קולגן µL 125 של Dulbecco בינוני נשר שונה (DMEM) + 10% עגל עוברית סרום (FCS) ומערבבים בזהירות עם טיפ פיפטה.
    4. 28.6 µL של קולגן ג'ל חלות על הקרום של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה או µL 226 עבור מערכת הוספה הממברנה 12-. טוב.
    5. השארתי את הג'ל בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות.
  3. קולגן תאים דגם עם פיברובלסט
    הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים סטריליים.
    1. להכין fibroblasts ראשי 5-7 ימים לפני הניסוי. לטפח את fibroblasts עם DMEM + 10% FCS ב תא תרבות מבחנות (75 ס מ2) ושנה את המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: ההגדרה ניסיוני, מספר גדול יותר של תאים יכולים לשמש בהתאם.
    2. להסיר את המדיום של הבקבוק התרבות התא (80% confluent), לשטוף פעמיים עם 10 מ"ל (תרבות הבקבוק 75 ס מ2) תמיסת פוספט buffered (PBS). להוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) דגירה למשך 3 דקות ב 37 º C.
    3. הקש בעדינות על הבקבוק תרבות כדי לנתק את התאים מפני השטח. לעצור את התגובה על ידי הוספת 3 מ"ל של DMEM + 10% FCS. להעביר את הפתרון לתוך שפופרת צנטרפוגה.
    4. Centrifuge התליה תא ב 120 x g, הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים 0.5 מ של DMEM + 10% FCS.
    5. לספור את התאים ולהתאים את ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל.
      הערה: השלבים הבאים מתבצעות על קרח כדי להאט את פלמור של הג'ל קולגן.
    6. מערבבים 125 µL של HBSS עם 1 מ"ל של 0.4% קולגן R פתרון.
    7. Titrate הפתרון עם 1 M NaOH (~ 6 µL) עד לצבע של פנול אדום משתנה מצהוב לאדום.
    8. להוסיף µL 125 של השעיה תא (DMEM + FCS 10% + 0.5 x 106 תאים למ"ל) לתוך הקולגן ג'ל ומערבבים היטב עם פיפטה.
    9. החל µL 28.6 של קולגן ג'ל על הקרום של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה או µL 226 עבור מערכת הוספה הממברנה 12-. טוב.
    10. השארתי את הג'ל בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות.
    11. החל µL 75 DMEM + 10% FCS על פני ג'ל ולהוסיף 300 µL לצלחת מקלט של קרום 96-ובכן המערכת. קרום 12-טוב להוסיף מערכת, השתמש נפח של 590 µL על µL פני השטח של 1,846 לצלחת המקלט.
    12. הסר את המדיום מפני השטח של דגם מטריקס תא (אוויר המעלית), תקופת דגירה דגם מטריקס תא נוסף של 7 ימים. השתמש בינוני μl 100 בתחתית ושנה המדיום כל יום.
  4. קולגן תאים דגם עם HaCaT
    הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים סטריליים.
    1. להכין את HaCaT 5-7 ימים לפני השלבים הבאים. לטפח את HaCaT עם DMEM + 5% FCS בבקבוקון התרבות התא (75 מ מ2) ושנה את המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: ההגדרה ניסיוני, מספר גדול יותר של תאים יכולים לשמש בהתאם.
    2. להסיר את בינוני הבקבוק ולשטוף פעמיים עם 10 מ"ל (תרבות הבקבוק 75 ס מ2) ל- PBS. להוסיף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA דגירה 10 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה עם 3 מ"ל של DMEM + 10% FCS. להעביר את הפתרון לתוך שפופרת צנטרפוגה.
    3. Centrifuge התליה תא ב 120 x g, הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים 0.5 מ של DMEM + 10% FCS.
    4. לספור את התאים ולהתאים את ריכוז של 0.5 x 106 תאים למ"ל.
      הערה: השלבים הבאים מתבצעות על קרח כדי להאט את פלמור של הג'ל קולגן.
    5. מערבבים 125 µL של HBSS עם 1 מ"ל של 0.4% קולגן R פתרון.
    6. Titrate הפתרון עם 1 M NaOH (~ 6 µL) עד לצבע של פנול אדום משתנה מצהוב לאדום.
    7. להוסיף µL 125 DMEM + 10% FCS הג'ל קולגן, לערבב היטב עם פיפטה.
    8. החל µL 28.6 תא השעיה על הקרום של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה או µL 226 עבור מערכת הוספה הממברנה 12-. טוב.
    9. השארתי את הג'ל בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות.
    10. החל µL 75 של השעיה תא השטח ג'ל ולהוסיף 300 µL של DMEM + 10% FCS לצלחת מקלט של קרום 96-ובכן להוסיף מערכת. קרום 12-טוב להוסיף מערכת, השתמש נפח של 590 התליה תא µL על µL פני השטח של 1,846 DMEM + 10% FCS לצלחת המקלט.
    11. תקופת דגירה דגם מטריקס תא של 3 ימים; חילופי המדיום לאחר יומיים.
    12. להסיר את המדיום של פני השטח של דגם מטריקס תא, דגירה דגם מטריקס תא 7 ליום נוסף. השתמש בינוני µl 100 בתחתית ושנה המדיום כל יום.
  5. קולגן דגם תא עם fibroblasts, HaCaT
    הערה: כל הפעולות מבוצעות בתנאים סטריליים על קרח כדי להאט את פלמור של הג'ל קולגן. להכין את fibroblasts כפי שמתואר בשלב 1.3 עד שלב 1.3.5 והכן יום מאוחר יותר HaCaT כפי שמתואר צעד 1.4 עד שלב 1.4.4.
    1. מערבבים 125 µL של HBSS ב 1 מ"ל של 0.4% קולגן R פתרון.
    2. לנטרל את הפתרון עם 1 M NaOH (~ 6 µL) עד לצבע של פנול אדום משתנה מצהוב סיגלית אדום.
    3. להוסיף µL 125 של פיברובלסט ראשי תא השעיה המורכב DMEM + FCS 10% + 0.5 x 106 תאים למ"ל כדי הקולגן ג'ל ומערבבים היטב.
    4. 28.6 µL תא השעיה חלות על הקרום של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה או µL 226 עבור מערכת הוספה הממברנה 12-. טוב.
    5. השארתי את הג'ל בתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2) למשך 30 דקות.
    6. לאחר מכן, החל µL 75 של DMEM + 10% FCS על פני ג'ל ו- 300 µL על הלוח מקלט של קרום 96-ובכן להוסיף מערכת. קרום 12-טוב להוסיף מערכת, נפח של 590 µL משמש µL פני השטח של 1,846 לצלחת המקלט.
    7. תקופת דגירה של 1 יום-CO 37 ° C ו-5%2.
    8. להסיר את המדיום מהמשטח ולהוסיף השעיה תא HaCaT עם 0.5 x 106 תאים למ"ל. אמצעי האחסון נמצא אותו כפי שמתואר לפני תחת שלב 1.5.6.
    9. תקופת דגירה דגם מטריקס תא של 3 ימים; חילופי המדיום לאחר יומיים.
    10. להסיר את המדיום של פני השטח של דגם מטריקס תא, דגירה דגם מטריקס תא 7 ליום נוסף. השתמש בינוני µl 100 בתחתית ושנה המדיום כל יום.
      הערה: לחקירה הזאת, 3 דגימות ג'ל/תא-דגם הוכנו עבור מערכת הוספה הממברנה 12-. טוב. קרום 96-ובכן להוסיף מערכת, השתמשנו בדגימות 6 עבור דגם תא ג'ל. באמצעים סטטיסטיים, 3 דגימות נפוצים. אבל על הניסויים במערכת הוספה 96-ובכן ממברנה קולגן מטריקס מודל ציפינו כשלים, סטיות עבור התרבות תאים. לכן, בחרנו מספר גדול יותר של דוגמאות.

2. חדירות מחקרים ממברנה להוסיף מערכת

  1. חומר התורם
    הערה: מלחי נתרן fluorescein שני (NaFl) מיוצרים.
    1. להמיס NaFl H2O-ריכוז של 0.1 mg/mL ו- 0.01 מ"ג/מ"ל. Fluorescein שונה isothiocyanate-dextranes (FD) עם משקל מולקולרי של 4,000 10,000, 20,000, 40,000 g/mol הם מומס H2O-ריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. שימוש פתרונות אלה תורם חומר עבור הניסויים חדירות (ראה איור 1) עם ג'ל agarose.
    2. עבור ההתקנה עם המודל תא קולגן, להכין את כל הפתרונות עם DMEM + 10% FCS במקום מים.
      הערה: להכין מלאי פתרונות (10 x ריכוז גבוה יותר) של החומר התורם. וריאציות קטנות של ריכוז התורם יכול להשפיע על תוצאות הניסוי חדירות.
  2. השיטה הניסיונית
    הערה: הניסוי חדירות תבוצע ב 37 ° C ולחות של > 90%. פרמטר זה מבטיח את הכדאיות של התאים. טמפרטורה משפיעה על תהליך דיפוזיה אז באותם הפרמטרים משמשים את הניסויים עם ג'ל agarose, ג'ל קולגן, דגם תא קולגן. נפח המידע שבמסגרת מתייחס למערכת הוספה הממברנה 12-. טוב.
    1. להכין קרום טוב 96 - (או 12-.) הוספה מערכת עם מחסום המורכב agarose ג'ל (ראה פרוטוקול 1.1) או תאים דגם (ראה פרוטוקול 1.2-1.5) את החומר התורם זריחה.
    2. להכין דילולים של 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 ו- 1:320 של החומר תורם לגיבוש עיקול רגיל. פיפטה 300 µL (1,846 µL) של כל דילול בבארות שלושה של צלחת מקלט. קרום 12-טוב להוסיף מערכת לשימוש צלחת נפרדת מקלט. טורי דילולים משמשים כדי להמיר את קרינה פלואורסצנטית נמדד [RFU] ריכוז המקביל [מ"ג/מ"ל].
    3. להוסיף µL 75 (590 µL) של התורם חומר על המדגם (agarose ג'ל או תא-מודל) ו- 300 µL (1,846 µL) של חומר מקבל (H2O או DMEM + 10% FCS) בצלחת מקלט (ראה איור 1).
      הערה: ודא כי פני השטח של הנוזל בתוך הקרומית להוסיף מערכת ויש בצלחת מקלט באותה רמה כדי למנוע לחץ הידרוסטטי.
    4. להעביר את המערכת כולה על גבי מטרף בחממה. להתאים ברעידות להשגת ערבוב הומוגנית (מסלול קו הכולל הוא 1.5 מ מ, מהירות מותאם ברמה 3.5, אשר קשורה סיבוב של ~ 1 480/min) כדי למנוע מעבר הדרגתי ריכוז, אשר משפיע על תהליך דיפוזיה.
    5. לקבוע פלורסצנטיות מעת לעת בכל שעה. כדי למדוד את פלורסצנטיות, להעביר את המערכת הוספה של קרום לתוך צלחת ריקה ולמדוד את פלורסצנטיות בתוך המקלט שימוש בקורא צלחת. השימוש של עירור גל של 485 nm פליטה של 535 nm עבור fluorescein.
    6. הפעל את הניסוי עבור 5 שעות.
      הערה: במהלך הניסויים, הנוזל מתאדה מן המערכת כולה. האידוי משתנה ריכוז התורם, מקבל ומשפיע על התוצאות. אפקט זה מוזנח במקרה של זמן ריצה של 5 שעות, אבל משכי זמן ארוכים יותר פועל שזה יש לקחת בחשבון.
  3. חישוב המקדם חדירות
    1. כדי ליצור את עקומת סטנדרטי, להתוות את זריחה של דילולים טורי לעומת ריכוז ולבצע רגרסיה ליניארית בנתונים.
    2. השתמש את השיפוע של רגרסיה ליניארית להמרת נתוני קרינה פלואורסצנטית הניסוי הסתננות של ריכוז. לצורך ההדמיה, להמיר יחידות mol/m3.
    3. להתוות את הריכוז כפונקציה לאורך זמן ולהקים על קטע ליניארי של הנתונים (ראה איור 2).
    4. לקבוע את השיפוע של החלק הליניארי הזה ולחשב את מקדם חדירות לפי המשוואה הבאה (ראה הדוגמה באיור2):
      Equation 1
      איפה dcA/ dt הוא השינוי של הריכוז של החומר בתוך הצד מקבל לאורך זמן (המדרון); CD הוא הריכוז בצד התורם; P הוא המקדם חדירות; A הוא השטח הסתננות, VA היא הנפח של מקבל. המשוואה הזו נגזרת של Fick החוק הראשון, ניתן להחיל רק כאשר CD » CA6,22.
    5. הערה: ריכוז, התורם חייב להיות הרבה יותר גבוה מאשר הריכוז זוהה מקבל. זה אומתה בכיוונון ניסיוני.

