Summary

Обработка тканей человека сердца к внеклеточного матрикса самостоятельной сборки Гидрогель для In Vitro и In Vivo приложений

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

Этот протокол описывает полный decellularization человека миокарда при сохранении его компонентов внеклеточного матрикса. Дальнейшая обработка внеклеточная матрица результатов в производстве микрочастиц и цитопротективного самостоятельной сборки гидрогеля.

Abstract

Бесклеточной внеклеточного матрикса препараты являются полезными для изучения взаимодействия клеток матрица и облегчения применения терапии регенерации клеток. Ряд коммерческих внеклеточного матрикса продукты доступны как гидрогели или мембраны, но они не обладают биологической активности тканей конкретных. Потому что decellularization перфузии обычно не возможно с человеческой ткани сердца, мы разработали процесс погружения 3-шаг decellularization. Человека миокарда ломтиками, приобретенных во время операции сначала лечатся буфера lysis бесплатный стиральный порошок hyperosmolar, следуют инкубации с ионной стиральный порошок, лаурилсульфат натрия, и процесс завершится, используя встроенные DNase деятельность плода бычьим сывороточным. Этот метод приводит к листы клеток сердечной внеклеточной матрицы с во многом сохранились фиброзной ткани архитектуры и биополимерные состав, были продемонстрированы предоставлять конкретные экологические сигналы сердца клеточных популяций и плюрипотентных стволовых клетки. Сердца внеклеточного матрикса листов может затем быть далее перерабатывается в тонкодисперсный порошок без дальнейшей химической модификации, или, через краткосрочные пепсин пищеварение, в самостоятельной сборки сердца внеклеточного матрикса гидрогеля с консервированные биологическую.

Introduction

Внеклеточная матрица (ECM) обеспечивает не только структурной поддержки, но также имеет важное значение для биологических клеток и тканей функции1. В самом сердце ECM участвует в регуляции патофизиологические реакции например фиброз, воспаление, ангиогенез, cardiomyocyte сократительной функции и жизнеспособности и резидентов прогениторных клеток судьбы. В дополнение к его основных компонентов – волокнистые гликопротеинов, гликозаминогликанов и протеогликаны – он содержит целый ряд секретируемые факторов роста и цитокинов, мембранные везикулы, содержащие нуклеиновых кислот и белков2,3.

Недавно стало ясно, что бесклеточной ECM препараты не только бесценным для изучения взаимодействия клеток матрицы, но и для потенциальных терапевтических клеток-приложений на основе. В настоящее время широко признается важность обеспечения надлежащих условий для терапевтического клеточных продуктов или инженерии тканей. Были предприняты попытки объединить клеточных суспензий или активных соединений с определенными Биополимерное гидрогели4,5,6 или коктейлей белка выделяется клетками мышиных саркома (т.е. Matrigel, Geltrex) 7. Однако, бывший имеют ограниченные биологическую, последние являются проблематичными в процессах GMP-сорт, и оба не хватает биологическую ткань конкретных сердца ECM (СКВ)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization миокарда ранее выполнялись перфузии всего сердца через коронарные сосудистую14,15. Хотя это возможно в сердцах животных, нетронутым человеческие сердца редко доступны. Таким образом процесс погружения, который позволяет для обработки образцов тканей, полученных в операционной комнате было оказано. Наши «3-шаг» протокол содержит 3 отдельных инкубации шаги, а именно лизиса, солюбилизация и удаления ДНК. Он дает человека миокарда ECM с во многом сохранились белка и Глюкозаминогликан состав16,17. Эти фрагменты СКВ позволяют в vitro исследования взаимодействий клеток матрица, но плохо подходят для потенциальных человека масштабе терапевтического применения. Производственный процесс был затем продлен до производства лиофилизированный СКВ микрочастицы или СКВ гидрогеля18.

Этот протокол позволяет для decellularization человека миокарда, полученные из хирургической образцов, сохраняя основные компоненты и их биологическая активность миокарда внеклеточного матрикса (ECM). Этот протокол рекомендуется, когда человеческие сердца ECM с сохранившихся биологическую ткань конкретных требуется для экспериментальных исследований взаимодействия клеток матрицы, или когда подходящей среды необходима для подходов, основанных на клетки миокарда регенерации. В принципе возможна также адаптировать этот протокол в условиях GMP-класса, так что использование обработанных СКВ должно быть возможным в будущем терапевтического применения.

Protocol

Протокол исследования соответствует этические принципы, изложенные в Хельсинкской декларации и был одобрен Комитетом Совета и этики институциональный обзор Charité медицинского университета. Все пациенты условии написано, информированное согласие на использование ткани сердца для эк?…

Representative Results

Протокол 3-шаг для decellularization миокарда человека здесь представлены результаты в почти полное удаление клеточным материалом, сохраняя основные компоненты ECM и фибриллярного структуры ECM. После decellularization брутто удаление клеток из ткани свидетельствует изменение цвета (<st…

Discussion

При подготовке человека миокарда ECM, цель – добиться следующее: удаление соответствующих иммуногенность клеточного материала, сохранение целостности ECM и биологическую, бесплодие, нетоксичность конечного продукта, GMP-процесса совместимости, и пригодность продукта для данного приложе…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Протокол исследования соответствует этические принципы, изложенные в Хельсинкской декларации. Обоснованного согласия пациентов предусмотрено использование ткани для исследовательских целей, а процесс сбора ткани был одобрен институциональных Наблюдательный Совет и Комитет по этике Шарите – этот Berlin (ΕΑ4/028/12).

Materials

Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).

Play Video

Cite This Article
Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

View Video