Summary
אנו מתארים פרוטוקול מתרבים ביצירת ו fibroblasts השבתה הדרגתית העיקרי עורי אנושי, ניטור התעתיק הניוון ולאחר זיהוי גנים רקובה באופן שונה.
Abstract
תרדמה הוא מצב זמני, הפיכה בה תאים חדלו חלוקת התא, אך לשמר את היכולת להתרבות. מחקרים רבים, כולל שלנו, הראו כי תרדמה קשורה נפוצה שינויים בביטוי הגנים. חלק משינויים אלה להתרחש דרך שינויים ברמה או פעילות של גורמי שעתוק התפשטות-הקשורים, כגון E2F ו- MYC. הראו כי ה-mRNA דעיכה יכול לתרום גם שינויים בביטוי הגנים בין תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים הליך הקמת תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של העורלה עורי האנושי fibroblasts. לאחר מכן נתאר את נהלי עיכוב חדש שעתוק בתאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית עם ואקטינומיצין D (ActD). טיפול ActD מייצג גישה ישירה, לשחזור בריא שעתוק חדש מהשחתה תעתיק. חיסרון של טיפול ActD היא כי מסלול הזמן חייב להיות מוגבל למסגרת זמן קצר כי ActD משפיע על התא הכדאיות. התעתיק רמות מנוטרים לאורך זמן לקביעת תעתיק הניוון. הליך זה מאפשר הזיהוי של גנים איזופורמים כי התערוכה הריקבון הדיפרנציאלי ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.
Introduction
רמות מצב יציב של הפרוטוקולים משקפים את התרומה של התעתיק סינתזה ודעיכה תעתיק. מוסדר והוא תעתיק מתואמת דעיכה מנגנון חשוב לשליטה תהליכים ביולוגיים1,2,3,4. לדוגמה, התעתיק הניוון הוכחו לתרום הסדרה הטמפורלי של אירועים בעקבות ההפעלה על-ידי הגידול נקרוזה מקדם ציטוקינים דלקתיים5.
אנחנו הראו בעבר כי המעבר בין התפשטות תרדמה בתוך ראשי fibroblasts האנושי קשורה לשינויים ברמות תעתיק של גנים רבים6. חלק משינויים אלה משקפים הבדלים בפעילות של גורמי שעתוק בין שתי מדינות אלה.
שינוי בקצב של תמליל רדיואקטיבית יכול לתרום גם שינויים ברמת הביטוי של תעתיק שני מצבים שונים7,8. בהתבסס על הממצאים שלנו מוקדם יותר כי המעבר בין התפשטות תרדמה קשורה לשינויים ברמות של מיקרו Rna מספר9, שאלנו יש גם תרומה מהשחתה התעתיק דיפרנציאלית משתנה ב ביטוי גנים ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית.
כדי לעקוב אחר תעתיק יציבות, קבענו שיעור הריקבון של הפרוטוקולים הגנום כולו ב מתרבים לעומת תאים השבתה הדרגתית. כדי להשיג זאת, אנחנו במעקב הניוון ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית על ידי היכרות עם מעכב של שעתוק חדשים וניטור קצב שבו תעתיקים בודדים נעלם עם הזמן. היתרון של גישה זו הוא, לעומת שיטות המפקחים פשוט ביטוי גנים הכוללת, על ידי עיכוב סינתזה חדשה התעתיק, נוכל לקבוע את קצב הדעיכה תחפש ברישומים אלה בנפרד מן הקצב שבו הם עיבד.
טיפול ActD לעכב שעתוק חדשים ולקבוע תעתיק הניוון יושם בהצלחה במחקרים קודמים מרובים. ActD שימש לנתח את חשיבות יציבות הרנ א משתנה בשפע התעתיק הנובעים הטיפול בעזרת ציטוקינים פרו-דלקתיים5. בגישה דומה שימש גם לנתח את ההבדלים התעתיק קצב הדעיכה ב מתרבים לעומת תאים C2C12 כפי הם מאמצים של פנוטיפ של שריר הבדיל10. כדוגמה נוספת, ה-mRNA מחצית החיים הכללית גם זוהתה pluripotent, תאי גזע עובריים בעכבר הבדיל11. בדוגמאות אלה, ריקבון mRNA הוכח להיות חשוב עבור ויסות התעתיק שפע, את המעבר של תאים תאים שונים הברית.
יישום השיטות המתוארות להלן, גילינו לשינויים התעתיק הניוון כ 500 גנים בהשוואת fibroblasts הברית מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית12. בפרט, גילינו כי המטרות של microRNA מיר-29, אשר downregulated בתאים השבתה הדרגתית, התייצבו כאשר תאי מעבר תרדמה. נתאר כאן את המתודולוגיה שהשתמשנו כדי לקבוע הניוון תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. מתודולוגיה זו שימושית לצורך השוואת הכללית הניוון mRNA בשני נושאים שונים אך דומים לתנאים כאשר מידע אודות במהירות מרקיבים גנים מתבקשת. זה יכול לשמש גם כדי לטפל שאלות אחרות כגון ההשפעה של התא תנאי התרבות על התעתיק ריקבון, למשל, לשניים מימד לעומת שלוש התרבויות תלת-ממדי. הניוון יכול להיות נחוש הגנום כולו עם שיטות כמו מיקרו-מערכים או RNA-תת סעיף. לחילופין, qPCR בזמן אמת או סופג הצפוני יכול לשמש כדי לקבוע את הניוון על בסיס ג'ין-מאת-גן או isoform-על ידי-isoform. המחירים הללו יכולים לשמש לאחר מכן כדי לחשב את זמן מחצית החיים של כל הגן בפיקוח וכדי לזהות גנים עם הניוון השונים של שני תנאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים אושרו על ידי המוסדיים סקירה קרשים אוניברסיטת פרינסטון, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס.
1. מכינים את Fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר לקורס ActD זמן
הערה: פרוטוקול זה משתמש של timecourse עם ארבע timepoints. ניתן לאסוף שלוש דוגמאות ביולוגית עצמאית לכל timepoint על ידי איסוף תרביות רקמה שונים לוחות בניסוי אחד, או הניסוי יכול לחזור מספר פעמים עם תרבויות שונות של תאים. מניסיוננו, צלחת תרביות רקמה אחת של 10 ס מ (קוטר) (לוח אחד) מספק RNA מספיק לניתוח. במידת הצורך, באפשרותך איחדו מספר מנות תרביות רקמה עבור כל דגימה להגדיל את מספר תאים על כל timepoint. בנוסף, ניתן לבצע את הניסוי באותו fibroblasts מבודד מאנשים שונים כמו ביולוגית עצמאית משכפל.
- להקים תרבויות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית של תאים לניתוח דעיכה תעתיק. עבור תאים מתרבים, לפצל את התאים כל שלושה ימים בזמן התאים עכבות-קשר הופכים להיות מעוכבים-קשר.
- עבור תאי קשר-עכבות, לשנות את המדיום כל יומיים במשך 7 ימים. פצל את התאים proliferating יומיים לפני fibroblasts עכבות-קשר מוכנים לאוסף. דוגמה של ערכת תרבות תא מוצג באיור1. השלבים הנותרים בסעיף זה מספקות עבור הקמת ופיצול התאים פרוטוקול מפורט.
- לבודד fibroblasts עורי העיקרי מן העור neonatal לפי פרוטוקולים הוקמה13. המעבר fibroblasts כדי להבטיח אוכלוסיה הומוגנית.
הערה: Fibroblasts יכול להיות קפוא, הקרת, במידת הצורך. - להפשיר או replate fibroblasts, במידת הצורך. לגדול fibroblasts ב DMEM עם 10% סרום בתנאים סטריליים ב חממה תרביות רקמה-CO 37 ° C ו-5%2. השתמש fibroblasts כי כבר מבוגר בשביל פחות מעשרה פסוקים. Fibroblasts צריך להיות < 80% confluent ביום של פיצול תאים להפוך אוכלוסיות מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית.
- כדי לפצל צלחת תרביות רקמה לוחות מרובים, prewarm PBS טריפסין, בינוני עם סרום באמבט מים 37 º C למשך 20 דקות.
- האחות או להשתמש pipet להסיר את המדיום שהלוח תרביות רקמה עם תאים כדי להיות replated.
- Pipet PBS חמים על כל צלחת (10 מ"ל של פתרון עבור צלחת 150 מ מ, 5 מ של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6), ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12.
- וביופסיה או pipet כדי להסיר PBS שהלוח תרביות רקמה.
- בעדינות pipet 1 x טריפסין-EDTA על כל צלחת (8 מ"ל של פתרון לצלחת 150 מ מ, 3 מ"ל של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12).