3. הדמיה

הערה: ההדמיה נעשתה עם COMSOL Multiphysics 5.1. ההנחה היא ידע בסיסי זה. את הסימולציה דיפוזיה, נעשים על ההנחות הבאות: (א) מקדם דיפוזיה של חומרים H2O הוא גבוה בהרבה לעומת הג'ל. כדי לפצות על ההבדל הזה, הסימולציה משתמש ערך של 1 x 10-9 מ'2/s אשר גבוה לפי פקטור של 10 עד 100 לעומת ערך מקדם דיפוזיה NaFl דרך 2% agarose ג'ל. (ב) בשנת הניסוי, החומר מפזרת דרך המחסום ולאחר מכן דרך הקרום של הקרום להכניס מערכת. בניגוד הגדרת הניסוי, מטריקס ג'ל או תא agarose וירטואלי של קרום נחשבים שלב הומוגני אחד. (ג) גבול אפקטים על קירות מוגדרות כ- "אין"תלוש, כל השפעה הגולשות על קירות (בין של נוזלים, ג'ל או נוזל התא מודל) של מערכת הוספה ממברנה מוזנחים ואינם משמעותיים בתהליך דיפוזיה.

  1. כיוונון של הסימולציה דיפוזיה
    הערה: השלבים הבאים מדגימים את ההתקנה של הסימולציה של הניסוי חדירות. הסימולציות למערכות הוספה ממברנה 96 - ו 12-ובכן היו להגדיר בנפרד. המודול "תעבורה מינים כימי" משתמשת במשוואה בהתבסס על החוק השני של Fick של דיפוזיה:
    Equation 9
    כאשר c הוא הריכוז של החומר, t הוא הזמן, u היא מהירות, D הוא מקדם דיפוזיה ו R הוא בין קצב התגובה. בין קצב התגובה שהוזנח כי אין תגובה כימית התרחשה בתהליך דיפוזיה.
    1. פתח את התוכנית ולהתחיל מודל חדש. בחרה "מודל"הקוסם, בחר 3D דגם, להוסיף "תחבורה מדולל המינים" פיזיקה ממשק בתפריט הנפתח, לחץ על "מחקר", בחר המחקר "זמן התלוי" ולאחר ללחוץ על "סיים".
    2. ללכת להגדרות"גלובל" ולהוסיף "פרמטרים" עם קליק ימני. הזן את הפרמטרים גיאומטרי ופיזית ברשת (ראה טבלה 1 בטבלה 2, איור 3e).
      הערה: השטח קעורה של הג'ל agarose במערכת הוספה ממברנה 96-ובכן היה בקירוב עם כדור טבילה.
    3. הגדר הגיאומטריה של הקרום להוסיף מערכת הניסויים. ב- 3.2 שלב, מוצגת דוגמה של איך לבנות את הגיאומטריה של מערכת הוספה ממברנה 96-ובכן. יחידת אורך מוגדר כדי מטר.
      הערה: אל תבנה את הגיאומטריה שלם כדי לחסוך זמן חישוב. במקום זאת, ניתן להפחית את הגיאומטריה באמצעות מרכז שורות של רבע של הגיאומטריה (ראה איור 3a ו- 3b איור).
    4. להוסיף שני "תחום רגשים" ב- "הגדרות" (מימין לחץ על "הגדרות" ואתר "בדיקה") ובחר רגש אחד בתור התחום מקבל והשני בתור התחום התורם. לבחור עבור שניהם מסוג "ממוצע", הביטוי "c" עם יחידת "מול/m3".
      הערה: שלב זה הוא אופציונלי והוא מראה את הריכוז של מקבל, התורם במהלך הסימולציה.
    5. להגדיר את מקדם דיפוזיה (Dc) "תחבורה נכסים 1" "הובלה של מינים Diluted"בשם "Dif_w".
      הערה: "תחבורה מאפיינים 1" משמש עבור תחום מקבל וגם תורם. בשלב הבא, יוחלף התחום מכשול.
    6. להוסיף לחיצה "תחבורה מאפיינים 2" עם הזכות השני על "תחבורה מדולל המינים" ובחר את המחסום (2) בבחירה"תחום". בהתאם מטרת הסימולציה ניתן להגדיר את מקדם דיפוזיה כערך של המכשול או כמשתנה דמה "D". ההפעלה הבדיקה הראשונה, להגדיר ערך של /s22E-10 מ'.
      הערה: "D" יוכרז בהמשך שלב 3.3.
    7. ב- "תחבורה מדולל המינים" עבור "הראשונית הערכים 1" מגדירים את הריכוז כאפס.
      הערה: "ערכים הראשונית 1" משמש מחסום מקבל דומיין. בשלב הבא, יוחלף התחום התורם.
    8. להוסיף לחיצה "הראשונית ערכים 2" עם הזכות השני על "תחבורה מדולל המינים" ובחר את התורם (3) בתור התחום. הגדר את הריכוז הריכוז ההתחלתי של החומר התורם (למשל, C_fl טבלה 2).
    9. הוספת "סימטריה 1" עם קליק ימני על "תחבורה מדולל המינים", להוסיף ולבחור כל המשטחים של "הבחירה גבול", אשר מראה את כל הגיאומטריה (למשל גאומטריה בשלב 3.2, זה הגבול מספר 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      הערה: נקודה זו יכולה להיות מוזנחים אם כל הגיאומטריה הוגדר.
    10. קליק ימני על "רשת" להוסיף שני "חינם Tetrahedral". בחר את המחסום (2) בתור התחום (שינוי רמת ישות גאומטרית לתוך "תחום"). להוסיף "גודל" עם קליק ימני על "1" Tetrahedral חינם עבור הרשת המוגדרות מראש "עדינה" עבור קרום 12-טוב להוסיף מערכת או המערכת להוסיף "תוספת בסדר" בשביל קרום 96-ובכן.
    11. בתוך השני "חינם Tetrahedral" בחר את מקבל התורם כמו תחום, רשת השינוי מראש "רגילים" עבור קרום 12-ובכן להוסיף מערכת או "עדינה" עבור קרום 96-ובכן להוסיף מערכת (ראה איור 3 c ו- 3d איור).
