Summary
Vi beskriver ett protokoll för generering frodas och quiescent primära mänskliga dermal fibroblaster, övervakning avskrift decay priser, och att identifiera differentially ruttnande gener.
Abstract
Rofylld är en tillfällig, reversibel stat där cellerna har upphört celldelning, men behålla förmågan att föröka. Flera studier, däribland vår, har visat att rofylld är associerade med omfattande förändringar i genuttryck. Några av dessa förändringar uppstå genom förändringar i nivån eller aktiviteten för spridning-associerade transkriptionsfaktorer, såsom E2F och MYC. Vi har visat att mRNA förfall kan också bidra till förändringar i genuttryck mellan prolifererande och quiescent celler. I detta protokoll beskriver vi förfarandet för att inrätta prolifererande och quiescent kulturer av mänskliga dermal förhud fibroblaster. Sedan beskriver vi förfarandena för att hämma nya transkription i prolifererande och quiescent celler med Actinomycin D (ActD). ActD behandling representerar en okomplicerad och reproducerbar metod att separera nya transkription från avskrift förfall. En nackdel med ActD behandling är att tid kursen måste begränsas till en kort tid eftersom ActD påverkar cellernas viabilitet. Avskrift nivåer övervakas över tid att bestämma avskrift decay priser. Detta förfarande möjliggör identifiering av gener och isoformer som uppvisar differentiell förfall i frodas kontra quiescent fibroblaster.
Introduction
Steady-state nivåerna av avskrifter återspeglar både avskrift syntes och avskrift decay bidrag. Reglerad och samordnad avskrift förfall är en viktig mekanism för kontroll av biologiska processer1,2,3,4. Avskrift decay priser har exempelvis visat att bidra till den tidsmässiga serien händelser efter aktivering av inflammatorisk cytokin tumörnekrosfaktor5.
Vi har tidigare visat att övergången mellan spridning och rofylld i primära mänskliga fibroblaster är förknippad med förändringar i avskrift nivåerna av många gener6. Några av dessa förändringar återspeglar skillnader i aktiviteten av transkriptionsfaktorer mellan dessa två stater.
Förändringar i en avskrift decay rate kan också bidra till förändringar i uttrycket av en utskrift i två olika stater7,8. Baserat på våra tidigare resultat att övergången mellan spridning och rofylld är förknippad med förändringar i nivåerna av flera mikroRNA9, frågade vi om det också finns ett bidrag från differentiell avskrift decay förändringar i genuttryck i frodas kontra quiescent fibroblaster.
För att övervaka avskrift stabilitet, fastställt vi graden av förfalla av avskrifter genome-wide i frodas kontra quiescent celler. För att uppnå detta, övervakas vi decay priser i frodas kontra quiescent fibroblaster genom att införa en hämmare av nya transkription och övervakning andelen som enskilda avskrifter försvunnit med tiden. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att vi kommer att kunna fastställa vilken förfall för dessa avskrifter separat från den kurs som de är jämfört med metoder som enkelt övervakar övergripande genuttryck, genom att hämma ny avskrift syntes, transkriberas.
ActD behandling för att hämma nya transkription och fastställa avskrift förfall har tillämpats framgångsrikt i flera tidigare studier. ActD har använts för att analysera betydelsen av RNA stabilitet i förändringar i avskrift överflöd som följd av behandling med pro-inflammatoriska cytokiner5. Ett liknande tillvägagångssätt har också använts till analysera skillnaderna i avskrift decay rate i frodas kontra differentierade C2C12 celler som de antar en differentierad muskel fenotyp10. Ett annat exempel globala mRNA halveringstider har också upptäckts i pluripotenta och differentierade mus embryonala stamceller11. I dessa exempel har mRNA förfall visat sig vara viktigt för att reglera avskrift överflöd och för övergången av celler till annan cell staterna.
Tillämpa de metoder som beskrivs nedan, upptäckte vi förändringar i avskrift decay priser i ungefär 500 gener när man jämför fibroblaster i prolifererande och quiescent staterna12. I synnerhet upptäckte vi att målen av mikroRNA miR-29, som är nedreglerade i quiescent celler, stabiliseras när celler övergången till rofylld. Här beskriver vi den metod vi använde för att fastställa förfall i prolifererande och quiescent celler. Denna metod är användbar för att jämföra globala mRNA decay priser i två olika men liknande förhållanden när information om snabbt ruttnande gener söks. Det kunde också användas för att behandla andra frågor såsom effekten av cell kultur villkor för avskrift förfall, exempelvis i två dimensioner kontra tre dimensionell kulturer. Decay priser kan vara beslutsam genome-wide med metoder såsom microarrays eller RNA-följande punkter alternativt, realtids qPCR eller Northern blotting kan användas för att fastställa förfall på basis av gen-av-gen eller isoform-av-isoform. Dessa priser kan sedan användas för att beräkna halveringstiden för varje övervakade gen och identifiera gener med förfall priser som skiljer sig i två villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment beskrivs godkändes av institutionella granskning styrelser vid Princeton University och University of California, Los Angeles.
1. Förbered prolifererande och kontakt-hämmade fibroblaster för ActD gången kurs
Obs: Detta protokoll använder en timecourse med fyra tidpunkter. Tre biologiskt oberoende prover kan tas ut per tidpunkt genom att samla olika vävnadsodling plattor i ett experiment, eller experimentet kan upprepas flera gånger med olika kulturer av celler. Vår erfarenhet ger en 10 cm (diameter) vävnadsodling maträtt (en tallrik) tillräcklig RNA för analys. Om det behövs kan flera vävnadsodling rätter slås samman för varje prov att öka antalet celler vid varje tidpunkt. Dessutom kan samma experiment utföras med fibroblaster som isolerats från olika individer som verkligt oberoende biologiska replikerar.
- Upprätta prolifererande och quiescent kulturer av celler för avskrift decay analys. För prolifererande celler, dela celler varje tre dagar medan de kontakt-hämmade cellerna blir kontakt-hämmade.
- För kontakt-hämmade cellerna, ändra medium varannan dag i 7 dagar. Dela upp de prolifererande cellerna 2 dagar innan kontakt-hämmade fibroblaster finns tillgänglig för avhämtning. Ett exempel på en cell kultur systemet visas i figur 1. De återstående stegen i det här avsnittet tillhandahåller en detaljerad protokoll för upprättande och dela upp celler.
- Isolera primära dermal fibroblaster från neonatal hud enligt fastställda protokoll13. Passagen fibroblaster att säkerställa en homogen befolkning.
Obs: Fibroblaster kan frysas och tinas, om det behövs. - Tina eller replate fibroblaster, om det behövs. Växa fibroblaster i DMEM med 10% serum under sterila förhållanden i en vävnadskultur inkubator vid 37 ° C och 5% CO2. Använd fibroblaster som har odlats för färre än 10 passager. Fibroblaster ska vara < 80% konfluenta dagen i dela upp celler att göra prolifererande och quiescent populationer.
- Att dela en vävnadskultur platta i flera plattor, prewarm PBS, trypsin och medium med serum i ett vattenbad på 37 ° C i 20 min.
- Aspirera eller använda en Pipettera ta bort mediet från varje vävnadsodling platta med celler att vara replated.
- Pipettera varma PBS på varje tallrik (10 mL av lösning för en 150 mm platta, 5 mL lösning för en 100 mm platta, 2 mL för en brunn 6 väl platta) och 1 mL för en väl 12 väl platta.
- Aspirera eller Pipettera ta bort PBS från varje vävnadsodling platta.
- Försiktigt Pipettera 1 x Trypsin-EDTA på varje tallrik (8 mL av lösning för en 150 mm platta, 3 mL lösning för en 100 mm platta, 2 mL för en brunn 6 väl platta och 1 mL för en väl 12 väl platta).
Se 1 x Trypsin-EDTA genom att späda ut steril 10 x Trypsin-EDTA i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Final 1 x lösningen bör vara 0,05% trypsin och 0,02% EDTA. - Inkubera trypsin med celler i 5 min.