הערה: להפוך 1 x טריפסין-EDTA על ידי דילול סטרילי 10 x טריפסין-EDTA ב- PBS סטרילי. הפתרון הסופי 1 x צריך להיות EDTA טריפסין ו- 0.02% 0.05%. - דגירה טריפסין עם תאים עבור 5 דקות.
- טפח בעדינות את הצלחת מכך התאים מהצלחת.
- Pipet כדי resuspend תאים להשעיה תא בודד.
- להעביר תאים בפתרון טריפסין צינור חרוטי המכיל באותו אמצעי אחסון של DMEM עם 10% סרום (8 מ של פתרון לצלחת 150 מ מ, 3 מ"ל של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 1 מ"ל עבור טוב של 12 טוב לוח).
- ספין למטה תאים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב x 1000 g כדי להסיר טריפסין.
- Resuspend אמצעי אחסון המתאים של בינוני, ספירת תאים עם hemacytometer כדי לקבוע ריכוז התא.
- זרע 5 x 105 תאים לכל 100 מ מ לוח תרביות רקמה עבור מתרבים ותאים עכבות-קשר.
- באמצעות שיטה זו, להקים את הדגימות מתרבים ומגדלי עכבות-קשר הנדרש לצורך ניתוח (איור 1).
2. ActD זמן הקורס
- Resuspend ActD-ריכוז מניות של 1 מ"ג/מ"ל (עבור 1 מ ג של ActD, שימוש µL 950 ל- PBS סטרילי, µL 50 של דימתיל סולפוקסיד סטרילי).
הערה: קפואים מלאי פתרונות של ActD צריך להיות יציב במשך חודש ב-20 ° C. תמיסות צריך להיות מושלך, אינם מאוחסנים להמשך השימוש. - להוסיף ActD האחסון המתאים של מדיום prewarmed עבור כל תרבית תאים שכפל ביולוגי צלחות זה נקבעו מוכן של 0, 120, 240 ו- 480 דקות timepoints (איור 2). להוסיף ActD ריכוז של µg 15 לכל מיליליטר בינוני. מערבבים היטב, וארוקן את המדיום הישן ולהוסיף בינוני המכילים ActD לתאים.
- עבור מניה 1 מ"ג/מ"ל, להוסיף 15 µL ActD עבור כל מיליליטר בינוני, למשל, עבור 10 מ"ל של מדיום לצלחת 100 מ מ, להוסיף 150 µL ActD.
- כדי לאסוף את הדגימה timepoint אפס, תשאף בעדינות ירד ActD בינוני, והוא pipet prewarmed PBS אל התאים. Pipet 10 מ"ל של פתרון לצלחת 150 מ מ, 5 מ של פתרון עבור צלחת 100 מ מ, 2 מ עבור טוב של צלחת טוב 6 ו- 1 מ"ל עבור טוב של צלחת טוב 12.
- בעדינות מחוק לגמרי או pipet טוב, מגניב.
הערה: כל השלבים הכרוכים RNA בידוד צריכה להתבצע עם RNase ללא מים, ללא RNase צינורות microcentrifuge נטולת RNase פיפטות. כפפות צריך להיות שחוקים ולא השתנה לעתים קרובות בעת עבודה עם ה-RNA. - הוספת פנול-guanidine isothiocyanate פתרון (1 מ"ל/10-ס מ צלחת עם 4 x 105 על 4 x 107 תאים) ישירות לצלחת תרביות רקמה.
הערה: פתרון isothiocyanate פנול-guanidine הוא פתרון monophasic שומרת על איכות ה-RNA בזמן lysing תאים ומפריד RNA DNA, חלבון אחד מהשני.
התראה: isothiocyanate פנול ו- guanidine הם מאכל. השתמש הגנה הולמת. - תערובת פתרון-תא isothiocyanate pipet פנול-guanidine לאורך מספר פעמים להכין תערובת הומוגנית.
הערה: פתרון isothiocyanate פנול-guanidine lysate ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ב-20 ° C עבור עד שנה. - לאסוף את כל נקודת זמן לאחר הכמות המתאימה של הזמן חלף באמצעות השיטה המתוארת בצעדים 2.3-2.6.
3. בידוד של RNA הכולל מהפתרון פנול-guanidine Isothiocyanate Lysate
- דגירה בדגימות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות כדי להבטיח התפרקות מוחלטת של RNA-חלבון מתחמי.
