Summary
このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。
Abstract
ビーズを用いたイムノアッセイ サンドイッチ免疫測定と同じ基本的な原理を採用しています。ビーズのサイズと内部アロフィコシアニン (APC) 蛍光強度によって区別することができます、特定の試料に特異抗体に共役をキャプチャします。次に、定義されているキャプチャ ビーズ セットの選択したパネルは、キャプチャー抗体に固有のターゲット analytes を含む生物学的サンプルと培養です。ビオチン標識検出抗体のカクテルが追加されます、キャプチャ ビーズ検体検出抗体サンドイッチの形成に 。
最後に、バインドされた試料の量に比例した蛍光信号強度を提供するビオチン検出抗体に結合するストレプトアビジン-フィコエ リスリン (SA PE) が追加されます。PE は蛍光ビーズ検体特異的領域の信号が、フローサイトメトリーを用いた定量化し、特定検体の濃度は、データ分析ソフトウェアとアッセイで生成される標準の曲線を使用して決定されます。
この実験では、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、同時に様々 な刺激条件下で培養マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に 13 の独立したサイトカイン ターゲットの濃度を定量化します。
Introduction
水溶性のシグナル伝達分子としての役割、サイトカインは宿主免疫反応を支配する因子と高い調整能力のプロセスを仲介します。彼らは解像度に開始からの炎症性プロセスのすべての段階の間に表現し、独自の合成とその細胞の受容体1を含む複雑な相互作用ネットワークを調整します。この通信ネットワークは個々 のコンポーネント間があります相乗的あるいは敵対関係を超えた複雑さと階層化します。確かに、冗長または少なくとも部分的に重なり合う機能2,3を共有する多くのサイトカインが知られています。
同時に複数のサイトカイン analytes を定量化する統合システムバイオロジーは現在複数疾患の基になる免疫反応を調整するユニークな cytokinomes のますます包括的な理解を提供します。4、5 を状態します。これら疾患状態まで炎症から癌、神経変性疾患、および心血管疾患6,7,8,9です。
LEGENDplex ビーズを用いたイムノアッセイを効果的に使用してこのようなサイトカイン ネットワークを尋問することができます。これらの試金はサンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) と同じ原理に基づいています、エンコードされた蛍光マイクロスフィアを使用し表面に共有結合接続キャプチャ抗体。これらの抗体は ELISA の従来のフォーマットに必要なそれらより小さい表面領域に固定します。これにより、このような試金をはるかに少ないサンプル量と同時に非固有のバインドおよび提供を減らすいくつかの検体の分析を多重実行します。
このプロトコルで説明アッセイは、同時に最大 13 ターゲット量的にこの技術を利用しています。この試金のデータはさまざまな一般的な流れの cytometers を使用して取得することができますとは異なり、他の利用可能なアッセイを必要としない専用の試金固有のインストルメンテーションを使用。検証済み試料パネルの拡大カタログ、いくつか継続的な生物医学研究プロジェクト10、11,12,13これらのアッセイを使用されています。
使いやすさとマウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、量的にこの実験で、アッセイ フォーマットの有用性を実証するには、13 別の複数の下で培養したマウス脾細胞から得られた培養上清からのサイトカイン濃度刺激の条件。組織培養上清、に加えてこのアッセイも実行できます血清または血漿サンプルを使用しています。
Protocol
すべての動物実験は、ケアと実験動物の使用のためのガイドに含まれる NIH の推奨事項に従って行われ、BioLegend で IACUC によって承認されました
。 
図 1: フィルターのプレートの試金プロシージャ概要。フィルター板を使用して分析を実行するためのプロトコルは、キー分析コンポーネントとインキュベーションの手順を描いた図として表されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
1。 生物試料
注: 選択した解剖学的サイトと採血量それぞれの個々 の調査官の裁量に任されて、アッセイの結果に影響しません。ただし、いったん取得されたサンプルを以下の手順に従って処理する必要があります