      הערה: זה גם אפשר לבחור רשת מזו כדי לחסוך זמן חישוב. דבר זה עשוי להפחית את הדיוק של התוצאות. לחץ על "לבנות כל" ב- "רשת שינוי ההגדרה" כדי רשת שינוי הצורה הגיאומטרית.
    12. להתחיל את הסימולציה עם "מחשוב" "ללמוד 1".
  2. דוגמה ההתקנה עבור הגיאומטריה
    הערה: כאן דוגמא נתונה של כיצד להגדיר את הגיאומטריה של מערכת הוספה 96-ובכן ממברנה (עם מחסום קעורה). כל השלבים מתבצעות במודול הגיאומטריה של התוכנית. יחידת אורך מוגדר כדי מטר.
    1. ליצור גליל 1 (קליק ימני על "גיאומטריה 1") עם רדיוס של d_w/2 וגובה של h_sp + h_b + h_a.
    2. ליצור גליל 2 עם רדיוס של d_tran/2, גובה של המיקום h_b + h_a, ו- z של h_sp.
    3. השתמש באפשרות "הבדל" (לחץ לחיצה ימנית על "גיאומטריה 1", אתר "משתנים בוליאניים Partition") כדי לחסר גליל 2 מגליל 1. בחרו "cyl1" ב- "בעצמים שברצונכם להוסיף," להפעיל "אובייקט כדי לחסר" ובחרת "cyl2". אמצעי האחסון החדש הוא הצורה הגיאומטרית של מקבל.
    4. ליצור גליל 3 עם רדיוס של d_a/2, בגובה של h_b, ואת מיקום z h_sp.
    5. ליצור כדור 1 עם רדיוס r ו- z עמדה r_z.
    6. השתמש באפשרות "הבדל" כדי לחסר את הספרה 1 (sph1) מגליל 3 (cyl3). אמצעי האחסון החדש נקרא משנה 2.
    7. ליצור גליל 4 עם רדיוס של d_a/2, בגובה של h_b + h_a, והצב z של h_sp.
    8. השתמש באפשרות "הבדל" כדי לחסר גליל 4 (cyl4) 2 הפרש. אמצעי האחסון החדש הוא הצורה הגיאומטרית של מקבל.
    9. חזור על צעדים 3.2.4-3.2.6 לצורך הקמת המכשול (agarose ג'ל או תא המודל בניסוי).
    10. לכרות ברית 1 בכל האלמנטים גיאומטריה (לחץ על "גיאומטריה 1", אתר "משתנים בוליאניים Partition" מימין).
    11. ליצור בלוק 1 עם כל הקצוות מוגדר באורך של d_tran * 2, מיקום x של - d_tran ו- y של d_tran * 2.
    12. ליצור בלוק 2 עם כל אורך הקצה של d_tran * 2, מיקום x של - d_tran * 2 ו- y של - d_tran.
    13. השתמש באפשרות "הבדל" לחסר האיחוד 1 בבלוק 1 ולחסום 2.
  3. הוספת פרמטר אופטימיזציה הסימולציה
    הערה: עם העזרה של פרמטר אופטימיזציה מקדם דיפוזיה יכול להיות מצויד בנתונים ניסיוני שנוצר קודם לכן. ההוראות שלהלן מראים כיצד לשלב את החלק אופטימיזציה הסימולציה דיפוזיה. ודא שהסימולציה דיפוזיה עובד לפני שמתחילים את השלבים הבאים.
    1. הוסף את הפיזיקה-מודול "אופטימיזציה" באמצעות "הוספת Physic" (אופטימיזציה ניתן למצוא ב "מתמטיקה" בקטגוריה "אופטימיזציה ורגישות") כדי הסימולציה. לחץ על "הוסף רכיב".
    2. להוסיף "משתנים" עם קליק ימני תחת "הגדרות" (מקומית ברכיב) ולהקליד המשתנים בלוח3.
      הערה: אופטימיזציה פרמטר משתמשת מספרים ממשיים, כלומר, הפקטור 1-10 מקדם דיפוזיה של עליך להגדיר בנפרד.
    3. להוסיף "ממוצע 1" עם קליק ימני על "הגדרות" סעיף "רכיב צימוד" והקלד את שם המפעיל "מקבל".
    4. צור מסמך טקסט נפרד המכיל את נתוני הניסוי.
      הערה: נקודה-פסיק מפריד בין עמודות; מעבר שורה מפריד בין השורות. הצהרת הזמן נמדד בשניות, ריכוז mol/m3. להסיר את הראשון ואת נקודת נתונים השני בשלב לג (ראה איור 2) הניסויים כדי למנוע שגיאות התאמה אפשרית. הנה דוגמא כיצד מסמך טקסט עשוי להיראות כמו:
      3540;      0.00216
      7140;      0.00724
      12240;    0.01707
      15180;    0.02230
      18660;    0.02697
      21540;    0.02931
      דוגמה זו ניתן לבחון את הסימולציה.
    5. להוסיף "גלובל ריבועים" אובייקטיבית"עם קליק ימני על"אופטימיזציה", לצרף מסמך טקסט משלב 3.3.4 לנתונים" ניסיוני"ולהגדיר את העמודה הראשונה כמו" עמודת שעה 1" עם הזכות לחץ על"גלובל ריבועים "אובייקטיבית" והעמודה השניה כמו "ערך עמודה 1" עם לחץ לחיצה ימנית על "גלובל ריבועים"אובייקטיבית". בתוך "הביטוי" של "ערך העמודה" הקלד את המשתנה "C".
    6. להוסיף "בקרת משתנים גלובליים 1" עם קליק ימני על "אופטימיזציה" ולהכריז "D_search" כמשתנה עם הערך הראשוני "1", התחתונה מאוגד "0", חסם עליון "אלף".
    7. להוסיף "אופטימיזציה" עם קליק ימני על "ללמוד 1" ובחרת באפשרות "SNOPT" כמו שיטת solver אופטימיזציה. הגדר את optimality סובלנות 1E-9.
      הערה: אם הסימולציה מתכנסת, להגדיל את עמידות optimality. זכור כי הסימולציה לא יהיה מדויק אם הסובלנות optimality גדול מדי.
    8. להתחיל אופטימיזציה פרמטר עם "מחשוב" "לימוד". אל תשכח להגדיר את מקדם דיפוזיה מכשול כמו "D".

