Summary

Traitement du tissu cardiaque humain vers la matrice extracellulaire auto-assemblage Hydrogel pour In Vitro et In Vivo des Applications

Published: December 04, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit la DÉCELLULARISATION complete du myocarde humaine tout en préservant ses constituants de la matrice extracellulaire. Traitement ultérieur des résultats dans la production de microparticules et un hydrogel auto-assemblage cytoprotecteurs matrice extracellulaire.

Abstract

Préparations de la matrice extracellulaire acellulaire sont utiles pour étudier les interactions cellule-matrice et facilitent les demandes de thérapie régénératrice des cellules. Plusieurs produits commerciaux de la matrice extracellulaire sont disponibles comme les hydrogels ou membranes, mais ceux-ci ne possèdent pas d’activité biologique spécifique des tissus. Car DÉCELLULARISATION de perfusion n’est habituellement pas possible avec les tissus du coeur humain, nous avons développé un procédé de DÉCELLULARISATION d’immersion 3 étapes. Humaines tranches myocardiques achetés au cours de la chirurgie sont d’abord traitées avec tampon de lyse hyperosmolaire sans tensioactifs, suivie d’une incubation avec l’ionique détergent, dodécyl sulfate de sodium, et le processus s’achève en exploitant l’activité DNase intrinsèque des sérum de veau fœtal. Cette technique aboutit à feuilles acellulaire de matrice extracellulaire cardiaque avec en grande partie préservée composition d’architecture et des biopolymères de tissu fibreux, qui apparaissaient pour offrir des repères écologiques spécifiques aux populations de cellules cardiaques et souches pluripotentes cellules. Feuilles de matrice extracellulaire cardiaque peuvent ensuite être encore transformés en une poudre de microparticules sans modification supplémentaire chimique, ou, via la digestion pepsique à court terme, dans un hydrogel auto-assemblage de matrice extracellulaire cardiaque avec conservés bioactivité.

Introduction

La matrice extracellulaire (ECM) fournit non seulement structurelle soutenir mais est également importante pour la cellule biologique et tissu int1. Dans le coeur, l’ECM participe à la régulation des réponses physiopathologiques comme la fibrose, inflammation, angiogenèse, cardiomyocyte fonction contractile et viabilité et sort de cellules progénitrices résident. En plus de ses principaux composants – glycoprotéines fibreuses, glycosaminoglycanes et protéoglycanes – il contient une foule de facteurs de croissance sécrétés, cytokines et vésicules membraneux contenant des acides nucléiques et protéines2,3.

Récemment, il est devenu clair que les préparations d’ECM acellulaires ne sont pas seulement inestimables pour l’étude des interactions cellule-matrice, mais aussi pour des applications thérapeutiques potentielles basés sur les cellules. L’importance d’offrir un environnement adapté aux produits thérapeutiques cellulaires ou tissus ingénieries est maintenant largement reconnu. Ont tenté de combiner des suspensions cellulaires ou des composés actifs avec des hydrogels biopolymères défini4,5,6 ou avec des cocktails de protéines sécrétées par les cellules de sarcome murin (c.-à-d., Matrigel, Geltrex) 7. Toutefois, les anciens ont limité bioactivité, ces derniers sont problématiques dans les processus de qualité GMP, et tous deux n’ont pas la bioactivité spécifique des tissus cardiaques ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

DÉCELLULARISATION du myocarde a précédemment été interprétée par perfusion du cœur tout via le système vasculaire coronaire14,15. Tout cela est possible dans le cœur animal, des cœurs humains intacts sont rarement disponibles. Par conséquent, un processus d’immersion qui permet pour la manipulation des échantillons de tissus obtenus dans la salle d’opération a été favorisé. Notre protocole de « 3-step » contient 3 separate incubation étapes à savoir lyse, solubilisation et l’enlèvement de l’ADN. Il donne humain ECM myocardique avec en grande partie préservé protéine et glycosaminoglycanes composition16,17. Ces tranches de cECM permettent des études in vitro des interactions cellule-matrice, mais sont mal adaptés pour des applications thérapeutiques potentielles de taille humaine. Le procédé de fabrication a été étendu ensuite pour produire des microparticules de cECM lyophilisée ou un hydrogel de cECM18.

Ce protocole permet la DÉCELLULARISATION du myocarde humain obtenu à partir des échantillons chirurgicales, préservant les principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) myocardique et leur activité biologique. Ce protocole est recommandé lorsque l’humain ECM cardiaque avec conserve bioactivité de tissu-spécifique est requis pour l’étude expérimentale des interactions cellule-matrice, ou lorsqu’un environnement adéquat est nécessaire pour des approches basées sur les cellules myocardiques régénération. En principe, il est également possible d’adapter ce protocole se rapportant à des conditions de qualité GMP, afin que l’utilisation de la cECM transformé devrait être faisables applications thérapeutiques à l’avenir.

Protocol

Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki et a été approuvé par le Comité de Conseil et de l’éthique d’étude institutionnelle de l’Université de médecine Charité. Tous les patients fournis écrit, un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu cardiaque dans les études expérimentales. 1. préparation du myocarde humain pour le sectionnement Obtenir le myocarde ventriculaire gauche (la taille varie…

Representative Results

Le protocole 3 étapes pour DÉCELLULARISATION du myocarde humain présenté ici résultats dans l’élimination presque complète du matériel cellulaire, tout en préservant les principales composantes de l’ECM et la structure fibrillaire d’ECM. Après DÉCELLULARISATION, le brut prélèvement de cellules du tissu est évident par le changement de couleur (Figure 1 a). L’analyse histologique avec des taches de H & E et Trichrome de Masson a révélé…

Discussion

Lors de la préparation humaine ECM myocardique, l’objectif est de réaliser ce qui suit : enlèvement du matériel cellulaire immunogène pertinent, préservation de l’intégrité de l’ECM et la bioactivité, stérilité, absence de toxicité du produit fini, compatibilité GMP-process, et qualités du produit pour une application donnée en termes de manipulation. En combinant notre protocole DÉCELLULARISATION 3 étapes avec un traitement ultérieur dans des microparticules ou hydrogel auto-assemblage, matérie…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le protocole de l’étude respecte les principes éthiques énoncés dans la déclaration d’Helsinki. Les patients fourni un consentement éclairé pour l’utilisation du tissu à des fins de recherche, et le processus de prélèvement tissulaire a été approuvé par l’Institutional Review Board et le Comité d’éthique de la Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA4/028/12).

Materials

Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

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Cite This Article
Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

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