。- 血清サンプルの準備
- 最寄りのコレクションの管に血液の必要なボリュームを収集し少なくとも 30 分の凝固すること
- 常温 1,000 x g で 10 分間のサンプルを遠心します 。
- ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用に血清およびすぐのアッセイまたは因数を削除し、で試料を保存 ≤-20 ° C
- プラズマ サンプル準備
- エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を用いた血液の音量が採血管を被覆する収集します 。
- コレクションの常温 30 分以内 1,000 x g で 10 分間遠心します 。
- ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用にプラズマと試金をすぐに、または因数を削除し、で試料を保存 ≤-20 ° C
- 組織培養上清サンプルの準備
- 細胞および残骸を削除する 4 ° C で 1,500 × g で 10 分間のサンプルを遠心します 。
- ポリプロピレン遠心チューブに上清およびすぐのアッセイまたは因数を収集し、保管 ≤-20 ° C
- 融解凍結生物試料 の
- 氷と使用前に簡潔に渦の前に凍結された試料を完全に解凍します。以上 2 凍結/解凍サイクルを避ける
。 注: このプロトコルで使用されるサンプル BALB/c マウス脾細胞を培養によって得られた (37 ° C + 5% CO 2 様々 な条件の下で 1 x 10 の 6 セル: 些細、LPS (100 ng/mL)、αCD3 (1 μ G/ml プレート コーティング) + αCD28 (1μ g/mL 水溶性) PMA (20 ng/mL) + イオノマイシン (500 ng/mL)。培養上清は 48 時間後に収集された、セクション 1.3 で説明されているように処理されます 。
- 氷と使用前に簡潔に渦の前に凍結された試料を完全に解凍します。以上 2 凍結/解凍サイクルを避ける
2。試薬調製
- Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized ビーズ
- Sonicate 予混合ビーズ ボトル、室温で使用する 30 秒前の渦超音波発生装置お風呂で 1 分。超音波発生装置浴室が利用できない場合は、1 分に渦時間を増やす
- 洗浄バッファーの準備
- 持参 20 x 洗浄バッファー (1 %20 x PBS トゥイーン 20) 室温とソリューションにすべての塩をもたらす渦にキットに付属している 。
- 希釈 475 mL の脱イオン水で洗浄バッファー x 20 の 25 の mL です。ストア 2 の ° C と 1 ヶ月の 8 ° C 間の未使用部分 。
- 行列 B の準備 (使用の血清と血漿サンプルのみ)
- アッセイバッファー (1 %bsa と PBS) 完全な reconst の凍結乾燥の行列 B 許可する、少なくとも 15 分を含んでいる瓶をキットに含まれる 5.0 mL を追加itution、よく混ぜて、渦。残りの再構成された行列 B を保存ことができます ≤-70 ° C まで 1 ヶ月 。
3。標準準備
注: このパネルで各検体 10,000 pg/mL のトップ標準的な濃度がある
。- 、凍結乾燥させたマウス回サイトカイン スタンダード カクテルを再構成するアッセイバッファーの追加 250 μ L。簡単にボルテックスによってミックス、10 分間室温で放置するバイアルができます
- というラベルの付いたポリプロピレン微量遠心チューブに標準的なカクテルを転送 " C7 "。これは標準のトップとして使用されます 。
- C6、C5、C4、C3、C2、C1 としてラベル 6 ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用 。
- これらの管のそれぞれにアッセイバッファーの追加 75 μ L. C6 チューブとボルテックスで混ぜるトップの標準的な C7 の
- 転送 25 μ L。C6 標準なります 。
- シリアル実行続行新しいピペットを用いて 1:4 希釈ヒント ボルテックスに続いて次の最低標準管 75 μ L アッセイバッファーに以前の標準の 25 μ L を追加する各チューブ規格 C5、C3、C4 を取得するには、C2 と C1。0 pg/mL の標準 (C0) としてアッセイバッファーを使用します 。
4。サンプル希釈
注: この試金を使用して複数の希釈で予備のパイロット実験生物試料の特定のセットに対して最も適切な希釈倍率を決定する必要があります。適切な希釈倍率を標準曲線の境界内にあるサンプルの濃度計算となります。次の手順でガイドライン、サンプルの種類に応じて経験的に決定する必要があります
。- Dilute 血清または血漿サンプル倍アッセイバッファーで (e.g 50 μ l アッセイバッファーのサンプルの 50 μ l を希釈) ポリプロピレン マイクロ遠心チューブ用で。
。 注: さらにサンプルの希釈が必要な場合希釈されるべきである行列 B と正確な測定を確保するためのアッセイのバッファーではなく。追加の血清または血漿試料希釈なし低測定精度とフィルター プレートを詰まらせることがあります。行列 B は、プールされたマウス血清内因性アッセイ ターゲットの枯渇ので構成されます。イムノアッセイの感度に影響を与えると知られているマトリックスの影響を避けるために血清または血漿サンプルの希釈剤として使用されます 。
- テスト細胞培養上清サンプル希釈せず
。 注: 試料のレベルはサンプルからサンプルに大幅にあります。必要に応じて、対応する細胞培養培地またはアッセイバッファーの新鮮な製剤を用いた培養上清中のサンプルを希釈します 。
5。試金プロシージャ
注: ポリプロピレン フィルター プレートやマイクロ FACS チューブ V 底プレートに分析を実行できます。フィルター プレートの試金プロシージャで良いサンプルにお薦めの一貫性、アッセイの堅牢性、取り扱いの容易さ。この手順 (エンドユーザーによって提供される) 洗浄用真空ろ過ユニットが必要です
。- 使用前に常温 (20-25 ° C) にすべての試薬を許可します 。
- 倒立プレート カバー フィルター プレートを常時試金のセットアップおよびインキュベーション ステップ中に漏れを引き起こす可能性がありますそれにプレートの底は任意の面を触れないようにセットします 。
- ビーズを失うことを避けるために、洗浄のステップを含む全体の試金プロシージャ中にプレートを直立した保つ 。
- 暗いまたはすべての培養ステップ アルミ箔に包まれたプレートを維持します 。
- 順番にプレート上に配置、重複としてすべての標準およびサンプルを実行します 。
- 事前フィルター プレートを各ウェルに 100 μ L の洗浄バッファー x 1 を追加することによって濡れているし、(フィルター下部のマイクロ プレートを使用して) 場合室温で 1 分間座らせています 。
- 真空マニホールド (5-10 秒) を使用して、削除バッファー ボリューム。10 を超えていない " 真空の Hg。過剰な洗浄をしみプレートの底からきれいなペーパー タオルのスタックのプレートを押すことによってバッファーします。倒立プレート カバーの上にプレートを配置します
。 注: V 底プレートまたはマイクロ FACS のチューブを使用してアッセイを行う場合 5.1 5.2 の手順は省略できます 。
- セル培養上清サンプル、すべての井戸にアッセイバッファーの 25 μ L を追加。標準的な井戸に各規格の 25 μ L を追加します。サンプルの井戸に各サンプルの 25 μ L を追加します 。
- 血清または血漿の測定、標準の井戸に行列 B の 25 μ L を追加。サンプル井戸にアッセイバッファーの 25 μ L を追加します。標準的な井戸に各規格の 25 μ L を追加します。サンプルの井戸に各希釈血清または血漿サンプルの 25 μ L を追加します 。
- 渦混合ミックス ビーズ ビーズ ビーズ沈降を避けるために断続的にボトルを振って、各ウェルに 30 s. 追加 25 μ L 用ビーズです。最終巻は、ビーズの添加後各ウェルに 75 μ L をする必要があります 。
- シール プレート シーラーとプレートです。アルミ箔で、倒立プレート カバーを含むプレート全体をラップします。プレート シェーカーにプレートを置き、安全に、室温で 2 時間約 500 rpm で振る。漏れを防ぐため、肯定的な圧力に当てはまらないプレート シーラー 。
- 、反転せず真空マニホールドにプレートを置き、前に真空を適用、各ウェルを洗浄バッファー x 1 の 200 μ L を追加します 。
- は、真空濾過によりアッセイ プレート井戸の内容を削除します。吸収パッドや紙タオルでプレートの底から過剰な洗浄バッファーをしみ。この手順をあと 1 回繰り返します
。 注: 試金が実行された場合はスキップ手順 5.12 と 5.13 チューブ V 底プレートまたはマイクロ FACS を用いたします。代わりに、室温で 5 分間 1,000 x g でプレートを遠心分離し、マルチ チャンネル ピペットを使用して上清を除去 。
- 抗体を検出 (材料の表を参照) を各ウェルの追加 25 μ L.