Representative Results

ניסויים חדירות קרום 96-ובכן להוסיף מערכת עם ג'ל agarose 2% כמו מחסום נערכו על מנת להעריך את הדיוק של סימולציה. Fluorescein נתרן מלח (NaFl) fluorescein isothiocyanate-dextranes (FD) שימשו כדי לאמת את ההשפעה של גודל מולקולרי של החומר באמצעי מ 5 10x-10 מ' למעלה כדי 45 x 10-10 מ' סטוקס רדיוס (376.27 40,000 mol wt). פרמטר יליד אופטימיזציה הסימולציה שימש כדי להתאים את הסימולציה נתונים ניסיוני.

לשם כך, מדרונות רק החלקים ליניארי של החדירות מדומה הושוו לתוצאות הניסוי. עבור גודל מולקולרי קטן, סימולציה נתוני הניסוי היו בהסכם טוב עם 99.2% עבור NaFl ו 80.2% עבור FD 4,000 (ראה איור 4a , 4b יבינו). גודל מולקולרי גדול שנוצר סטיות גבוהה מציג מתאמים של 50.5% עבור FD 10,000, 79.7% עבור FD 20,000 ו- 53.6% עבור FD 40,000. התקדמות עקומה הסימולציות הראו עיכוב בתחילתה ואת עלייה חזקה יותר בקורס נוסף של תרשימי (ראה איור 4 c–4e).

חדירות והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה מוצגות באיור בטבלה 4. המקדם הסתננות יורד עם הגדלת גודל מולקולרי. סטיית תקן היה בין 0.08 x 10-8 m/s 0.47 x 10-8 m/s (N = 7), אשר תאמו היא טעות מוחלטת בין 4.18% ל 46.15%. ניסויים עם מולקולות גדולות יותר הראה שגיאת מוחלטים גדולים יותר. מקדמי דיפוזיה מדומה התנהגו באופן דומה מאוד ל מקדמים חדירות ניסיוני. חומרים עם רדיוס גדול יותר סטוקס הראו הפחתת המקדמים דיפוזיה, ושגיאה מוחלטת נע בין 9.09% ל- 18.46% (N = 3).

