Summary

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

Abstract

Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.

Introduction

La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos – contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de crecimiento y citoquinas.

Recientemente ha quedado claro que preparados acelulares de ECM no sólo son inestimables para el estudio de las interacciones célula-matriz, sino también para posibles aplicaciones terapéuticas basadas en células. Ahora es ampliamente reconocida la importancia de proporcionar un entorno adecuado para productos celulares terapéuticos o ingeniería de tejidos. Ha habido intentos para combinar suspensiones celulares o compuestos activos con hidrogeles biopolímeros definido4,5,6 o con cócteles de proteína secretadas por las células del sarcoma murino (es decir, Matrigel, Geltrex) 7. sin embargo, los primeros son limitadas bioactividad, estos últimos son problemáticos en los procesos de calidad GMP y ambos carecen de la bioactividad específica de tejido cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Descelularización del miocardio se ha realizado previamente por la perfusión del corazón entero a través de la vasculatura coronaria14,15. Mientras que esto es posible en animales corazones, corazones humanos intactos están raramente disponibles. Por lo tanto, fue favorecido un proceso de inmersión que permite la manipulación de las muestras de tejido obtenidas en la sala de operaciones. Nuestro protocolo “3 pasos” contiene 3 separado incubación pasos a saber: lisis, solubilización y extracción de ADN. Produce la ECM miocardio humana con en gran parte conservadas proteínas y glicosaminoglicanos composición16,17. Estas rebanadas cECM permiten estudios en vitro de las interacciones célula-matriz pero están mal adaptados para posibles aplicaciones terapéuticas de la escala humana. El proceso de fabricación se amplió entonces para producir micropartículas cECM liofilizado o un hidrogel cECM del18.

Este protocolo permite la descelularización de miocardio humano Obtenido de muestras quirúrgicas, preservación de los componentes principales de la matriz extracelular miocárdica (ECM) y su actividad biológica. Este protocolo se recomienda cuando ECM cardiaca humana con bioactividad específica de tejido conservada se requiere para estudios experimentales de las interacciones célula-matriz, o cuando se necesita un ambiente adecuado para regeneración miocárdica celular enfoques. En principio, también es posible adaptar este protocolo a las condiciones GMP-grado, para que el uso del cECM procesado debería ser factibles aplicaciones terapéuticas en el futuro.

Protocol

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética y Junta de revisión institucional de la Charité Medical University. Todos los pacientes siempre por escrito, consentimiento informado para el uso de tejido cardíaco para estudios experimentales. 1. preparación del miocardio humano para seccionamiento Obtener el miocardio ventricular izquierdo (el tamaño varía dependiendo del tipo de cirugí…

Representative Results

El protocolo de 3 pasos de descelularización de miocardio humano presentamos resultados en la eliminación casi total de material celular, conservando los componentes clave del ECM y la estructura fibrilar del ECM. Después de descelularización, la extracción bruta de las células de los tejidos es evidente por el cambio de color (figura 1A). El análisis histológico con manchas de H & E y TRICROMICA de Masson reveló la ausencia completa de células inta…

Discussion

Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene q…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité – Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).

Materials

Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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