- は、新鮮なプレート シーラーとプレートをシールします。アルミ箔で、倒立プレート カバーを含むプレート全体をラップします 。
- プレート シェーカーにプレートを置き、室温で 1 時間約 500 rpm で振る 。
- 、掃除機をかけることがなく各ウェルに直接 SA PE 試薬の 25 μ L を追加。試薬の希釈の必要はありません 。
- は、新鮮なプレート シーラーとプレートをシールします。アルミ箔で、倒立プレート カバーを含むプレート全体をラップします 。
- プレート シェーカーにプレートを置き、室温で 30 分間約 500 rpm で振る 。
- 5.13 の上記手順を繰り返します 。
- X 各洗浄バッファー 1 の追加 200 μ L よく。1 分のプレート シェーカーのビーズを再停止
- マルチ チャンネル ピペットを使用して、フィルター プレートから FACS フローサイトのサンプルを読み取るチューブにサンプルを転送します
。 注: サンプル ボリューム増やされるかもしれません 200 μ L から 300 μ L をサンプルの実行乾燥を避けるために各管に洗浄バッファー x 1 の余分な 100 μ L を追加することによって。必要なサンプルに格納されている可能性があります 4 ° C は光から保護し、次の日を分析します。ただし、長時間サンプル ストレージは減らされた信号につながることができます 。
6。流れの Cytometer セットアップ
注: 信頼性の高いデータを生成するために流れの cytometer 必要があります正しく設定するデータ集録前に。分析が実行される特定の楽器の構成によっていくつかに関して個々 のユーザーに対してこのプロセスが異なります。PE と APC を測定することができると両方装備 cytometer の一般化されたセットアップ プロセス 488 と 633 nm レーザーは後述です
。- 、メーカーによると流れの cytometer と獲得ソフトウェアを起動 ' 楽器付属の指示 。
- は、y 軸の x 軸と SSC (側方散乱) FSC (前方散乱) とドット プロットを作成します。線形のモードに FSC、SSC を設定します 。
- は、y 軸の x 軸と APC の PE で 2 番目のドット プロットを作成します。このプロットは、ログ ベースの表示モードに設定する必要があります 。
- 渦バイアル 30 のキットに含まれている原料ビーズのビードを再停止する s。これらのビーズ内部の APC 色素を含むし、2 つのサイズの個体群から成り立っています 。
- 新しい FACS 管へ生ビーズの転送 400 μ L.
- 流れの cytometer 流量を低に設定します 。
- 生のビーズは、これらのビードの両方のサイズの人口が目に見えて分離と簡単にゲートをされるように慎重に FSC と SSC の利得と電圧の調整を実行します 。
- (すなわち 破片や気泡)、不要なイベントを除外する FSC のしきい値を調整します 。
- SSC 対 FSC のプロットを描くすべてのビードの人口を含むゲートします
。 メモ: 生のビーズは、ビーズのサイズ個体より小さい "、ビーズ " と大きい " B ビーズ " 領域 。
- Y 軸の x 軸と APC の PE を 2 番目のドット プロットに FSC 対 SSC のプロットからゲート ビーズ人口を表示します 。
- APC 信号すべてビーズの人口のための 1 x 10 の 1 と 5 x 10 の 3 の間にある中央の蛍光強度 (MFI) APC 蛍光チャネル PMT 電圧を調整します 。
- 渦 PE セットアップのバイアル ビーズ 30 のビードを再停止する s.
- PE の転送 400 μ L を新しい FACS チューブ ビーズします 。
- 生のビーズは、PE では流れの cytometer からチューブ交換ビーズ チューブ 。 PE ビーズ バイアル PE 蛍光チャネルの設定 PE ビーズの MFI が見つけた多くの特定の範囲の間に落ちるように上場
- 光電子増倍管 (PMT) 電圧調整します
。 注: PE セットアップ ビーズが含まれて 1 つの人口サイズのビーズには ("、ビーズ " のみ).
7。データ集録
注: 特定の楽器上のデータの取得に関連する正確な手順はさまざまで、cytometer に依存して、' s 構成仕様とインタ フェース ソフトウェアを使用します。以下の手順は、アッセイで用いられる cytometer に関係なく試金で取られるに必要な手順を強調表示を意図して
。- の cytometer 流量が設定されてまだことを確認方 。
- は、約 300 検体ごとに取得するビーズ イベント数を設定します。13 プレックスの 3,900 イベントの取得に相当するこのパネルを組み合わせた両方のビードのサイズ人口 (A + B ビーズ).
- 渦 5 の各サンプル解析の前に s.
