Summary

עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

Abstract

מטריצה חוץ-תאית acellular ההכנות שימושיים עבור לימוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס ולהקל תא משובי טיפול יישומים. מספר מוצרים מסחריים מטריצה חוץ-תאית זמינים כמו hydrogels או ממברנות, אך אלה לא ניחנת פעילות ביולוגית רקמות ספציפיות. כי זלוף decellularization בדרך כלל לא אפשרי עם רקמת הלב האנושי, פיתחנו תהליך decellularization 3-צעד טבילה. פרוסות שריר הלב האנושי רכש במהלך הניתוח הראשון שטופלו hyperosmolar דטרגנט ללא פירוק מאגר, ואחריו הדגירה עם יונית דטרגנט, dodecyl סולפט נתרן, ואת התהליך הושלם על ידי ניצול הפעילות DNase מהותי של סרום שור בעובר. טכניקה זו התוצאה ללא תא גיליונות של מטריצה חוץ-תאית לב עם נשמר בעיקר סיבי רקמת ביופולימרים ואדריכלות הרכב, אשר הוצגו לספק רמזים סביבתיים מסוימים כדי אוכלוסיות הלב תא גזע pluripotent תאים. מטריצה חוץ-תאית לב גליונות שניתן ואז עוד יותר מעובד לאבקה microparticle ללא שינוי כימי נוסף או, באמצעות עיכול פפסין לטווח קצר, לתוך הידרוג מטריצה חוץ-תאית לב וההספק עצמית עם משומר אתריים.

Introduction

מטריצות (ECM) מספק לא רק מבנה תומך אבל חשוב גם עבור תא ביולוגי, רקמות לתפקד1. בלב, ECM משתתף בוויסות תגובות pathophysiologic כגון פיברוזיס, דלקת, אנגיוגנזה, הפונקציה כויץ cardiomyocyte ואת הכדאיות קדמון תושב גורל. בנוסף מרכיביו העיקריים – סיבי glycoproteins, glycosaminoglycans ו proteoglycans – הוא מכיל שורה של גורמי גדילה מופרשים ציטוקינים, עלי הלוואי קרומיים שלפוחית המכילה2,של חומצות גרעין וחלבונים –3.

זה הפך לאחרונה כי ההכנות ECM acellular הן לא רק שלא יסולא בפז ללמוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס, אלא גם עבור יישומים פוטנציאליים מבוססת תא טיפולית. החשיבות של מתן סביבה נאותה התא טיפולית מוצרים או רקמות מהונדסים כעת ידוע נרחב. נעשים ניסיונות לשלב תא המתלים או חומרים פעילים עם מוגדר hydrogels biopolymeric4,5,6 או עם קוקטיילים חלבון מופרש על ידי תאי מאתר סרקומה (קרי, Matrigel, Geltrex) 7. עם זאת, לשעבר מוגבלת אתריים האחרונים הם בעייתיים בתהליכים GMP-כיתה, שניהם חסרים את אתריים רקמות ספציפיות של הלב ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization של שריר הלב בעבר בוצעה על ידי זלוף בלב שלם באמצעות ה-14,להערכת כלילית15. אמנם זה אפשרי בלבבות בעלי חיים, לבבות אדם שלם זמינים רק לעתים רחוקות. לפיכך, תהליך טבילה המאפשר טיפול דגימות רקמה שהושג בחדר הניתוח היה המועדף. פרוטוקול “3-צעד” שלנו מכיל 3 נפרד הדגירה שלבים כלומר פירוק, solubilization, והסרת ה-DNA. זה מניב ECM שריר הלב האנושי עם משומר בעיקר חלבון, גליקוזאמינוגליקן קומפוזיציה16,17. פרוסות cECM אלה מאפשרים מחקרים במבחנה של התא-מטריקס אינטראקציות אבל מתאים היטב עבור יישומים פוטנציאליים בקנה מידה האדם טיפולית. תהליך הייצור הוארך אז כדי לייצר lyophilized cECM microparticles או של הידרוג cECM18.

פרוטוקול זה מאפשר decellularization של שריר הלב האנושי המתקבל דגימות כירורגי, שמירה על המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית שריר הלב (ECM) ופעילותם וחיסונים. פרוטוקול זה מומלץ כאשר ECM הלב האנושי עם אתריים רקמות ספציפיות שהשתמרו נדרשת ללימודים ניסיוני של אינטראקציות סלולרי-מטריקס, או כאשר סביבה מתאימה יש צורך גישות מבוססות תא התחדשות שריר הלב. בעקרון, זה גם אפשרי להתאים פרוטוקול זה בתנאי GMP-כיתה, כך השימוש cECM מעובד צריך להיות ריאלי יישומים טיפוליים בעתיד.

Protocol

פרוטוקול המחקר תואמת עקרונות אתיים שמתואר את הצהרת הלסינקי, שאושר על ידי סקירה מוסדיים המנהלים ואתיקה ועדת צ’אריטה הרפואי האוניברסיטאי. כל המטופלים סיפק נכתב, הסכמה מדעת לשימוש של רקמת הלב ללימודי ניסיוני. 1. הכנה של שריר הלב האנושי חלוקתה להשיג את שריר הלב הימני חדרית …

Representative Results

פרוטוקול 3-צעד עבור decellularization של שריר הלב האנושי המובאת כאן תוצאות כמעט מוחלטת הסרת חומר הסלולר, תוך שימור המרכיבים ECM העיקריים של המבנה fibrillar של ECM. לאחר decellularization, הסרת תאים מן הרקמה ברוטו הוא ברור על-ידי שינוי צבע (איור 1 א’). ניתוח היסטולוגית עם כתמי H & E ו- Tric…

Discussion

בעת הכנת ECM שריר הלב האנושי, המטרה היא להשיג את הדברים הבאים: הסרת חומרים רלוונטיים הסלולר immunogenic, שמירה על שלמות ECM ו אתריים, עקרות, אי רעילות של המוצר הסופי, תאימות GMP-תהליך, ו התאמת המוצר עבור יישום נתון במונחים של טיפול. על ידי שילוב פרוטוקול 3-צעד decellularization שלנו עם עיבוד נוסף לתוך microparticles או…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרוטוקול המחקר תואמת עקרונות אתיים שמתואר את הצהרת הלסינקי. חולים שסופקו מדעת לשימוש של הרקמה למטרות מחקר, התהליך של איסוף רקמת אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של צ’אריטה – Universitätsmedizin ברלין (EA4/028/12).

Materials

Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52 (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119 (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21 (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. , (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32 (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111 (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22 (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5 (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. , (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59 (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16 (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. , (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70 (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12 (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2 (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).

Play Video

Cite This Article
Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

View Video