- Knacka försiktigt på plattan för att rubba celler från plattan.
- Pipettera att resuspendera cellerna till en enda cellsuspension.
- Överföra celler i trypsin lösning till ett koniskt rör som innehåller samma volym av DMEM med 10% serum (8 mL lösning för en 150 mm plåt, 3 mL lösning för en 100 mm platta, 2 mL för en brunn 6 väl platta och 1 mL för en brunn av en 12 väl plåt).
- Snurra ner cellerna vid 4 ° C i 5 minuter vid 1 000 x g ta bort trypsin.
- Återsuspendera cellerna i en lämplig volym av medium och räkna med en hemacytometer att bestämma cellkoncentrationen.
- Utsäde 5 x 105 per 100 mm vävnadsodling platta för frodas och kontakt-hämmade celler.
- Med den här metoden, fastställa de prolifererande och kontakt-hämmade prover som behövs för analys (figur 1).
2. ActD tid kursen
- Återsuspendera ActD på ett lager koncentration av 1 mg/mL (för 1 mg ActD, Använd 950 µL sterilt PBS och 50 µL sterilt DMSO).
Obs: Frysta stamlösningar av ActD bör vara stabil för en månad vid-20 ° C. Utspädda lösningar bör kasseras och inte lagras för vidare användning. - Lägga till ActD till lämplig volym av förvärmd medium för alla biologiska replikera cellkultur plattor som sattes upp för 0, 120, 240 och 480 min tidpunkter (figur 2). Lägga till ActD med en koncentration på 15 µg per mL medium. Blanda väl, aspirera ut det gamla mediet och lägga till ActD-innehållande medium i cellerna.
- För ett bestånd som 1 mg/mL, tillsätt 15 µL ActD för varje mL medium, t.ex., för 10 mL medium för en 100 mm platta, tillsätt 150 µL ActD.
- Att samla in noll tidpunkt provet, aspirera försiktigt bort ActD medium, och Pipettera föruppvärmd PBS på cellerna. Pipettera 10 mL lösning för en 150 mm plåt, 5 mL lösning för en 100 mm platta, 2 mL för en brunn 6 väl platta och 1 mL för en väl 12 väl platta.
- Aspirera försiktigt eller Pipettera off till PBS.
Obs: Alla åtgärder som rör RNA isoleringen bör utföras med RNase-gratis vatten, RNase-fri mikrocentrifugrör och RNase-fri pipetter. Handskar bör bäras och bytte ofta när du arbetar med RNA. - Lägga till fenol-guanidin isotiocyanat lösning (1 mL/10-cm platta med 4 x 105 till 4 x 107 celler) direkt vävnadsodling plattan.
Obs: Fenol-guanidin isotiocyanat är en monofasiska lösning som håller RNA kvalitet medan lyseringslösning cellerna och separera RNA, DNA och protein från varandra.
Varning: Fenol och guanidin isotiocyanat är frätande. Använda lämpligt skydd. - Pipettera en fenol-guanidin isotiocyanat lösning-cell blandningen upp och ner flera gånger att göra en homogen blandning.
Obs: Fenol-guanidin isotiocyanat lösning lysate kan lagras vid 4 ° C över natten eller vid-20 ° C i upp till ett år. - Samla varje tidpunkt efter lämplig mängd tid gått med den metod som beskrivs i steg 2.3-2.6.
3. isolering av Total-RNA från fenol-guanidin isotiocyanat lösning Lysate
- Inkubera prover i rumstemperatur i 5 min att säkerställa fullständig upplösning av RNA-proteinkomplex.
Obs: Stegen av protokollet fenol-guanidin isotiocyanat lösning kan utföras vid rumstemperatur om inget annat anges. - Införa spike-i kontroll avskrifter som kan upptäckas med den metod som används.