- 読み取りサンプル。サンプルを読んで、流れの cytometer をセットアップ モードに設定すると、最初、アクイジション ・ モードに切り替える前にビーズ人口が安定するまで待機します 。
- データの解析を容易にするデータ ファイルの連続した番号の簡易名を使用します 。
- イベントの総数ではなく (A + B ビーズ地域) ゲートのイベントのみをエクスポートします 。
- は、それぞれの試金のため同じフォルダーにすべての FCS ファイルを保存します。複数のアッセイを実行中の場合はそれぞれの試金のための別のフォルダーを作成します 。
注: 14 無料でダウンロードすることができますデータ解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で生成された、FCS ファイルを分析する必要があります
。- データ解析ソフトウェアを PC にインストールします 。
- すべてのアッセイ FCS ファイル解析ソフトウェアが含まれているコンピューターに転送します 。
- (キットに付属)、ライセンス キー ・ ドングルをコンピューターの USB ポートに差し込みます 。
- データ解析ソフトウェアを起動します 。
- 青をクリックして " ファイルを追加 " ボタンが画面の上部にある 。
- ポップアップ表示されるウィンドウにアッセイから FCS ファイルを含むフォルダーに移動します 。
- をクリックしてポップアップ ウィンドウからソフトウェア表示にすべてのアッセイ FCS ファイルをドラッグします。すべてのファイルがリストに表示されます 。
- は緑をクリックして " 次 "、ディスプレイの右下のボタン。左クリックしてままドラッグして、小青の標準曲線は標準曲線を定義するリストから対応する FCS ファイルに (C7 c0) をボタンします 。
- 緑をクリックして " 次 " ゲーティング ポップアップ ウィンドウを開くには画面の右下のボタンです 。
- ゲートのウィンドウの左側にある A の名前を入力し、B ビーズ地域分析試料ターゲットおよびその関連付けられたビード ID (アッセイに付属のマニュアルで確認) 昇順 。
- ポップアップ ウィンドウの上部からゲーティング ツールを選択し、FSC 対 SSC プロットの 2 つのゲート、A ビーズの周りの 1 つ、2 番目の B ビーズ周りを描画するために使用します 。
- は、APC 対 PE 散布図表示される FSC 対 SSC プロットの下に表示されるを確認します。6 試料バンド A ビーズ (左プロット) と 7 試料バンド B ビーズ (右の図) があります
。 注: ゲートは、上部に [消しゴム] ツールを選択し、所定のゲートを削除をクリックして手動で描画可能性があります。ゲーティング ツール可能性があります、選択し、目的バンド領域にゲートを手動で適用するために使用します 。
- 緑をクリックして " OK " ゲーティング ポップアップ ウィンドウを閉じ、FCS ファイルの一覧に戻る] ボタンをクリックします 。
- 右特定のファイルをクリックすると、選択することによって生物学的サンプルに加えられた希釈を定義 " 希釈倍 " メニュー適切な値を入力からします 。
- 緑をクリックして " を実行 " 試金のための標準的な曲線を生成し、未知試料の濃度を計算表示の右下にあるボタンです 。
Representative Results
このプロトコルは、ビーズを用いたイムノアッセイ プラットフォームを使用して同時に流れの cytometer を用いる生体試料からのサイトカインを量的に方法を示します。この例で使用されている生物学的サンプルいた以前様々 な作動条件の下で培養されていたマウス脾細胞から細胞培養上清アッセイ フォーマットは、血清または血漿サンプルで使用する検証されています。
アッセイから生成されるデータを使用して、多重パネルですべての検体の標準曲線を構築します。データ解析ソフトウェアは、ユニークなビーズのサイズと APC 強度に基づいて各特定の試料を分類し、PE レポーターを使用してそれらを定量化します。図 2 aの対数-対数スケールでプロットすると、アッセイの感度と同様に動的な範囲が示されています。ソフトウェアを使用して、分析データ、すべて標準曲線 (テーブル 1 のハイエンドとローエンドの生体試料も検出限界を提供だけでなくユーザーの検体の濃度を正確に計算する 5 パラメーター曲線近似アルゴリズム).このプロトコルで説明する形式はまた、非常に堅牢な測定精度を提供します。図 2 bおよび2 Cの各試料の測定内変動を描いたデータを掲載されています。2 つの別々 の標準蛋白質濃度 (高低) を各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。図 2と2 Dは、3 つの独立した試金からターゲット検体の測定間変動を表します。測定内の精密実験と高低標準濃度を行った 3 とそれぞれ独立した実験の複製します。ターゲット蛋白質の計算される濃度の最小変動がはっきりと見えるです。
マウス脾細胞サイトカイン発現プロファイルを尋問でビーズを用いたフローサイトメトリーによるアッセイの有用性を実証するために様々 な作動条件の下で培養。些細のコントロールでは、セルも LP、抗 CD3/抗 CD28 抗体またはホルボール 12-ミリスタート 13-アセタート イオノマイシンと培養。細胞培養上清は、48 時間後、マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して試金を収集しました。この実験から定量化の結果は図 3で表され、サイトカイン濃度に及ぼす刺激条件を明確に線引き。
上記結果は実験者がありよい実験室技術提供の試金のプロトコルに続く限り、典型的であります。この試金の形式でエラーのソースは、サンプルの分析に使用される流れの cytometer でインキュベーション時間、洗浄、試薬ボリュームの偏差や不適切な PMT 設定からを発生します。図 4 a散布図では、成功した試金からプロットは、明確に定義された 2 の異なるビーズ人口を示しています。これは、図 4 b、どこに洗濯とプロトコルのコンプライアンスの低下が 2 つの集団をぼかしビーズ凝集体に導いたに対比ことができます。さらに、左下腹部の残骸によって証明されるようゲート イベントのみの優先のフォーマットではなく、分析の合計 cytometer イベントが輸出されました。設定適切な cytometer は、このアッセイで信頼性の高いデータを生成するのに不可欠です。図 4適切な pmt 関数の設定は APC 分類チャネル 6 検体のそれぞれの解像度のこと。不適切な光電子増倍管の設定は図 4 APC チャネルが重複分類強度を持つビーズ集団で提示したようなデータになります。試金ビーズの明確に定義された集団なし濃度を計算することが可能になりますので、試金は無効になります。
図 2: 標準曲線の範囲と測定精度。(A)マウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して生成された代表的な標準的なカーブです。標準的な曲線は、各アッセイで実行されなければなりません。(B ・ C)測定内の有効桁数です。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルを各サンプル 16 複製し、1 つの分析で行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。(D ・ E)測定間の精度。ターゲット蛋白質 (高低) の濃度の異なる 2 つのサンプルは、各サンプルに対して 3 の複製を 3 つの独立したアッセイで行った。データは、平均 + 標準偏差として表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 代表結果の定量化します。37 ° C + 5% CO2様々 な条件下で培養したマウス脾細胞 (1 x 10 の6セル): 些細、LPS (100 ng/mL)、αCD3 (1 μ G/ml プレート コーティング) + αCD28 (1 μ g/mL 水溶性)、PMA (20 ng/mL) + イオノマイシン (500 ng/mL)。培養上清は 48 時間後に収集されたし、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して量を示されます。刺激条件に応じて各種サイトカイン発現プロファイルが明確に表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 失敗した試金と成功の結果します。(A)成功した試金微粒子集団の異なるビーズ人口しているが。(B)失敗したアッセイでお越しの貧しい人口分離、ビーズの集計、および収集されたイベントが多すぎます。(C)正常な試金がゲートし、定量化しやすい分類蛍光チャネルの強度が明確に定義します。(D)失敗した試金が不十分な分離と分類強度定量化を難しく、複数のビーズ集団を重複します。注意付着試金のプロトコルを介してこれらのエラーの多くを回避できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 標準曲線 | 感度 (pg/mL) | ||||
| 検体 | フィット式 | CV | R2 | 分。 | Max。 |
| IFN-Γ | 5 P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) | 1.77% | 0.99 | 2.1 | 18105.0 |
| IL-5 | 5 P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) | 1.32% | 1 | 1.9 | 14514.0 |
| TNF Α | 5 P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) | 1.48% | 0.99 | 1.9 | 20109.0 |
| IL-2 | 5 P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) | 1.34% | 1 | 1.9 | 25109.0 |
| IL-6 | 5 P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37) | ||||
表 1: 標準的なカーブ フィットとアッセイ感度。データ解析ソフトウェアは、マルチプレックス アッセイに含まれているすべての分析の標準的な曲線の生成に使用されました。この全自動分析アッセイからアルゴリズムを希釈シリーズ規格にふさわしい堅牢な 5 パラメーター曲線を適用し、検出の理論的な限界を使用してアッセイ感度の定義にも使用されました。
Discussion
このプロトコルで記述されているアッセイ フォーマットは、実験者を提供された生体試料中の可溶性調停プロファイルの堅牢な定量化は良い研究室技術と推奨されるプロトコルに準拠して提供できます。
信頼性の高い結果を保証するために従う必要がありますいくつかの主要な手順があります。まず、ポリプロピレン チューブにのみ希釈後、アッセイバッファー推奨、フルタイムを再構成する組換え基準を許可しなければなりません。ポリスチレンのチューブは、蛋白質の標準曲線を生成するときに低信号につながることができるチューブの壁への付着を促進することが。第二に、適切な培養手順中に揺れが重要です。適切な撹拌せず試金ビーズの結合特性を著しく妨げられること。さらに、インキュベーションのステップの間の適切な洗浄も必要です。実験者は過剰試薬がプロトコルの次のステップを開始する前に井戸から削除されることを確認してください。使用して試金ビーズ フローサイトの機器設定は、同様に最適化されなければなりません。特に、PMT の設定を調整して、適切なビードの分離と標準的なカーブの広いダイナミック レンジを確保する必要があります。最後に、cytometer で分析される直前にビーズに vortexed 適切なサスペンションを保証するために、集計結果を曲げるの形成を回避する必要があります。
このプロトコルは、研究者はプレート全体の大規模な分析を実行する前に、換散のプロトコルを最適化するために喜んで提供される組織乳剤として本稿で説明したサンプルの種類を分析する可能性のある変更ことができます。実際の手法は、組織の種類によってもちろん異なりますただし、一般的にプロトコルがイオンの塩の生理学的濃度、変性無農薬、好ましくない洗剤を含む中性 pH バッファーを使用する必要があります。洗剤を使用する必要がある場合非イオン性洗剤濃度は最小値 (例えばは 1% 以上) に保つ必要があります。バッファーは、標的タンパク質の分解を防ぐために十分なプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。換散のプロトコルが使用されるに関係なく微粒子分析の前に削除する最終準備を遠心する必要があります。
試金の制限に関する生物学的サンプルの型内の試料ターゲットの濃度が異なります。適切濃度を定量化するために、標準的なカーブのための上位および下位の値に収まる必要があります。カーブの値の外挿は、必ずしも信頼性がないと、お勧めしません。したがって調査官は、完全版の試金を実行する前にパイロット実験でそれらの特定のサンプルの希釈液を最適化する必要があります。さらに、試金するのに生物学的サンプルの入念な準備は、このアッセイの形式の成功に重要です。Lipemic、溶血されました、または蛋白質の破片を含むサンプルはこの免疫測定法の基本原則を定義する抗原抗体の相互作用に影響を与える、解釈である結果をレンダリングします。
この試金はいくつかの理由のための既存の定量化方法に関して重要です。正しく実行されると、アッセイの形式することができます量的に表わす伝統的な ELISA アッセイを使用してサンプルを分析する必要があるよりもはるかに小さいボリュームを使用してサンプルから最大 13 検体。このアッセイ フォーマットも必要ありません専用計測を実行するために。これは、アッセイは、一般的に使用される流れの cytometers の任意の数を使用して実行できる、他の市販のビーズを用いたイムノアッセイと比較利点です。
健康ネットワーク分泌因子とサイトカイン演じる役割への科学的な調査と病が拡大しています。本稿で説明している分析書式は、これらの多面的で複雑な現象を理解しようとする研究者にとって貴重なツールを使用できます。アクティブな生物医学研究プログラムは、だけでなくエリアなど、一般化された炎症6、におけるサイトカイン ネットワークの役割だけでなく、アテローム性動脈硬化、癌、neuroinflammationなど特定の病気の状態のコンテキストを探検し始めています。15,16,17。間違いなく、調査は、これら慢性疾患治療の検索が拡張されるとこれらの分野で成長を続けるでしょう。これらの疾患に関連付けられている溶性メディエーターの正確性と信頼性の定量化のための必要性は、重要な研究の優先順位になります。
Disclosures
著者は、本稿に記載されている試薬を製造する BioLegend によって用いられます。株式会社 Vigene 技術は、本稿に記載されている分析から生成されたデータを分析するために使用 LEGENDplex データ解析ソフトウェアを開発しました。
Acknowledgments
著者はバイオ マーカーと免疫アッセイの貢献を認識したいアッセイの開発製品開発チーム。さらに、データ分析ソフトウェア パッケージの設計の彼らの共同の努力の Vigene テクノロジー株式会社に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
References
- Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
- Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
- Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
- Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
- Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).
- Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
- Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
- Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
- Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
- Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
- Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
- Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
- Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
- LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
- Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
- West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
