Behandling av menneskelig hjerte vev mot ekstracellulær Matrix selv montering Hydrogel for In Vitro og i Vivo programmer
Summary
Denne protokollen beskriver den fullstendig decellularization av menneskelig myocardium samtidig bevare komponentene ekstracellulær matrix. Videre behandling av ekstracellulær matrix resulterer i produksjon av microparticles og en cytoprotective selv av hydrogel.
Abstract
Acellular ekstracellulær matrix forberedelser er nyttige for å studere celle matrise interaksjoner og lette regenerativ cellen terapi programmer. Flere kommersielle ekstracellulær matrix produkter er tilgjengelig som hydrogels eller membraner, men dette har ikke vev-spesifikke biologiske aktivitet. Fordi perfusjon decellularization ikke er vanligvis mulig med menneskelig hjerte vev, utviklet vi en 3-trinns nedsenking decellularization prosess. Menneskelige hjerteinfarkt skiver anskaffet under operasjonen behandles først med vaskemiddel uten hyperosmolar lyseringsbuffer, etterfulgt av inkubasjon med den joniske vaskemiddel, natrium dodecyl sulfat, og prosessen er fullført ved å utnytte den iboende DNase aktiviteten fosterets bovin serum. Denne teknikken resulterer i celle-fri ark av cardiac ekstracellulær matrix med hovedsakelig bevart bindevev arkitektur og Research komposisjon, som ble vist å gi spesifikke miljø signaler til hjerte celle populasjoner og pluripotent stilk celler. CARDIAC ekstracellulær matrix ark kan deretter videre behandlet til en microparticle pulver uten kjemiske, eller via kortsiktige pepsin fordøyelsen, til en selvstendig montering cardiac ekstracellulær matrix hydrogel med bevart bioactivity.
Introduction
Den ekstracellulære matrisen (EFM) gir ikke bare strukturell støtte, men er også viktig for biologiske celle og vev funksjon1. I hjertet deltar ECM i regulering av pathophysiologic svar som fibrosis, betennelse, angiogenese, cardiomyocyte kontraktile funksjonen og levedyktigheten og bosatt stamfar celle skjebne. I tillegg til sin primære komponenter fibrøs glykoproteiner, glycosaminoglycans og proteoglycans – inneholder den en rekke utskilles vekst faktorer cytokiner og membranous blemmer som inneholder nucleic syrer og proteiner2,3.
Nylig har det blitt klart at acellular ECM forberedelser ikke er bare uvurderlig for å studere celle matrise interaksjoner, men også for potensielle terapeutiske celle-baserte programmer. Viktigheten av å tilby et tilstrekkelig miljø terapeutiske celler eller utviklet vev er nå allment anerkjent. Forsøk har blitt gjort å kombinere celle suspensjon eller aktive forbindelser med definerte biopolymeric hydrogels4,5,6 eller protein cocktailer utskilles av murine sarkomspesialitet celler (dvs. Matrigel, Geltrex) 7. men tidligere har begrenset bioactivity, sistnevnte er problematisk i GMP-grade prosesser, og både mangler vev-spesifikke bioactivity av cardiac ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Decellularization i myokard er tidligere utført av perfusjon av hele sentrum via koronar blodkar14,15. Dette er mulig i dyr hjerter, er intakt menneskenes hjerter sjelden tilgjengelig. Derfor ble en nedsenkning prosess der for håndtering av vevsprøver innhentet i operasjonssalen foretrukket. Vår “3-step” protokollen inneholder 3 separate inkubasjon trinn nemlig lysis, solubilization og DNA fjerning. Det gir menneskelige hjerteinfarkt ECM med i stor grad bevart komposisjon16,17-med protein og glycosaminoglycan. Disse cECM skiver tillate i vitro studier av celle-matrix interaksjoner, men egnet dårlig for potensielle menneskelig skala terapeutiske programmer. Produksjonen ble deretter utvidet til å produsere lyofilisert cECM microparticles eller en cECM hydrogel18.
Denne protokollen tillater decellularization av menneskelig myocardium fra kirurgisk prøver, bevare hovedkomponentene i hjerteinfarkt ekstracellulær matrix (ECM) og deres biologiske aktivitet. Denne protokollen anbefales når menneskets hjerte ECM med bevarte vev-spesifikke bioactivity kreves for eksperimentelle studier av celle-matrix interaksjoner, eller når et egnet miljø er nødvendig for cellen-basert hjerteinfarkt regeneration tilnærminger. I prinsippet er det også mulig å tilpasse denne protokollen GMP-grade forhold, slik at bruk av behandlet cECM bør være gjennomførbart i fremtiden terapeutiske programmer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Når du forbereder menneskelige hjerteinfarkt ECM, målet er å oppnå følgende: fjerning av relevante immunogenic mobilnettet materiale, ECM integritet og bioactivity, sterilitet, ikke-toksisitet av sluttproduktet, GMP-prosessen kompatibilitet, og egnethet av produktet for et gitt program i håndtering. Ved å kombinere våre 3-trinns decellularization protokollen med ytterligere behandling i microparticles eller selv av hydrogel, menneskets hjerte ECM materiale er innhentet som besitter biologiske aktiviteten, er lett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien protokollen overholder de etiske prinsippene i deklarasjonen i Helsinki. Pasienter gitt samtykke for bruk av vev til forskningsformål, og prosessen med vev samling ble godkjent av institusjonelle Review Board og etikk av Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).
Materials
| Balance | DR Precisa, Dietikon, Switzerland | Precisa XR 205SM | |
| Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 | InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany | SK-10-004 | |
| Cell culture plates (6-well) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 657160 | |
| Cryostat CM | Leica, Wetzlar, Germany | 3050S | |
| EDTA | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 8043.3 | |
| Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) | Greiner, Frickenhausen, Germany | 616201, 623201 | |
| Falcon 15ml, 50ml | Greiner, Frickenhausen, Germany | 188271, 227270 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrome, Berlin, Germany | S 0115 | |
| Freeze Dry System | Labconco, Kansas City, USA | 7670520 | |
| Freezer (-80°C) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | Forma 900 Series | |
| HCl | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 281.1 | |
| Microtome Blades Type 819 | Leica, Wetzlar, Germany | 14035838925 | |
| Minilys Homogeniser | PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany | 91-PCSM | |
| NaOH | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | K021.1 | |
| Nystatin | PAN Biotech, Aidenbach, Germany | P06-07800 | |
| PBS | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 14190-094 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P6887-1G | |
| Precellys Keramik-Kit 1.4 mm | Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany | 91-PCS-CK14 | |
| Rotamax 120 Plate shaker | Heidolph, Schwabach, Germany | 544-41200-00 | |
| SDS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | CN30.3 | |
| Stereo microscope | Leica, Wetzlar, Germany | M125 | |
| Steriflip-GP, 0,22 µm | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCGP00525 | |
| Stuart analogue rocker & roller mixers | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | Z675113-1EA | |
| Tissue Tek O.C.T compound | Hartenstein, Wurzburg, Germany | TTEK | |
| Transfusion set 200µm | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 798.200.500 | |
| TRIS | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 5429.3 | |
| vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm | Medical Highlights, Rohrdorf, Germany | CV102-003 | |
| Vortex-Genie2 | Scientific Industry, New York, USA | SI-0256 |
References
- Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
- Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
- Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
- Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
- Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
- Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
- Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
- Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
- DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
- Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
- Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
- Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
- Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
- Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
- Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
- Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
- Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
- Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
- Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
- Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
- Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