בניסויים נוספים הסתננות, ארבעה סוגי מודל של תאים קולגן שונים שימשו כמו מחסומים קרום 12-טוב להוסיף מערכת. מודלים אלה מהווים מודל ללא תאים דגם תא עם שילובים שונים של ראשי fibroblasts ג'ל קולגן, HaCaT על פני השטח. שימשו את השילובים הבאים: קולגן (קולונל) כמודל ללא תאים, קולגן + Fibroblasts (אל"מ + פ), קולגן + HaCaT (אל"מ + ה'), ואת קולגן + Fibroblasts + HaCaT (אל"מ + פ + ח.). Fluorescein מלח נתרן עם DMEM + 10% FCS שימש חומר התורם. התמונה שימש ניתוח של המודל תא קולגן, צביעת ועם hematoxylin אאוזין (הוא). זה מכתים נעשה באמצעות הפרוטוקול של היצרן. איור 5, כתם כזה עם דגם אל"מ + פ + ח נציג מוצג. הוא מעט כתמי מבנה רקמת קולגן המטריצה. Fibroblasts ממוקמים במטריצה, הגרעינים של פיברובלסט ותאים HaCaT מוכתמים בסגול כהה. על גבי מטריצת קולגן, יש שכבה הכוללת גרעינים רבים, אשר צריכה להיות הגרעינים של HaCaTs, בניית שכבת תוחם על המודל.

טבלה 5, מפורטים הסתננות ניסיוני והקבוע המקדמים של דיפוזיה מדומה. ניתן לראות מגמה עבור רוב הדגמים עם HaCaT, אשר מקדמים הסתננות/דיפוזיה נמוך לעומת הדגמים ללא HaCaT. השגיאה המוחלטת של מקדמי הסתננות היא 10.9-24.4%, עבור דיפוזיה המקדמים של 5.2% - 12.9%.

Figure 1
איור 1: מבט צד של הניסוי חדירות קרום הוספת מערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: גרף למופת של ניסוי חדירות. הריכוז של מקבל מותווים לאורך זמן. שני קווים מקווקווים סוגר את החלק כמעט ליניארית של הגרף. השיפוע של החלק הליניארי משמש לקביעת המקדם חדירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: גיאומטריה ורשתות של הקרום להוסיף מערכת סימולציה. מערכת הוספה () גאומטריה של קרום 96-ובכן. מערכת הוספה (b) גאומטריה של קרום 12-. טוב. (ג) רשת של קרום 96-ובכן הוספה מערכת. מערכת הוספה (d) רשת של קרום 12-. טוב. (e) חתך ופרמטרים של הקרום להוסיף מערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: השוואה של נתונים ניסיוני של ניסוי הסתננות אל הסימולציה ממוטבת. מלח נתרן () fluorescein (b) fluorescein isothiocyanate-לתוספי 4,000 מול wt., (ג) 10,000 מול wt., wt. mol (d) 20,000, (e) 40,000 מול wt. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: נציג הוא מכתים של מודל תא קולגן (קולגן + Fibroblasts + HaCaT). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: חדירות מקדם כפונקציה של רדיוס 1/סטוקס באמצעות מלח נתרן fluorescein ו- fluorescein isothiocyanate-לתוספי בקרום 96-ובכן להוסיף מערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שם Experession עבור מערכת טוב 96 מ מ Experssion 12-ובכן מערכת במ מ תיאור
d_tran 5.65 [מ מ] 14.7 [מ מ] קוטר של הבאר
d_a 4.26 [מ מ] 12.1 [מ מ] קוטר של קרום
d_w 8.79 [מ מ] 21.97 [מ מ] קוטר של מקבל
h_b 2 [מ מ] 2 [מ מ] הי של המכשול
h_sp 1 [מ מ] 1 [מ מ] המרחק בין טוב והתחתונים
h_a 4.73 [מ מ] 5.24 [מ מ] גבוהה של מקבל
b h_b/2 - עומק טבילה
r ((d_a)^2+4*b^2)/(8*b) - רדיוס הכדור טבילה+
r_z r + h_b - z-מיקום של הכדור טבילה+

טבלה 1: גאומטריה פרמטרים עבור הסימולציה "תעבורה מינים כימי". + רק כדי לשמש עבור הסימולציה של agarose ג'ל בקרום טוב 96 להוסיף מערכת.

שם הביטוי ערך תיאור
C_fl 0.1 [mg/ml]/376.28 [g/mol] מול 0.26576/m2 ריכוז של Fl.So.
C_4 2 [מ"ג/מ"ל] / 4000 [g/mol] מול 0.5/m2 ריכוז FD 4.000
C_10 2 [מ"ג/מ"ל] / 10000 [g/mol] מול 0.2/m2 ריכוז FD 10.000
C_20 2 [מ"ג/מ"ל] / 20000 [g/mol] 0.1 מול/m2 ריכוז FD-20,000
C_40 2 [מ"ג/מ"ל] / 40000 [g/mol] מול 0.05/m2 ריכוז FD 40.000
Dif_w 1e-9 [m ^ 2/s] /S21E - 9 מטר מקדם דיפוזיה של ערבוב מים

טבלה 2: פרמטרים פיזיים להדמיה "תעבורה מינים כימי".

שם הביטוי תיאור
C Acceptor(c) ההגדרה של ריכוז מקבל
D D_search * 1e-10 שינוי פקטור D

טבלה 3: פרמטרים עבור הסימולציה "אופטימיזציה".

לחדור חדירות מקדם (m/s) x 10-8 מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10 סטוקס הרדיוס של permeate (ז) x 10-10
Fl.So. 4.79 ± 0.20 1.94 ± 0.34 5
FD 4,000 2.37 ± 0.31 0.65 ± 0.12 14
FD10, 000 1.67 ± 0.47 0.22 ± 0.02 23
FD 20,000 0.65 ± 0.30 0.29 ± 0.04 33
FD 40,000 0.27 ± 0.08 0.14 ± 0.02 45

בטבלה 4: מקדם פרמאביליות, דיפוזיה של חומרים עם רדיוס שונה סטוקס דרך 2% Agarose ג'ל + ממברנה ב 96-ובכן קרום להוסיף מערכת. (מלח נתרן fluorescein = פעל אז, לתוספי fitc = FD).

