Denne protokol beskriver kvantificering af flere cytokin mål samtidig i vævskultur analysere indsamlet fra stimuleret mus splenocytes ved hjælp af multiplex perle baseret immunassay platform og et flow Flowcytometret.
Perle-baserede immunassays beskæftiger det samme grundlæggende princip som sandwich immunassays. Fange perler, som kan differentieres efter størrelse og indre allophycocyanin (APC) Fluorescens intensitet, er konjugeret til antistoffer specifikke for en bestemt analysand. Næste, en valgte panel af definerede capture perle sæt er inkuberes med en biologisk prøve, der indeholder mål analysander specifikke til capture-antistoffer. En biotinylated detektor-antistofs cocktail er tilføjet, hvilket fører til dannelsen af capture perle-analyt-detektor-antistofs sandwich.
Endelig, føjes streptavidin-phycoerythrin (SA-PE), som binder sig til biotinylated påvisning antistoffer, at give fluorescerende signal støtteintensiteter i forhold til mængden af bundne analysand. PE fluorescerende signal af analysandens-specifikke perler regioner kvantificeres ved hjælp af flowcytometri, og koncentrationerne af særlige analysander bestemmes ved hjælp af data analyse software og standardkurven genereres i analysen.
I dette eksperiment bruger vi en mus T helper cytokin panel til samtidig kvantificere koncentrationen af 13 separat cytokin mål i vævskultur analysere indsamlet fra mus splenocytes kulturperler under forskellige stimulerende.
I deres rolle som opløselige signaling molekyler mægle cytokiner de meget koordineret og multifaktoriel processer, der styrer vært immunologiske reaktioner. De er udtrykt i alle faser af den inflammatoriske proces, fra indledning til løsning, og regulere et komplekst samspil netværk, der omfatter deres egen syntese og med deres cellulære receptorer1. Denne meddelelse netværk er lagdelt med en kompleksitet, der går ud over de synergistisk eller antagonistisk relationer, der kan eksistere mellem individuelle komponenter. Faktisk, mange cytokiner er kendt at dele overflødige eller i det mindste delvist overlappende funktioner2,3.
Integrerede systemer biologi tilgange, der samtidig kvantificere flere cytokin analysander leverer i øjeblikket en stadig mere omfattende forståelse af den unikke cytokinomes, der dirigerer immunrespons underliggende flere sygdom hedder4,5. Disse sygdom stater spænder fra generaliseret betændelse på kræft, neurodegenerative og hjerte-kar-sygdom6,7,8,9.
Sådanne cytokin net kan være afhørt effektivt ved hjælp af LEGENDplex perle-baserede immunassays. Disse analyser er baseret på samme princip som sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), og bruge fluorescens kodet mikrokugler med capture antistoffer kovalent knyttet til deres overflade. Disse antistoffer er immobiliseret på overfladen områder meget mindre end dem, der kræves af traditionelle ELISA formater. Dette gør det muligt for disse analyser skal udføres med langt mindre sample volumen, mens på samme tid reducere ikke-specifik binding og leverer multipleksede analyse af flere analysander.
Analysen i denne protokol beskrevne udnytter denne teknologi til at kvantificere op til 13 mål samtidig. Data fra denne analyse kan opnås ved hjælp af en bred vifte af almindeligt tilgængelige flow cytometers og i modsætning til andre tilgængelige assays kræver ikke brug af dedikerede assay-specifikke instrumentation. Med en voksende katalog af validerede analysand paneler, har disse assays været brugt i flere igangværende biomedicinsk forskning projekter10,11,12,13.
For at demonstrere den lethed og nytte af formatet analysen i dette eksperiment, vi bruger en mus T helper cytokin panel til at kvantificere adskille 13 cytokin koncentrationer fra vævskultur analysere fremstillet af mus splenocytes kulturperler under flere stimulerende betingelser. Ud over vævskultur analysere, kan dette assay også udføres ved hjælp af serum eller plasma prøver.
8. Fortsæt til dataanalyse Bemærk: The FCS filer genereret på flow-Flowcytometret skal analyseres ved hjælp af data analyse software, som kan downloades gratis 14. Installere data analyse software på en PC. Overføre alle assay FCS filer til computeren, som indeholder analysesoftwaren. Tilsluttes en USB-port på computeren den licens nøgle dongle (medfølger i sættet). Launch data analyse software. Klik på blå " tilføje filer " knappen placeret øverst i skærmbilledet. Naviger til den mappe, der indeholder filerne FCS fra assay i pop op-vindue, der vises. Klik på og træk alle assay FCS filer fra pop op-vindue til visningen, software. Alle filer vises nu i listeform. Klik på grønne " næste " knappen nederst til højre på skærmen. Venstreklik og hold for at trække lille blå standardkurven knapper (C7 til at C0) til de tilsvarende FCS filer fra listen for at definere standardkurven. Klik på grønne " næste " knappen nederst til højre på skærmen for at åbne gating pop up vindue. På venstre side af vinduet gating Angiv navnene på både A og B perle regioner assay analysand mål og deres tilknyttede perle ID (findes i manualen forsynet med analysen) i stigende rækkefølge. Vælg værktøjet gating fra toppen af pop op-vindue og bruge den til at tegne 2 porte i FSC vs SSC plot, en omkring A perler og en anden omkring B perler. Gennemgå APC vs PE scatter parceller der vises under FSC vs SSC plottet, der vises. Der vil være 6 analysand bands i A perler (venstre plot) og 7 analysand bands i B perler (højre plot). Bemærk: Portene kan genudstedes manuelt ved at vælge viskelæderværktøjet i toppen og klikke på for at slette en given gate. Værktøjet gating kan derefter vælges og anvendes til at udligne en gate til regionen bølgeområde. Klik på grønne " OK " knappen Luk gating pop-up-vinduet og vende tilbage til listen over filer, FCS. Definerer de fortyndinger, der blev foretaget til biologiske prøver af højre klikke på en bestemt fil, vælge " fortynding Fold " fra menuen, og inddata den korrekte værdi. Klik på grønne " køre " knappen i nederste højre hjørne af skærmen for at generere de standard kurver for analysen og beregne koncentrationerne af ukendt biologiske prøver.