הערה: השלבים של פרוטוקול פתרון isothiocyanate פנול-guanidine יכול להתבצע בטמפרטורת החדר אלא אם נכתב אחרת. - מציגים את התמלילים ספייק-אין שליטה שניתן לאתר עם המתודולוגיה בשימוש.
הערה: חיצוני RNA שליטה consortium (ERCC) ספייק-אין שליטה mix14 עוצב במיוחד כפקד ספייק-in עבור ה-RNA-תת סעיף. זה יכול לשמש גם עבור שהכלים בצפון או qPCR בזמן אמת. ספייק-אין פקדים שתוכננה במיוחד עבור טכנולוגיות microarray הינם גם זמינים (ראה הטבלה של חומרים).
הערה: לאחר ספין הראשונית, המדגם צריך להפריד לתוך 3 שכבות - שכבת אורגני האדום התחתון, לאטמוספרה לבן/ורוד באמצע, שכבה מימית ברורה על העליונה (איור 3).
הערה: תיזהר שלא להפריע את לאטמוספרה במהלך תהליך זה. זה בסדר להשאיר חלק השבר מימית. עדיף להשאיר חלק השבר מימית מאשר כדי לכלול גם כמה מן הרבדים לאטמוספרה, ככוללת את לאטמוספרה שכבה לזהם את הרנ א עם ה-DNA. השכבה המימית יהיה כ חצי נפח הראשונית, אז על 0.9 מ ל אם התערובת פתרון/כלורופורם פנול-guanidine isothiocyanate היה 1.8 מ.
הערה: התוצאה תהיה גלולה צפוף, מוצק קל לעקוב אחרי השלבים ספין שאחריו.
הערה: טיפ pipet משוחרר החזיק ביד יכול לשמש כדי להסיר עודפי אתנול. אם בגדר RNA מופרע, אבל לא יימחקו, החוקר יכול לחזור על העובדות, להסיר את תגובת שיקוע שוב. להימנע מהשלכת בגדר כמו זה ידרוש החוקר לחזור על התהליך כולו.
הערה: בגדר RNA היא פחות קומפקטית בשלב זה ונוטה לנוע. . לנהוג במשנה זהירות בעת טיפול בגדר בנקודה זו כדי להימנע מאובדן את הרנ א
4. ניתוח של התעתיק שפע
- לכמת RNA ולבדוק RNA באמצעות ספקטרופוטומטרים של טוהר.
הערה: היחס של ספיגת ב-260 nm 280 ננומטר צריך להיות כ 2.0 עבור ה-RNA. - ניתוח ה-RNA עם ג'ל agarose 1% או טכנולוגיה שוות ערך להמחיש את מידת השפלה.
הערה: שתי להקות ייצוג 18S ויכין 28S rRNA צריך להיות בבירור (איור 4). אם הלהקות האלה אינם גלויים, עשוי להיות מושפל את הרנ א. טיפים ירי צרות RNA השפלה ניתנים לדיון. - צג שפע תעתיק aliquots שנאספו של RNA לעומת עלה בתקן פנימי באמצעות מיקרו-מערכים15, ה-RNA-Seq16, qPCR בזמן אמת17או18לחומה הצפונית.
- לקבוע את השפע עבור כל תעתיק בכל נקודה בזמן לעומת פקד עלה בהשפע ידוע.
הערה: עבור מיקרו-מערכים, הערכים יהיה עוצמות קרינה פלואורסצנטית. עבור שהכלים בצפון, להקות על הסרט רנטגן ניתן לכמת. עבור qPCR בזמן אמת, התעתיק שפע יכול להיקבע by comparison with סטנדרטים ידועים עם 2- σσCT שיטת19. עבור ה-RNA-Seq, ניתן לקבוע ערכים מנורמל כמו FPKM או קטעים מפוצלים kilobase של אקסון לכל מיליון קריאות ממופה. עבור isoform ספציפיים הניוון, RNA-Seq נתונים ניתן לנתח באמצעות מתודולוגיות isoform-aware כגון DEXSeq20. Isoform ספציפיים הניוון נקבעים בצורה הטובה ביותר עם ה-RNA-תת סעיף. אם הם נקבע עם microarray נתונים, עליך להיות מנותח הנתונים על בסיס בדיקה-מאת-בדיקה ולא על בסיס ג'ין-מאת-גן. האנליסט עליך להיות זהיר בעת פירוש מידע מתוך מספר מצומצם של הגששים. למשל, ייתכן הגששים 5 או פחות כי הם אינפורמטיבי אודות isoform מסוים. במקרה זה, האנליסט יהיה צורך לקבוע אם ההתנהגות של רגשים אלו הוא עקבי מספיק כך שהתוצאות אמינות.
- לקבוע את השפע עבור כל תעתיק בכל נקודה בזמן לעומת פקד עלה בהשפע ידוע.
- לבצע qPCR בזמן אמת על ה RNA מבודד17 הדגימות שנאספו כדי לנתח במהירות רקובה גנים, כמו c-Myc ו גן לאט רקובה כמו GAPDH, לצבור אמון זה ריקבון התעתיק המחירים זוהו באופן מדויק.
הערה: לאישור נוסף, qPCR בזמן אמת isoform ספציפיים הגששים ניתן להיות שפותחה, המשמשת לפיקוח של השפע איזופורמים ספציפיות לאורך זמן21.
5.נחישות קבוע קצב הריקבון
- עבור כל timepoint, התמרת יומן הערכים שפע עבור כל תעתיק (גנים ספציפיים או isoform ספציפי).
הערה: הפיכת יומן הערכים יהיה להמיר עקומות דעיכה מעריכית קווים שניתן להכניס עם מודל ליניארי דעיכה22. - פרופיל ביטוי כל תעתיק (גנים ספציפיים או isoform ספציפי) מודל ליניארי דעיכה מתאים. הנוסחה לחישוב מודל כזה היא f(t) = C - r * t. במשוואה הזו, C הוא קבוע המייצג את הסכום ההתחלתי של תעתיק r הוא הקצב של ירידה, t הוא הזמן מאז תחילת הניסוי. מן המשוואה, לקבוע את קצב הדעיכה כמו r*ln(10) (ראו התייחסות11).
הערה: חבילת התוכנה maSigPro היא גישה מבוססת-רגרסיה שנועדו לזהות פרופיל גנטי משמעותי ביטוי הבדלים זמן הקורס נתונים23. דוגמאות קוד תוצאות עבור maSigPro הינם זמינים: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - לסנן גנים להיכשל מתאים מודל יומן-ליניארי דעיכה. זה יכול להתבצע עם מבחן-ANOVA F.
הערה: במבחן F הוא מבוסס סטטיסטיקת F, אשר מוגדר וריאציית בין המדגם מחולק וריאציית בתוך דגימות. תקן ערכי-p להשוואות מרובות על-ידי החלת ליניארי step-up בנימיני, הוכברג גילוי שקר הליך24. Q-ערך הגדול מ- 0.05 עם F-המבחן יכול לשמש כמו ניתוק עבור גנים להיכשל מתאים מודל יומן-ליניארי דעיכה. - לבצע מבחן-ANOVA F כדי לקבוע תעתיקים המונח אינטראקציה משמעותית בין מחזור התא קטגורית תנאי הזמן (גילוי שקר קצב, פד ר < 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו דיווחו בעבר כי התוצאות של microarray ניתוחים של התעתיק הניוון ב מתרבים ומגדלי עכבות-קשר fibroblasts אנושי ראשוני על קורס 8 שעות זמן12. רשימת גנים עם שינוי משמעותי ביציבות התעתיק השוואת fibroblasts מתרבים ומגדלי עכבות-קשר הינו מסופק משלים טבלה 1. עוצמות קרינה פלואורסצנטית בזמן אפס ומעלה קורס זמן לאחר טיפול ActD הינם מסופקים. גנים נכללו ברשימה על-ידי קביעת הגנים יש מדרונות שונה באופן משמעותי בתנאים מתרבים ומגדלי עכבות-קשר באמצעות מבחן-ANOVA F. דוגמאות של גנים דעיכה שונים בבתי fibroblasts מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית מוצגים באיור5.
איור 1 : סכימטי של פרוטוקול להקמת צלחות מתרבים ומגדלי עכבות-קשר לניתוח כמובן זמן ActD. תיאור על בסיס יום יומי של הצעדים הדרושים ליצירת תרביות של תאים לטיפול ActD מסופק, בהנחה timepoints ארבע ישמש עבור מסלול הזמן. פשטות, לוח אחד מוצג לכל timepoint, אך ניתן להוסיף לוחות נוספים כדי ליצור משכפל ביולוגי. ניתן להתאים את הפרוטוקול גם להוסיף עוד צלחות של תאים אם timepoints יותר מ-4 הם הרצויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : תיאור סכמטי של מסלול הזמן ActD ודעיכה לדרג חישובים של השבתה הדרגתית בהשוואה מתרבים fibroblasts אנושי. השבר הצפוי של mRNAs שנותרו לאורך זמן תעתיק היפותטי לאחר טיפול עם מעכב תעתיק מוצג. להלן, חלקות מדגם של השבר של mRNA הנותרים לאורך זמן הינם מסופקים עבור גנים יציבים יותר ב השבתה הדרגתית מאשר תאים מתרבים, ואת הגנים יציבים ב מתרבים יותר תאים השבתה הדרגתית. עבור כל לנקודות, ערך בודד מוצג עבור בהירות. בפרוטוקול בפועל, יהיו שלושה datapoints עבור כל timepoint. דמות זו שונתה מתוך עבודת הדוקטורט של אליזבת פנדר ג'ונסון עם הסכמתה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : צילומים של ערבוב ריאגנט isothiocyanate פנול-guanidine, כלורופורם לפני ואחרי צנטריפוגה. התערובת מוצג כאשר ריאגנט isothiocyanate פנול-guanidine כלורופורם בתחילה משולבים, אחרי ערבוב ואחרי צנטריפוגה. לאחר שהתערובת הוא centrifuged, שלב התחתון, אשר הוא אדום, הוא השלב אורגני. לאטמוספרה באמצע הוא בהיר ולבן. השלב העליון הוא השלב מימית וזה ברור. ה-RNA הוא בשלב מימית, אשר אמור להיאסף עם פיפטה של משקעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : ג'ל מדגם RNA לפקח על איכות ה-RNA- איור של ג'ל RNA מציג דוגמאות עם RNA ללא פגע. RNA תקין יש להקות בולטות עבור rRNAs 28S ו- 18S. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : דוגמאות של גנים דעיכה שונים בבתי מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית. עוצמות קרינה פלואורסצנטית (ביטוי גנים) במשך הזמן מוצגים עבור ארבעת הגנים ריקבון אחרת ב מתרבים לעומת fibroblasts השבתה הדרגתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלים טבלה 1: גנים ספציפיים עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב fibroblasts מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית. הנתונים הם fibroblasts שסופקו בזמן אפס ומעלה קורס זמן לאחר טיפול ActD מתרבים, קשר-עכבות. ערכים P, q ערכים, גילוי שקר המחירים הינם מסופקים. טבלה מודפס מהפרסום המקורי שלה ב- BMC גנומיקה12. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תרדמה יכולה להיגרם על ידי אותות חיצוניים כולל נסיגה של mitogens או סרום, חוסר הידבקות תאים, וניגוד קשר. סימן דיכוי, אחת השיטות אפשריות מרובים עבור גרימת תרדמה, הוא תהליך מאוד אבולוציונית שנשמרת שבו תאים יציאה מחזור התא proliferative בתגובה מגע לתא. אנו מתמקדים כאן סימן דיכוי כדוגמה שיטה לזירוז תרדמה. מחקרים קודמים דיווחו כי קשר תא-cell יכול להשפיע על microRNA להן25, לכן, התוצאות לספק מידע על שיטת תרדמה אחת, נדרשים מחקרים נוספים כדי לקבוע אילו שינויים הקשורים תרדמה למשל.
השתמשנו fibroblasts דיפלואידי אנושי ראשוני זה אנחנו מבודדים מן העור neonatal. יזומות ניסויים אלה עם fibroblasts זה היו passaged פחות מ 10 פעמים. אנחנו שנמחקו מאוחר יותר מעבר fibroblasts, מכיוון שהם senesce. בעוד פרוטוקול זה מתמקד fibroblasts עורי מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית, ההליכים המתוארים ניתן לעקוב אחר קצב הניוון סוגים שונים של תאים ובמצבים שונים.