Obs: Den externa RNA kontroll consortium (ERCC) spike-i kontroll mix14 har utformats särskilt för som spike-i kontroll för RNA-följande punkter Det kan också användas för Northern blotting eller realtids qPCR. Spike-i kontroller särskilt utformade för microarray technologies är också tillgängliga (se Tabell för material).
Observera: Efter första spin, provet bör separat i 3 lager - en röd ekologisk lager på botten, en vit/rosa interphase i mitten och en tydlig vattenskiktet på topp (figur 3).
Obs: Var noga med att inte störa interphasen under denna process. Det är okej att lämna en del av den vattenhaltiga fraktionen. Det är bättre att lämna en del av den vattenhaltiga fraktionen än att även omfatta några av de interphase lagrarna, som inklusive interphasen lager skulle förorena RNA med DNA. Vattenskiktet kommer att vara ungefär hälften av den ursprungliga volymen, så ungefär 0,9 mL om fenol-guanidin isotiocyanat lösning/kloroform blandningen var 1,8 mL.
Obs: Detta kommer att resultera i en tät, fast pellet som är lätt att övervaka efter spin stegen som följer.
Obs: En lös Pipettera tips höll i handen kan användas att ta bort överflödig etanol. Om RNA pelleten är störd, men inte kasseras, kan utredaren upprepa spin och avlägsna supernatanten igen. Undvik att kasta pelleten eftersom detta kommer att kräva utredaren att upprepa hela proceduren.
Obs: RNA pelleten är mindre kompakt i detta steg och tenderar att flytta. Var extra försiktig vid hantering av pelleten på denna punkt för att undvika att förlora RNA.
4. analys av avskrift överflöd
- Kvantifiera RNA och kontrollera RNA för renhet med en spektrofotometer.
Obs: Förhållandet mellan absorbansen vid 260 nm till 280 nm bör vara cirka 2.0 för RNA. - Analysera RNA med en 1% agarosgel eller en motsvarande teknik för att visualisera graden av nedbrytning.
Obs: Två tydliga band som representerar 18S och 28S rRNA bör vara klart synliga (figur 4). Om dessa band inte är synliga, kan RNA brytas. Problem med skytte tips för RNA nedbrytning tillhandahålls i diskussionen. - Ordningsmanen avskriften överflöd i de insamlade alikvoter av RNA jämfört med spetsade-i intern standard använder microarrays15, RNA-Seq16, realtids qPCR17eller Northern blotting18.
- Avgöra överflödet för varje utskrift vid varje tidpunkt jämfört med en spetsade-i kontroll av kända överflöd.
Obs: För microarrays, kommer värdena att fluorescens stödnivåer. För norra blotting, kan band på röntgenfilmen kvantifieras. För realtids qPCR, kan avskrift överflöd bestämmas genom jämförelse med kända standarder med 2- σσCT metod19. För RNA-Seq, kan normaliserade värden bestämmas som FPKM eller fragment per kilobase av exon per miljon läsningar mappas. För isoform-specifika decay priser, kan RNA-Seq data analyseras med isoform-medvetna metoder såsom DEXSeq20. Isoform-specifika decay priser bestäms bäst med RNA-följande punkter Om de är att vara beslutsamma med microarray data, måste sedan data analyseras på en sond-av-probe grund i stället för en gen-av-gen grund. Analytikern måste vara försiktig när man tolkar information från ett begränsat antal sonder. Det kan exempelvis finnas 5 eller färre sonder som är informativ om en särskild isoform. I det här fallet måste analytikern att avgöra om beteendet hos dessa sonder är tillräckligt konsekvent så att resultaten är tillförlitliga.
- Avgöra överflödet för varje utskrift vid varje tidpunkt jämfört med en spetsade-i kontroll av kända överflöd.
- Utföra realtids qPCR på isolerade RNA17 i de insamlade proverna att analysera snabbt ruttnande gener, som c-Myc och en långsamt ruttnande gen som GAPDH, att vinna förtroende det avskrift förfalla priser upptäcktes korrekt.
Anmärkning: För ytterligare bekräftelse, isoform-specifika realtids qPCR sonder kan utvecklas och används för att övervaka överflödet av specifika isoformer över tid21.
5.Decay Rate konstant bestämning
- För varje tidpunkt, log-transform överflöd värdena för varje utskrift (gen-specifika eller isoform-specifika).
Obs: Log-omvandla värdena kommer att konvertera exponentiell förruttnelse kurvor till raderna som kan passa med en linjär decay modell22. - Passa uttrycket profil för varje utskrift (gen-specifika eller isoform-specifika) till en linjär decay modell. Formeln för en sådan modell är f(t) = C - r * t. I denna ekvation, C är en konstant som representerar utgångsbeloppet för en utskrift, r är minskningstakten och t är tiden i början av experimentet. Från denna ekvation, fastställa vilken förfall som r*ln(10) (se referens11).
Obs: Programpaketet maSigPro är en regression-baserad metod för att upptäcka betydande gen uttryck profil skillnader i tid kursen data23. Exempelkod och resultat för maSigPro finns på: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf. - Filtrera bort gener som inte passar en log-linjära decay modell. Detta kan åstadkommas med en ANOVA F-test.
Obs: F test är baserat på den F-statistik, som definieras som variationen mellan sampelmedelvärden dividerat med variationen inom prover. Korrigera de p-värdena för multipla jämförelser genom att tillämpa den linjära step-up Benjamini och Hochberg falsk upptäckten förfarandet24. En q-värde som är större än 0,05 med F-test kan användas som en cutoff för gener som inte passar en log-linjära decay modell. - Utföra en ANOVA F-test för att avgöra avskrifter med en signifikant interaktion mellan en kategorisk cellcykeln skick och tid (falsk upptäckten hastighet, FDR < 0,05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har tidigare rapporterat resultaten av microarray-analyser av avskrift decay priser i prolifererande och kontakt-hämmade primära mänskliga fibroblaster över en 8-timmars tid kurs12. En lista av gener med en betydande förändring i avskrift stabilitet jämföra prolifererande och kontakt-hämmade fibroblaster tillhandahålls i kompletterande Tabell1. Fluorescens stödnivåerna helst noll och under en tid efter ActD behandling tillhandahålls. Gener fanns med på listan genom att bestämma de gener som har betydligt olika backar i prolifererande och kontakt-hämmade förhållanden med hjälp av en ANOVA F-test. Exempel på gener med olika decay priser i prolifererande och quiescent fibroblaster visas i figur 5.
Figur 1 : Schematisk av protokollet för att fastställa prolifererande och kontakt-hämmade plattor för ActD gången kursen analys. En dag för dag Beskrivning av nödvändiga åtgärder för att upprätta kulturer av celler för ActD behandling ges, förutsatt att fyra tidpunkter kommer att användas för tidsförloppet. För enkelhetens skull en platta visas per tidpunkt, men ytterligare plattor kan läggas för att generera biologiska replikat. Protokollet justeras också för att lägga till fler plattor av celler om mer än fyra tidpunkter önskas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Schematisk bild av förfall och ActD tidsförlopp beräkningarna i quiescent jämfört med prolifererande mänskliga fibroblaster. Den beräknade fraktionen av mRNA kvar över tid för en hypotetisk avskrift efter behandling med en transkriptionell hämmare visas. Nedan, provytor för fraktionen av mRNA återstående tiden tillhandahålls för gener som är mer stabil i quiescent än prolifererande celler och gener som är mer stabil i frodas än quiescent celler. För varje datapoint visas endast ett värde för tydlighet. I själva protokollet, kommer det att finnas tre datapunkter för varje tidpunkt. Denna siffra har ändrats från Elizabeth Pender Johnsons doktorsavhandling med hennes samtycke. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Fotografier av blanda fenol-guanidin isotiocyanat reagens och kloroform före och efter centrifugeringen. Blandningen visas när den fenol-guanidin isotiocyanat reagens och kloroform initialt kombineras, efter blandning och efter centrifugering. Efter blandningen centrifugeras, är den nedersta fasen, som är röd, den organiska fasen. Interphasen i mitten är vit och grumlig. Den övre fasen är vattenfasen och det är klart. RNA är i vattenfasen, som bör samlas in med en pipett för nederbörd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Prov RNA gel att övervaka RNA kvalitet. En illustration av en RNA gel visar prover med intakt RNA. Intakt RNA har framstående band för den 28S och 18S rRNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Exempel på gener med olika decay frodas kontra quiescent fibroblaster. Fluorescens stödnivåer (genuttryck) över tid visas för fyra gener som röta annorlunda i frodas kontra quiescent fibroblaster. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande Tabell1: gen-specifika fluorescens stödnivåer i prolifererande och quiescent fibroblaster. Uppgifterna är tillhandahålls för tiden noll och under en tid efter ActD behandling i frodas och kontakt-hämmade fibroblaster. P-värden, q-värden och falsk upptäckten priser tillhandahålls. Tabellen är omtryckt från dess ursprungliga publikation i BMC Genomics12. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Rofylld kan induceras av externa signaler inklusive uttag mitogena substanser eller serum, avsaknad av celladhesion och kontakt hämning. Kontakt-hämning, en av flera möjliga metoder för att inducera rofylld, är en starkt evolutionärt bevarade process där celler avsluta proliferativ cellcykeln svar på cell-till-cell kontakt. Vi fokuserar här på kontakt hämning som ett exempel på en metod att inducera rofylld. Tidigare studier har rapporterat att cell-cell kontakt kan påverka mikroRNA biogenes25, således resultaten ger information om en rofylld metod och ytterligare studier krävs för att avgöra vilka ändringar som är associerade med rofylld i sig.
Vi använde primära humana diploida fibroblaster som vi isolerade från neonatal hud. Vi inledde dessa experiment med fibroblaster som var anpassade färre än 10 gånger. Vi kastas senare-passage fibroblaster eftersom de senesce. Medan detta protokoll fokuserar på prolifererande och quiescent dermal fibroblaster, kan procedurerna som beskrivs användas för att övervaka decay priser i olika typer av celler och under olika förhållanden.
Vi övervakas mRNA decay priser genome-wide med en transkription avstängning tid kurs. Avstängning tid kurser är den mest använda metoden för frikoppling mRNA förfall från mRNA transkription för att beräkna mRNA halveringstider1,26. I metoden som beskrivs här, ActD, en drog att komplex med B-form av DNA för att blockera töjning av RNA-polymeras II, används att arrestera transkription av mRNA27. Den ränta som avskrifter minskar i överflöd under en 8-timmarsperiod kan bestämmas som Avskriftens decay rate.
En viktig begränsning av ActD-baserade metoder för övervakning av avskrift förfall är att ActD förhindrar globala transkription, som kommer att påverka cellernas livskraft. Detta bör hållas i åtanke när man tolkar ActD-baserade data, som decay priser bestäms i celler som är mer stressade än deras ursprungliga tillstånd. En annan viktig fråga är att effekterna av ActD kan vara olika för celler i olika stater, däribland frodas kontra kontakt-hämmade fibroblaster. En metod för att minimera biverkningar av ActD behandling är att hålla tidsförlopp kort varaktighet. Därför valde vi en 8 h tid kurs.
Det finns alternativa metoder till ActD för att övervaka avskrift decay priser28,29. Jäststammar med temperaturkänsliga RNA-polymeras II alleler har använts för att övervaka avskrift decay priser30. En variant på denna metod som kallas ”ankare-away” har använts i jäst för att uppnå villkorade utarmning av RNA-polymeras II svar på rapamycin behandling31,32. Det är också möjligt att övervaka förfall i celler med aktiva transkription. Exempelvis thio-substituerade uracil nukleotider kan införas i celler, införlivas i mRNA och därefter upptäcks33,34,35. Med detta synsätt, kan den där olika avskrifter syntetiseras bestämmas i celler som fortsätter att syntetisera mRNA. Sådana metoder har en betydande fördel över ActD behandling eftersom de inte är giftiga. Vår erfarenhet, dock kan det variabilitet i återhämtningen av avskrifter med dessa metoder. ActD behandling är en okomplicerad och reproducerbar metod för övervakning avskrift förfall.
Några steg i protokollet som är avgörande för dess framgång. En viktig fråga är att förhindra RNA nedbrytning under RNA isolering. Vid steg 4.1, bör RNA övervakas för nedbrytning. Om RNA inte innehåller två tydliga toppar för 18S och 28S rRNAs (figur 4), är detta ett tecken på att avskrift nedbrytning har inträffat. Vissa instrument ger RNA integritet nummer (RIN) noter sträcker sig från 1 till 10. Prover med RIN poängen i intervallet 7-10 är godtagbara för vidare analys. Om RNA är förstörd, är det viktigt att ta mer försiktighetsåtgärder för att förhindra RNA nedbrytning, såsom att se till att lösningar och sterileware RNase-fri, och att handskar bärs när hantering pipetter för RNA. Vatten kan vara förbehandlats med 0,1% dietyleter pyrocarbonate (DEPC), inkuberas i minst 2 h vid 37 ° C, och autoklaveras i minst 15 min. Observera att DEPC kan inte användas med Tris-baserade buffertar. RNase dekontaminering lösningar kan också användas för att ta bort RNase från arbetsytor, centrifuger och pipetter och reagenser som hämmar RNaser kan läggas till prover.
Ett annat viktigt steg är separationen av faserna av fenol-guanidin isotiocyanat lösningen. Det är viktigt att se till att endast den övre fasen samlas RNA bearbetning. Om den resulterande RNA innehåller kvarstående fenol, förhållandet mellan absorbansen vid 230, 260 och 280 nm kommer inte i baserat på 1:2:1 som förväntat. Högre än förväntade absorbansen vid 230 nm kan indikera fenol kontaminering. Om detta inträffar kan RNA etanol fälls ut igen och tvättade flera extra gånger för att ta bort eventuella kvarvarande fenol.
Slutligen, när RNA är pelleterat och supernatanten avlägsnas, pelleten kan vara klibbig, tunn och lätt störs. Vid denna punkt, är det viktigt att vara extra försiktig i att ta bort vätskan. Det kan vara viktigt att visualisera röret med bra belysning för att leta upp pelleten och kontrollera att det inte är störd. Lade till glykogen kan bidra till att säkerställa pelleten är synliga på denna punkt.
Valet av tidpunkter för kursen tid av förfall är också en viktig fråga att överväga. Medan de fyra tidpunkter vi valt tillät oss att övervaka förfall för över 10 000 gener, några gener inte avsevärt sönderfalla under 8 h tid. Om kortlivade avskrifter är en hög prioritet, kan utredarna vill lägga till ytterligare provsamlingar före 120 min, till exempel på 30 min. För bättre bedömning av långlivade avskrifter, kanske utredarna vill lägga till ytterligare provsamlingar vid senare tidpunkter.
En annan potentiell fråga kan leda om förfall skattesatserna inte följer den förvänta fördelningen. Exempelvis kan det för många eller för få gener visar en log-linjära decay Betygsätt över 8 h. Om detta händer, är det bra att övervaka de förfalla priserna av gener som är kända för att vara kort eller långlivad för att avgöra huruvida de följer det förväntade mönstret.Om gener har en positiv istället för negativ lutning över tiden, kan de undantas från ytterligare analyser som de inte visar en log-linjära decay rate. Ett sista problem kan uppstå om cellerna i de två villkor som jämförs har mycket olika svar på ActD sådan att många gener röta snabbare i ett villkor. I det här fallet kan det vara bra att inte bara skillnaden i decay rate mellan de två staterna, utan även spike-i kontrollerna som vi föreslår även före RNA isolering att tillhandahålla information om absolut decay priser i de båda staterna.
Möjlighet att övervaka avskrift decay priser mellan prolifererande och quiescent celler eller någon två liknande stater har potential att ge ytterligare insikt i vikten av avskrift decay reglera fysiologiska förändringar. Tillämpningar inkluderar celler med och utan onkogena aktivering, före och efter åldras eller virusinfektion, med och utan Nedslagning av en specifik gen eller i två olika stater av differentiering. Resultaten kan kopplas till RNA-Seq att tillhandahålla information om isoform-specifika ändringar i avskrift decay priser, som kan ge insikt i förändringarna i isoform uttryck observerades som celler genomgår fysiologiska övergångar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingen konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
HAC var Milton E. Cassel lärd av Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Detta arbete finansierades genom bidrag till HAC från National Institute of General Medical Sciences Center Excellence Grants P50 GM071508 (P.I. David Botstein), PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, National Science Foundation Grant OCI-1047879 till David augusti, National Institute of General Medical Sciences R01 GM081686, National Institute of allmänna medicinska vetenskaper R01 GM0866465, Eli & Edythe bred centrum för regenerativ medicin & stamcellsforskning, Iris Cantor Women's Health Center/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124 och leukemi lymfom samhället. Forskning som redovisas i denna publikation stöddes av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P50CA092131. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. HAC är medlem av Eli & Edythe breda Center för regenerativ medicin & stamcellsforskning, UCLA molekylärbiologi Institutet och UCLA bioinformatik enhetsövergripande programmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C | |||
| Equipment for running agarose gels | |||
| Sterile tissue culture plates and conical tubes | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Life Technologies | 11965-118 | |
| Fetal bovine serum | VWR | 35-010-CV | |
| Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture | |||
| Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis | |||
| Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples | |||
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | For decontaminating work surfaces from RNase |
| 2.0 ml eppendorf tubes | |||
| Trypsin-EDTA Solution 10X | Millipore Sigma | 9002-07-07 | |
| Sterile PBS | Life Technologies | 14190-250 | |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Actinomycin D | Millipore Sigma | A1410-2 mg | inhibits transcription |
| Sterile DMSO | Fisher Scientific | 31-761-00ML | solvent for actinomycin D |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | ICN19400225 | MP Biomedicals, Inc product |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618500 | molecular biology grade |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP28184 | molecular biology grade |
| RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) | Thermo Fisher Scientific | R0551 | carrier for RNA precipitation |
| TURBO DNA-free Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1907 | removes DNA with DNase, then, in a subsequent step, inactivates DNA and removes divalent cations |
| Agarose | Thermo Fisher Scientific | ICN820721 | MP Biomedicals, Inc product |
| Loading dye for RNA gel | Thermo Fisher Scientific | R0641 | suitable even for denaturing electrophoresis |
| Millenium RNA markers | Thermo Fisher Scientific | AM7150 | RNA ladder |
| One-color RNA Spike-in Kit | Agilent Technology | 5188-5282 | Example spike-in control for Agient microarray analysis |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | molecular biology grade, for TAE buffer |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38-500 | for TAE buffer |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | electrophoresis grade, for gels |
| Ethidium bromide | Millipore Sigma | E7637 | for molecular biology |
| External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix | Thermo Fisher Scientific | 4456740 | Spike-in control for RNA Seq |
| TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) | Illumina | RS-122-2101 | for RNA Seq |
| 96-well 0.3 ml PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB-0600 | for real-time qPCR |
| Microseal B adhesive seals | Bio-Rad | MSB1001 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs | VWR | 89094-662 | for real-time qPCR |
| Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps | Thermo Fisher Scientific | AM12230 | for real-time qPCR |
| SuperScript Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18090010 | for real-time qPCR |
| AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | for real-time qPCR |
References
- Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
- Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
- Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
- Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
- Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
- Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
- Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
- Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
- Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
- Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
- Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
- Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
- Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
- Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
- Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
- Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
- Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
- Conesa, A., Nueda, M. R package version 1.46.0. maSigPro: Significant Gene Expression Profile Differences in Time Course Gene Expression Data. , Available from: http://bioinfo.cipf.es (2016).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
- Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
- Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
- Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells - A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
- Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
- Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
- Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
- Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
- Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
- Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
- Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
- Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).