מודל חדירות מקדם (m/s) x 10-8 מקדם דיפוזיה (m/s2) x 10-10
אל"מ 2.18 ± 0.29 1.22 ± 0.06
אל"מ + F. 1.77 ± 0.38 0.93 ± 0.12
אל"מ + H. 1.64 ± 0.40 0.96 ± 0.05
אל"מ + פ + H. 1.65 ± 0.18 0.88 ± 0.11

טבלה 5: מקדם חדירות ובהפצה של מלח נתרן fluorescein באמצעות מודל תא קולגן גם עם 12-ממברנה טוב להוסיף מערכת (אל"מ = קולגן, פ = פיברובלסט, ה = HaCaT).

Discussion

מחקר זה מתעד שיטה שפותחה כדי לכמת הסתננות דרך מבנה רקמות מהונדסים על קרום. הסתננות של חומרים עם שינוי מולקולרי גדלים באמצעות ג'ל agarose נבדק קודם כדי לבדוק ולאמת את השיטה ואת ההדמיה המתאימות. זה ידוע כי מולקולות קטנות לחדור יותר מהר דרך רשת matrix (למעט האפקט בג'ל סינון על-ידי חדירות גזים). תצפיות דומות נעשו עם גודל-הדרה ניסויים של חומרים דרך בסקלרה26, ממברנה עוריות אנושי27, העור האנושי17, ועכברוש העור28. מתאם הפוך בין המקדמים של חדירות רדיוס סטוקס המתאים (הרדיוס של כדור קשה שזז עם דיפוזיה באותו קצב כמו שהמולקולות מתואר, בדרך כלל קטן יותר רדיוס אפקטיבי של המולקולה) הוכח 26 , 28, מערכת יחסים דומה נצפתה בניסויים עם חומרים מולקולריים בגדלים שונים. ידי מקדמי חדירות על רדיוס 1/סטוקס, נמצאה התאמה לינארית מעל מארבע הקבוצות עם גודל מולקולרי הקטן ביותר (R2 = 0.93) (איור 6). אפשרות זו מציינת כי הם מקדמים חדירות מדומה עם השיטה הציע במגוון מציאותי.

השגיאה % 46.15 בניסויים הוא מעט גדול יותר. מאשר דיווח לניסויים חדירות עם מערכת10תא דיפוזיה פרנץ. הסבר אפשרי אחד יכול להיות התפלגות גודל של fluorescein-isothiocyanate-לתוספי, אשר נדון מאוחר יותר.

השיטה המתוארת יש חשוב יתרונות לעומת שיטות באמצעות מערכת תא פרנץ דיפוזיה. ראשית, ההגדרה תהיה יותר קומפקטי; הניסויים מתבצעות ישירות במערכת ממברנה הוספה, שבו יש את קנה המידה של צלחת טוב מסחרי (∼ 13 ס מ x 8.5 ס מ). דבר זה מאפשר מספר דוגמאות שיש להפעיל בעת ובעונה אחת, ואילו תא נפרד של דיפוזיה פרנץ נדרש עבור כל דגימה. שנית, החדירות של מודל העור ניתן ישירות למדוד את תותב ממברנה, שם מתקיים הטיפוח. באמצעות תאים דיפוזיה פרנץ, הדגימות יש לחסל, רכוב על המערכת, אשר הוא מסורבל יותר עבור מדגמים קטנים והוא גם אורכת זמן רב.

הסתננות ניסויים עם קולגן תא מטריצות הראה כי בשיטה זו ניתן ליישם בהצלחה מערכות נזרע התא. המודל המוצג כאן אומתה לדגמי העור; עם זאת, ניתן להחיל את שיטת לסוגים אחרים של תרביות תאים אורגני, למשל, בכליות או בכבד.

במחקר זה, שימשה מודל קולגן תאים שבו התאים HaCaT מכוסה לחלוטין ממשטח הדגם (ראה איור 5). זה הוביל לירידה של מקדם פרמאביליות, הדגמת השיטה היא רגישה מספיק כדי להבדיל את מקדם חדירות בין מודל קולגן תאים עם ובלי שכבה של HaCaT. באופן אידיאלי, מודל העור צריך לבנות מחסום, אשר מתקרב של האפידרמיס של העור האמיתי29, לכן חשוב לוודא את איכות העור המודל לפני השימוש בפועל (למשל, הבניין של העור, האפידרמיס). הפיתוח של מודל העור יכול להיות דמיינו מכתים טכניקות, לכמת מן הגילוי של העור חלבון וקולגן30,31,32. המקדם חדירות עשוי גם להיות גורם חשוב להערכת התפתחות המודל העור, אך בהמשך הניסויים נדרשים לאשר זאת. כאמור, שיטה זו מאפשרת הפעלה דגימות מרובים במקביל. זה גם אפשר לקחת דגימות במהלך הטיפוח למדוד פרמאביליות, ולבחון ובכך הפיתוח של הפרמטר של המודל העור.