Assay format beskrevet i denne protokol kan give robuste kvantificering af opløselige mægler profiler i biologiske prøver leveret eksperimentatoren har god laboratoriepraksis teknik og overholder de anbefalede protocol.
Der er flere vigtige skridt, der skal følges for at sikre pålidelige resultater. Først, må de rekombinante standarder til at rekonstruere i analysebuffer fuld tid anbefales, og efter kun fortyndet i polypropylen rør. Polystyren rør kan fremme overholdelsen af proteinerne mur af rør, som kan føre til lavt signaler, når du genererer standardkurven. Andet, ordentlig ryster under inkubation trin er kritisk. Uden ordentlig agitation, kan bindende egenskaber af analysen perler blive alvorligt hæmmet. Korrekt vask mellem inkubation trin er derudover også nødvendig. Eksperimentatoren bør sikre, at overskydende reagenser er fjernet fra brøndene før påbegyndelse det næste trin i protokollen. Instrumenter indstillinger for flow Flowcytometret bruges til at afhøre assay perlerne skal optimeres så godt. Især skal ydelse indstillinger ændres for at sikre ordentlig perle adskillelse og bred dynamisk intervallerne for de standard kurver. Endelig, lige før at blive analyseret på forskellige, perler skal være vortexed at sikre ordentlig suspension og undgå dannelsen af aggregater, der kan forvrænge resultater.
Denne protokol kan potentielt modificeret til at analysere væv homogeniseret samt prøve typer drøftet i dette manuskript, forudsat at forskeren er villig til at optimere deres lysis protokol inden du udfører store, fuld plade assays. Den faktiske teknik vil naturligvis variere afhængigt af vævstype; men generelt protokollen bør bruge en neutral pH buffer indeholdende fysiologiske koncentrationer af Ioniske salte, ingen denaturering kemikalier og helst ikke rengøringsmidler. Hvis rengøringsmiddel skal anvendes, bør nonionisk detergent koncentrationer holdes på et minimum (f.eks. ikke mere end 1%). Bufferen bør også indeholde tilstrækkelige proteasehæmmere for at forhindre proteolytisk nedbrydning af target proteiner. Uanset lysis protokollen anvendes, bør de sidste forberedelser centrifugeres for at fjerne partikler inden analyse.
Vedrørende analyse, koncentrationen af analysanden mål i biologisk prøve typer kan variere meget. For at korrekt kvantificere analysand koncentrationer, skal de falder inden for de øverste og nederste værdier for standardkurven. Ekstrapolering af værdier af kurven er ikke nødvendigvis pålidelig og anbefale ikke. Efterforskere skal derfor optimere fortyndinger af deres særlige prøver i pilotforsøg inden du kører en fuld-plade assay. Derudover er den omhyggelige forberedelse af de biologiske prøver til analyseres altafgørende for succes i dette assay format. Prøver, der er lipemic, hemolyzed, eller indeholder protein snavs vil påvirke antigen-antistof interaktioner, der definerer Kerneprincippet for denne immunassay og render resultater, der er uninterpretable.
Denne analyse er væsentlige for den eksisterende kvantificering metoder af flere grunde. Når kører ordentligt, kan formatet assay kvantificere op til 13 analysander fra en prøve ved hjælp af langt mindre mængder end ville være forpligtet til at analysere prøven ved hjælp af traditionelle ELISA assays. Dette assay format kræver også ikke dedikeret instrumentation i for at blive udført. Det er en fordel i forhold til andre kommercielt tilgængelige perle-baserede immunassays som analysen kan køres ved hjælp af et vilkårligt antal almindeligt anvendte flow cytometers.
Videnskabelig undersøgelse til rollen spillet af udskilles faktorer og cytokin netværk i sundhed og sygdom er i vækst. Formatet assay beskrevet i dette manuskript kan være et værdifuldt redskab for forskere søger at forstå disse mangesidede og komplekse fænomener. Aktive biomedicinsk forskningsprogrammer begyndt at udforske rollen af cytokin netværk i ikke kun områder såsom generaliseret betændelse6, men også i forbindelse med specifikke sygdomstilstande såsom åreforkalkning, kræft og neuroinflammation 15,16,17. Utvivlsomt, undersøgelsen vil fortsætte med at vokse i disse områder som søgen efter nye terapi til behandling af disse kroniske tilstande udvider. Behovet for nøjagtig og pålidelig kvantificering af opløselige mæglerne forbundet med disse sygdomme vil fortsat prioriteres kritisk forskning.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende bidragene af biomarkører og Immuno-assays produktudvikling team til udviklingen af analysen. Derudover vil vi gerne takke Vigene Tech, Inc. til deres fælles indsats i at designe data analyse softwarepakker.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |