Summary

Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

Published: January 02, 2018
doi:

Summary

Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.

Abstract

Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.

Introduction

Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.

Previamente hemos demostrado que la transición entre la proliferación y quietud en fibroblastos humanos primarios se asocia con cambios en los niveles de transcripción de muchos genes6. Algunos de estos cambios reflejan las diferencias en la actividad de factores de transcripción entre estos dos Estados.

Cambios en la tasa de decaimiento de una transcripción también pueden contribuir a cambios en el nivel de expresión de una transcripción en dos diferentes Estados7,8. Basado en los resultados anteriores que la transición entre la proliferación y la inactividad se asocia con cambios en los niveles de varios microRNAs9, le preguntamos si también hay una contribución de la descomposición de la transcripción diferencial de los cambios expresión génica en proliferación contra fibroblastos quiescentes.

Para monitorear la estabilidad de la transcripción, se determinó la tasa de decaimiento de las transcripciones genoma en proliferación versus células quiescentes. Para lograr esto, supervisamos las tasas de decaimiento en proliferación contra fibroblastos quiescentes introduciendo un inhibidor de la transcripción nueva y monitoreo de la tasa en que desaparecieron expedientes individuales con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que, en comparación con los métodos que simplemente controlar la expresión génica global, por inhibición de la síntesis nueva de transcripción, seremos capaces de determinar la tasa de decaimiento de estas transcripciones por separado de la tasa a la que son transcrito.

ActD tratamiento para inhibir transcripción nueva y para determinar las tasas de decaimiento de transcripción se ha aplicado con éxito en múltiples estudios anteriores. ActD se ha utilizado para disecar la importancia de la estabilidad del RNA en los cambios en la abundancia de transcripción que resultan del tratamiento con citoquinas proinflamatorias5. Un enfoque similar también se ha utilizado para disecar las diferencias en la tasa de decaimiento de transcripción en proliferación versus células C2C12 diferenciadas como adoptan un fenotipo muscular diferenciado del10. Otro ejemplo, global mRNA vida media también se han detectado en pluripotentes y11de las células madre embrionarias de ratón distinguido. En estos ejemplos, decaimiento del mRNA se ha demostrado para ser importante para la regulación de la abundancia de transcripción y para la transición de células a células diferentes Estados.

Aplicación de los métodos descritos a continuación, descubrimos cambios en las tasas de decaimiento de la transcripción en aproximadamente 500 genes cuando se comparan los fibroblastos en proliferación y quieto Estados12. En particular, hemos descubierto que los objetivos del microRNA miR-29, que es regulada en células quiescentes, se estabilizan cuando las células de transición a la inactividad. Aquí describimos la metodología que se utilizó para determinar las tasas de decaimiento en las células proliferantes y quietas. Esta metodología es útil para comparar las tasas de decaimiento mRNA mundiales en dos distintos pero similares condiciones cuando se busca información sobre genes el decaerse rápidamente. También podría utilizarse para abordar otras cuestiones como el efecto de las condiciones de cultivo celular en decaimiento de la transcripción, por ejemplo, en dos dimensiones versus tres culturas dimensionales. Las tasas de decaimiento pueden ser genoma determinado con métodos tales como microarrays o RNA-seq. alternativamente, qPCR en tiempo real o el borrar norteño puede utilizarse para determinar las tasas de decaimiento en una base de gen por gen o isoforma de la isoforma. Estas tasas pueden utilizarse para calcular la vida media de cada gen supervisada y para identificar genes con índices de caries que son diferentes en dos condiciones.

Protocol

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por comités de revisión institucional en la Universidad de Princeton y la Universidad de California, Los Ángeles. 1. preparar los fibroblastos proliferantes y contacto-inhibido para ActD tiempo curso Nota: Este protocolo usa una timecourse con cuatro puntos de tiempo. Pueden recogerse tres muestras biológicamente independientes por punto por la recogida de las placas de cultivo de tejidos diferentes en un experimen…

Representative Results

Hemos divulgado previamente los resultados de análisis de microarray de las tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos primarios proliferación e inhibida por el contacto durante un tiempo de 8 horas curso12. Se proporciona una lista de genes con un cambio significativo en la estabilidad de la transcripción comparación de fibroblastos proliferantes y contacto-inhibida en la tabla adicional 1. Se proporcionan las intensidades …

Discussion

Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli & Edythe Broad Center de medicina regenerativa & investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la leucemia linfoma. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro del Eli & Edythe amplia centro de medicina regenerativa & investigación con células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.

Materials

Centrifuges for microcentrifuge tubes capable of reaching 12,000 x g and 4°C
Equipment for running agarose gels
Sterile tissue culture plates and conical tubes
Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-118
Fetal bovine serum VWR 35-010-CV
Sterile serological pipets, pipettors and pipet tips for tissue culture
Individually wrapped, disposable Rnase-free pipettes, pipette tips and tubes for RNA isolation and analysis
Disposable gloves to be worn when handling reagents and RNA samples
RNaseZap Invitrogen AM9780 For decontaminating work surfaces from RNase
2.0 ml eppendorf tubes
Trypsin-EDTA  Solution 10X Millipore Sigma 9002-07-07
Sterile PBS Life Technologies 14190-250
Trizol Thermo Fisher Scientific 15596018
Actinomycin D Millipore Sigma A1410-2 mg inhibits transcription
Sterile DMSO Fisher Scientific 31-761-00ML solvent for actinomycin D
Chloroform Thermo Fisher Scientific ICN19400225 MP Biomedicals, Inc product
Isopropanol Fisher Scientific BP2618500 molecular biology grade
Ethanol Fisher Scientific BP28184 molecular biology grade
RNase-free Glycogen (20 mg/ml aqueous solution) Thermo Fisher Scientific R0551 carrier for RNA precipitation
TURBO DNA-free Kit Thermo Fisher Scientific AM1907 removes DNA with DNase, then, in a subsequent step,  inactivates DNA and removes divalent cations
Agarose Thermo Fisher Scientific ICN820721 MP Biomedicals, Inc product
Loading dye for RNA gel Thermo Fisher Scientific R0641 suitable even for denaturing electrophoresis
Millenium RNA markers Thermo Fisher Scientific AM7150 RNA ladder
One-color RNA Spike-in Kit Agilent Technology 5188-5282 Example spike-in control for Agient microarray analysis
Tris base Fisher Scientific BP152-1 molecular biology grade, for TAE buffer
Glacial acetic acid Fisher Scientific A38-500 for TAE buffer
EDTA Fisher Scientific BP120-500 electrophoresis grade, for gels
Ethidium bromide Millipore Sigma E7637 for molecular biology
External RNA Controls Consortium RNA Spike-in Mix Thermo Fisher Scientific 4456740 Spike-in control for RNA Seq
TruSeq Stranded mRNA Library Preparation Kit A (48 samples, 12 indexes) Illumina RS-122-2101 for RNA Seq
96-well 0.3 ml PCR plate Thermo Fisher Scientific AB-0600 for real-time qPCR
Microseal B adhesive seals Bio-Rad MSB1001 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Reagent Reservoirs VWR 89094-662 for real-time qPCR
Rnase/Dnase-free Eight tube strips and caps Thermo Fisher Scientific AM12230 for real-time qPCR
SuperScript Reverse Transcriptase Invitrogen 18090010 for real-time qPCR
AMPure XP Beads Beckman Coulter A63880 for real-time qPCR

References

  1. Neff, A. T., Lee, J. Y., Wilusz, J., Tian, B., Wilusz, C. J. Global analysis reveals multiple pathways for unique regulation of mRNA decay in induced pluripotent stem cells. Genome Res. 22 (8), 1457-1467 (2012).
  2. Raghavan, A., Ogilvie, R. L., Reilly, C., Abelson, M. L., Raghavan, S., Vasdewani, J., Krathwohl, M., Bohjanen, P. R. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30 (24), 5529-5538 (2002).
  3. Cheadle, C., Fan, J., Cho-Chung, Y. S., Werner, T., Ray, J., Do, L., Gorospe, M., Becker, K. G. Control of gene expression during T cell activation: alternate regulation of mRNA transcription and mRNA stability. BMC Genomics. 6, 75 (2005).
  4. Yang, E., van Nimwegen, E., Zavolan, M., Rajewsky, N., Schroeder, M., Magnasco, M., Darnell, J. E. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13 (8), 1863-1872 (2003).
  5. Hao, S., Baltimore, D. The stability of mRNA influences the temporal order of the induction of genes encoding inflammatory molecules. Nat Immunol. 10 (3), 281-288 (2009).
  6. Coller, H. A., Sang, L., Roberts, J. M. A new description of cellular quiescence. PLoS Biol. 4 (3), 83 (2006).
  7. Wilusz, C. J., Wormington, M., Peltz, S. W. The cap-to-tail guide to mRNA turnover. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (4), 237-246 (2001).
  8. Garneau, N. L., Wilusz, J., Wilusz, C. J. The highways and byways of mRNA decay. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 113-126 (2007).
  9. Suh, E. J., Remillard, M. Y., Legesse-Miller, A., Johnson, E. L., Lemons, J. M., Chapman, T. R., Forman, J. J., Kojima, M., Silberman, E. S., Coller, H. A. A microRNA network regulates proliferative timing and extracellular matrix synthesis during cellular quiescence in fibroblasts. Genome Biol. 13 (12), 121 (2012).
  10. Hoen, P. A., Hirsch, M., de Meijer, E. J., de Menezes, R. X., van Ommen, G. J., den Dunnen, J. T. mRNA degradation controls differentiation state-dependent differences in transcript and splice variant abundance. Nucleic Acids Res. 39 (2), 556-566 (2011).
  11. Sharova, L. V., Sharov, A. A., Nedorezov, T., Piao, Y., Shaik, N., Ko, M. S. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16 (1), 45-58 (2009).
  12. Johnson, E. L., Robinson, D. G., Coller, H. A. Widespread changes in mRNA stability contribute to quiescence-specific gene expression patterns in a fibroblast model of quiescence. BMC Genomics. 18 (1), 123 (2017).
  13. Legesse-Miller, A., Elemento, O., Pfau, S. J., Forman, J. J., Tavazoie, S., Coller, H. A. let-7 Overexpression leads to an increased fraction of cells in G2/M, direct down-regulation of Cdc34, and stabilization of Wee1 kinase in primary fibroblasts. J Biol Chem. 284 (11), 6605-6609 (2009).
  14. Jiang, L., Schlesinger, F., Davis, C. A., Zhang, Y., Li, R., Salit, M., Gingeras, T. R., Oliver, B. Synthetic spike-in standards for RNA-seq experiments. Genome Res. 21 (9), 1543-1551 (2011).
  15. Tan, P. K., Downey, T. J., Spitznagel, E. L., Xu, P., Fu, D., Dimitrov, D. S., Lempicki, R. A., Raaka, B. M., Cam, M. C. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res. 31 (19), 5676-5684 (2003).
  16. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  17. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  18. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
  19. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  20. Anders, S., Reyes, A., Huber, W. Detecting differential usage of exons from RNA-seq data. Genome Res. 22 (10), 2008-2017 (2012).
  21. Vandenbroucke, I. I., Vandesompele, J., Paepe, A. D., Messiaen, L. Quantification of splice variants using real-time PCR. Nucleic Acids Res. 29 (13), 68-68 (2001).
  22. Hargrove, J. L., Hulsey, M. G., Beale, E. G. The kinetics of mammalian gene expression. Bioessays. 13 (12), 667-674 (1991).
  23. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 57, 289-300 (1995).
  24. Hwang, H. W., Wentzel, E. A., Mendell, J. T. Cell-cell contact globally activates microRNA biogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7016-7021 (2009).
  25. Friedel, C. C., Dolken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37 (17), 115 (2009).
  26. Soeiro, R., Amos, H. mRNA half-life measured by use of actinomycin D in animal cells – A caution. Biochimica et Biophysica Acta. 129 (2), 406-409 (1966).
  27. Perez-Ortin, J. E., Alepuz, P., Chavez, S., Choder, M. Eukaryotic mRNA decay: methodologies, pathways, and links to other stages of gene expression. J Mol Biol. 425 (20), 3750-3775 (2013).
  28. Chen, C. Y., Ezzeddine, N., Shyu, A. B. Messenger RNA half-life measurements in mammalian cells. Methods Enzymol. 448, 335-357 (2008).
  29. Gupta, I., Clauder-Munster, S., Klaus, B., Jarvelin, A. I., Aiyar, R. S., Benes, V., Wilkening, S., Huber, W., Pelechano, V., Steinmetz, L. M. Alternative polyadenylation diversifies post-transcriptional regulation by selective RNA-protein interactions. Mol Syst Biol. 10, 719 (2014).
  30. Geisberg, J. V., Moqtaderi, Z., Fan, X., Ozsolak, F., Struhl, K. Global analysis of mRNA isoform half-lives reveals stabilizing and destabilizing elements in yeast. Cell. 156 (4), 812-824 (2014).
  31. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Mol Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  32. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nat Biotechnol. 23 (2), 232-237 (2005).
  33. Rabani, M., Levin, J. Z., Fan, L., Adiconis, X., Raychowdhury, R., Garber, M., Gnirke, A., Nusbaum, C., Hacohen, N., Friedman, N., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat Biotechnol. 29 (5), 436-442 (2011).
  34. Marzi, M. J., Ghini, F., Cerruti, B., de Pretis, S., Bonetti, P., Giacomelli, C., Gorski, M. M., Kress, T., Pelizzola, M., Muller, H., et al. Degradation dynamics of microRNAs revealed by a novel pulse-chase approach. Genome Res. 26 (4), 554-565 (2016).

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Cite This Article
Mitra, M., Lee, H. N., Coller, H. A. Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts. J. Vis. Exp. (131), e56423, doi:10.3791/56423 (2018).

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