אנחנו פיקוח mRNA דעיכה המחירים הגנום כולו באמצעות קורס מגופים זמן שעתוק. קורסים מגופים זמן הם השיטה הנפוצה ביותר עבור סופגת mRNA דעיכה של mRNA שעתוק כדי לחשב את ה-mRNA מחצית החיים1,26. בשיטה המתוארת כאן, ActD, תרופה כי מכלולי עם הטופס-B של ה-DNA כדי לחסום את התארכות של RNA פולימראז II, משמש כדי לעצור שעתוק של mRNAs27. ניתן לקבוע את הקצב בו. התמלילים הדירי שפע במשך תקופה 8 שעות כמו קצב הדעיכה של התעתיק.
מגבלה חשובה של גישות ActD לניטור דעיכה התעתיק הוא כי ActD מונעת שעתוק הכללית, אשר ישפיעו על יכולת הקיום התאים. זה יש לשמור בראש בעת פירוש נתונים מבוססי ActD, כפי הניוון נקבעים בתאים יותר לחוצים יותר למצבן המקורי. חשש נוסף חשוב הוא כי ההשפעות של ActD עשויות להיות שונות עבור תאים בארצות שונות, כולל מתרבים לעומת fibroblasts עכבות-קשר. גישה אחת על מזעור תופעות הלוואי של הטיפול ActD הוא לשמור קורסים זמן קצר ב משך. מסיבה זו, בחרנו כמובן זמן של 8 שעות.
ישנן גישות אלטרנטיביות כדי ActD עבור ניטור התעתיק דעיכה המחירים28,29. זני שמרים עם הרגיש RNA פולימראז II אללים שימשו כדי לפקח על התעתיק דעיכה המחירים30. וריאציה על גישה זו בשם "העוגן-משם" שימש בשמרים על מנת להשיג מותנה דלדול של RNA פולימראז II בתגובה rapamycin טיפול31,32. זה גם אפשר לעקוב אחר דעיכה בתאים עם שעתוק פעיל. למשל, אורציל thio שהוחלפו נוקלאוטידים שיוכל להיכנס לתוך התאים שולבו mRNA, לאחר מכן זוהה33,34,35. עם גישה זו, ניתן לקבוע הקצב שבו תעתיקים שונים הם מסונתז בתאים ממשיכים לסנתז mRNA. גישות כאלה יש יתרון משמעותי על פני טיפול ActD כי הם אינם רעילים. מניסיוננו, אולם, יכולה להיות השתנות בשחזור של הפרוטוקולים באמצעות שיטות אלה. טיפול ActD היא גישה לשחזור וברורות לניטור התעתיק דעיכה.
כמה צעדים בפרוטוקול המסופקים הם קריטיים להצלחה שלה. נושא חשוב אחד מונע RNA השפלה בתקופת הבידוד RNA. שלב 4.1, הרנ א צריך לפקח על השפלה. אם הרנ א אינו מכיל שתי הפסגות ברורה עבור rRNAs 18S, 28S (איור 4), זהו סימן שאירעה התעתיק השפלה. מכשירים מסוימים מספקים מספר שלמות RNA (RIN) ציונים בטווח שבין 1 ל 10. דוגמאות עם רין ציונים בטווח של 7-10 מקובלים לצורך ניתוח נוסף. אם הרנ א יורד, אז זה חשוב לנקוט בעוד אמצעי זהירות כדי למנוע RNA השפלה, כגון הבטחת כי פתרונות, sterileware הם נטולי RNase, וכי כפפות שחוקים בעת טיפול סיליקון עבור ה-RNA. מים יכולים להיות pretreated עם 0.1% diethyl pyrocarbonate (DEPC), מתפשט לפחות 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס, ולא בלוק לפחות 15 דקות הערה DEPC הזה ניתן להשתמש עם מאגרים מבוססי טריס. ניתן להוסיף RNase פתרונות מטהר יכול לשמש גם כדי להסיר RNase משטחי עבודה, צנטריפוגות, פיפטות ואת ריאגנטים המעכבות RNases דגימות.
עוד צעד קריטי היא ההפרדה שלבי הפתרון isothiocyanate פנול-guanidine. זה חשוב להבטיח רק את השלב העליון של RNA עיבוד. אם ה-RNA שנוצר כוללת פנול שיורית, היחס של ספיגת-230 260, 280 ננומטר לא יהיה יחס 1:2:1 כצפוי. גבוה יותר מאשר ספיגת הצפוי ב- 230 nm יכולה להצביע על זיהום פנול. במקרה זה, ה-RNA יכול להיות אתנול זירז שוב ושטף מספר פעמים נוספות כדי להסיר כל פנול שיורית.
לבסוף, כאשר ה-RNA הוא מגורען והסיר תגובת שיקוע, בגדר יכול להיות דביק, רזה ובעל מופרע בקלות. בנקודה זו, חשוב לנקוט בזהירות לערוף את הנוזל. זה עשוי להיות חשוב להמחיש את הצינור עם תאורה טובה לאתר בגדר. ולוודא שזה לא מופרע. גליקוגן נוסף יכול לעזור כדי להבטיח שבגדר מוצגת בשלב זה.
הבחירה של נקודות זמן על מסלול הזמן הריקבון הוא גם נושא חשוב שיש לקחת בחשבון. ואילו timepoints ארבע בחרנו אפשרה לנו לעקוב אחר דעיכה עבור מעל 10,000 גנים, גנים מסוימים לא משמעותית ריקבון במהלך הזמן 8 שעות. אם תעתיקים קצרת ימים נמצאים בעדיפות גבוהה, החוקרים ייתכן שתרצה להוסיף אוספים נוספים לדוגמה לפני 120 דקות, למשל בכל 30 דקות. להערכה טובה יותר של הפרוטוקולים מאריכים, החוקרים ייתכן שתרצה להוסיף אוספים נוספים מדגם timepoints מאוחר יותר.
עוד נושא פוטנציאלי עלול לגרום הניוון בצע את ההתפלגות הצפויה. למשל, ייתכן שיש יותר מדי או מעט מדי גנים מציג יומן-ליניארי דעיכה לדרג מעל 8 שעות. במקרה כזה, מומלץ לעקוב אחר קצב הניוון של גנים אשר ידועים להיות קצר או חיים ארוכים על מנת לקבוע אם הם לעקוב אחר דפוס הצפוי.אם הגנים יש מדרון חיובית ולא שלילית לאורך זמן, הם יכולים להיות כלולים ניתוח נוסף שכן הוא לא מפגין קצב יומן-ליניארי דעיכה. בעיית הסופי יכול להיווצר אם התאים שני תנאים נערכת השוואה שונים התגובות ActD כך גנים רבים ריקבון מהר יותר במצב אחד. במקרה זה, עשוי להיות שימושי להפנות לא רק ההבדל קצב הדעיכה בין שתי המדינות, אלא גם שולטת בספייק שאנו מציעים כולל לפני ה-RNA בידוד כדי לספק מידע על הניוון מוחלט בשתי המדינות.
היכולת לפקח על התעתיק הניוון בין תאים מתרבים ומגדלי השבתה הדרגתית או כל שני מצבים דומים יש פוטנציאל כדי לספק עוד תובנות חשיבות התעתיק דעיכה בוויסות שינויים פיזיולוגיים. היישומים כוללים תאים עם ובלי oncogenic הפעלה, לפני ואחרי הזדקנות ביולוגית או זיהום ויראלי, עם ובלי נוקאאוט של גן מסוים, או בשני מצבים שונים של בידול. הממצאים יכולים להיות יחד עם ה-RNA-Seq כדי לספק מידע אודות שינויים הספציפיים isoform ב תעתיק הניוון, אשר עשוי לספק תובנה השינויים בביטוי isoform נצפתה כמו תאים עוברים מעברים פיזיולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אינטרסים מתחרים לא לחשוף.
Acknowledgments
HAC היה המלומד במילטון אי קסל של קרן אלן ריטה (http://www.ritaallenfoundation.org). עבודה זו מומן על ידי מענקים HAC מן המרכז הלאומי הכללי לרפואה למדעי מענק הצטיינות P50 GM071508 (חוקר פרטי דוד בוטשטיין), 2007RSGl9572 גרנט חברת פארמה הקרן, הלאומית למדע קרן OCI גרנט-1047879 דוד לאוגוסט, המכון הלאומי של גנרל רפואי מדעי R01 GM081686, המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית R01 GM0866465, אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר בתאי גזע CTSI המרכז לבריאות/UCLA NIH של הנשים איריס חזן גרנט UL1TR000124, והחברה לוקמיה לימפומה. מחקר דיווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לסרטן של מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרס מספר P50CA092131. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. HAC הוא חבר אלי & אידית במרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית & מחקר תאי גזע, המכון לביולוגיה מולקולרית באוניברסיטת UCLA, התוכנית באצירת לביואינפורמטיקה באוניברסיטת UCLA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