יצוין, כי חדירות. נמדד באמצעות ג'ל/קולגן-תא-דגם קרום בו זמנית. המקדם שזוהו חדירות הוא ספציפי למערכת, לפיה תוצאות מודלים עור שונים ניתן רק להשוות בעת שימוש את תותב קרום זהה. יתר על כן, המודל העור צריך לכסות את האזור כולו הטיפוח-תרגול על מנת להבטיח כי החומר במבחן לחדור רק דרך המודל, לא בצמוד לו, אשר זירוז שגיאות ב- החדירות נמדד. היבט נוסף שיש לשקול בעתיד הניסויים הוא הסביבה הטבעית המקיפים את העור. בדרך כלל, הטמפרטורה של פני העור הוא נמוך בהשוואה האזור הפנימי, אשר יכולים להשפיע על התנאים הסתננות.

כדי ליישר ניסויים במעבדה עם סימולציות מחשב, הוצגה שיטה המאפשרת אופטימיזציה פרמטר עבור יישומי סימולציה. סימולציות נמצאו יעלה בקנה אחד עם נתוני הניסוי חומרים עם גודל מולקולרי קטן. עם זאת, הסטיות בין סימולציה נתוני הניסוי נצפו חומרים בגודל מולקולרי גדול יותר. מולקולות גדולות רב-סוכר ניתן להגביר את החיכוך, להאט את תהליך דיפוזיה של ג'ל. אפקט זה גורם לא תקין דיפוזיה, המהווה סיבה אפשרית הסטייה בין ניסיוני ו סימולציה הערכים33,34. הסבר אחר יכול להיות הנוכחות של חלקיקים קטן או גדול יותר ב- fluorescein-isothiocyanate-לתוספי. היצרן מציין את המשקל המולקולרי של החומר כגודל מרושע עם מגוון נתון, אשר מאפשר חלקיקים קטנים יותר, גדול יותר להיות נוכח. לא ברור גם איך התפזרו חומרים אלו הם, כפי החלקיקים קטנים יותר מהר יותר לחדור דרך הג'ל וערוץ נוזלים. זה אפשרי להרחיב את הסימולציה לשקול אלה דיפוזיה ואפקטים חיכוך.

חדירות ניסוי של הדמיה פותחו לשימוש ב- 2-הציוד בעזרתו של הסימולציה, שיטה ניסויית זו ניתן להעביר ישירות כדי מתוחכמים יותר setups ניסיוני. לדוגמה, ניתן בקלות להעביר ממברנה הוספה מערכת סימולציה הגיאומטריה של 2-OC או למערכות אחרות עם set-ups דומה. אפשרות זו הכוח ויסות הסימולציה יכול לשמש כדי לתמוך את העיצוב של ניסויים עתידיים. בנוסף, ניתן לשלב תופעות לוואי כגון אידוי, פיזור נורמלי ואפקטים ממברנה כדי לשפר את ההדמיה, ובכך לשפר את דיוק. התוכנית סימולציה נותן את ההזדמנות כדי לשנות או לשפר את המשוואה סימולציה, כמו גם באשר לשלב מודולים פיזיים אחרים במטרה לחקור היבטים אחרים של התפתחות מודל העור. דוגמה אחת היא ההדמיה של צריכת גלוקוז וייצור לקטט במודל תא קולגן.

היבט מעניין במיוחד של חומרים רפואיים בדיקת הוא איך החומרים מופצים בכל מערכת איברים-על-שבב. הפרמטר חדירות וחידונים לעזרתי כדי לענות על שאלות כגון מה המהירות חומר מפעפע לתוך המערכת, כמו גם הריכוז אשר יהיו זמינים בשביל לרקמות אחרות במולטי-organ-צ'יפס. שיטה זו יכולה לתמוך ולשפר הפיתוח ובדיקות של מערכות איברים על שבב כאלה.

Disclosures

Uwe מרקס הוא המנכ ל ובעל מניות והוא גרד לינדנר מניות של TissUse GmbH, חברת מסחור הטכנולוגיה MOC וייצור. מחברים אחרים מצהירים אין ניגוד אינטרסים בדבר הפרסום של המאמר.

Acknowledgments

עבודה זו נוצרה באמצעות תמיכה כספית מ דויטשה פתוח (DFG) תחת גרנט לא. PO413/12-1 ו- LA 1028/7-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Carl Roth K297.2 High Resolution Powder
Collagen Serva 47256.01 Collagen R solution 0.4 %
DMEM Lonza (Biozym Scientific GmbH) 880010-12 High Glucose with L-Glutamine
FCS Biochrom GmbH S0615 0114F Fetal Calf Serum
Fluorescein Sodium Salt Sigma-Aldrich 46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich 46944-500MG 4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD10S-250MG 10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD20S-250MG 20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextran Sigma-Aldrich FD40S-250MG 40 000 g/mol
HBSS ThermoFisher Scientific 14170120 no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOH Merck 1.06467.9010 granulated
PBS Gibco 18912-014 tablets
Transwell Cell Culture Inserts Corning 3391 96 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture Inserts Corning (VWR) 734-1563 12 well, 0.4 µm pore size
Trypsin Biochrom GmbH L2143 with EDTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man? ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"? J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 132 עור דגם חדירות דיפוזיה ממברנה הוספה המערכת סימולציה fluorescein isothiocyanate-לתוספי מלח נתרן fluorescein
שיטה של נחישות וסימולציות של חדירות ובהפצה במודל תלת-ממד רקמת קרום הוספת מערכת עבור לוחות רב טוב
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder,… More

Hsu, H. H., Kracht, J. K., Harder, L. E., Rudnik, K., Lindner, G., Schimek, K., Marx, U., Pörtner, R. A Method for Determination and Simulation of Permeability and Diffusion in a 3D Tissue Model in a Membrane Insert System for Multi-well Plates. J. Vis. Exp. (132), e56412, doi:10.3791/56412 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter