Dit protocol beschrijft de kwantificering van meerdere cytokine doelen tegelijkertijd in weefselkweek supernatant gestimuleerd muis splenocytes met behulp van multiplex kraal gebaseerde immunoassay platform en een stroom cytometer verkregen.
Immunoassay kraal gebaseerde dienst hetzelfde fundamentele principe als sandwich-immunoassay. Kralen, die kan worden gedifferentieerd door grootte en interne allophycocyanin (APC) fluorescentie intensiteit, zijn geconjugeerd aan antilichamen specifiek voor een bepaalde stof te vangen. Een geselecteerde panel van gedefinieerde opnamesets kraal is vervolgens geïncubeerd met een biologische steekproef met doel analyten specifiek voor de opname-antilichamen. Een biotinyleerd detectieantilichaam cocktail wordt toegevoegd, die leidt tot de vorming van capture kraal-analyt-detectieantilichaam broodjes.
Tot slot, streptavidine-phycoerythrin (SA-PE) wordt toegevoegd, die bindt aan biotinyleerd detectie antilichamen, verstrekken van fluorescent signaal intensiteit in verhouding tot de hoeveelheid afhankelijke analyt. De PE fluorescent signaal van kralen van de analyt-specifieke regio’s is gekwantificeerd aan de hand van cytometry van de stroom en de concentraties van bepaalde analyten worden bepaald met behulp van de software van de analyse van de gegevens en de standaard curve gegenereerd in de test.
In dit experiment gebruiken we een muis T helper cytokine panel te kwantificeren gelijktijdig de concentratie van 13 aparte cytokine doelen in weefselkweek supernatant verzameld van muis splenocytes gekweekte onder verschillende stimulerend condities.
Cytokines bemiddelen in hun rol als oplosbare signalering moleculen, de sterk gecoördineerde en multifactoriële processen die host immunologische reacties regeren. Ze worden uitgedrukt in alle stadia van het inflammatoire proces, vanaf de initiatie in de resolutie, en regelen van een complexe interactie-netwerk waarin hun eigen synthese en die van hun cellulaire receptoren1. Deze communicatienetwerk is gelaagd met een complexiteit die verder gaat dan de synergistische of antagonistische relatie die zich kunnen voordoen tussen de afzonderlijke onderdelen. Inderdaad, zijn vele cytokines bekend redundante of op zijn minst gedeeltelijk overlappende functies2,3te delen.
Geïntegreerde systemen biologie benaderingen die meerdere cytokine analyten tegelijkertijd te kwantificeren bieden momenteel een steeds grondig inzicht in de unieke cytokinomes die orkestreren van de immuunrespons die ten grondslag liggen aan meerdere ziekte staat4,5. Deze ziekte staten variëren van veralgemeende ontsteking tot kanker, neurodegeneratieve omstandigheden, en hart-en vaatziekten6,,7,,8,9.
Dergelijke cytokine-netwerken kunnen worden ondervraagd effectief gebruik maken van LEGENDplex kraal gebaseerde immunoassay. Deze tests zijn gebaseerd op hetzelfde principe als de sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), en gebruik van fluorescentie gecodeerd microbolletjes met capture antilichamen covalent gekoppeld aan hun oppervlak. Deze antilichamen zijn geïmmobiliseerd op oppervlakten veel kleiner dan die van traditionele ELISA formaten. Hierdoor kunnen deze gehaltebepalingen moet worden uitgevoerd met veel minder monstervolume, terwijl op hetzelfde moment vermindering van aspecifieke bindend en verstrekken multiplexed analyse van verschillende analyten.
De bepaling die is beschreven in dit protocol maakt gebruik van deze technologie te kwantificeren tot 13 doelstellingen tegelijkertijd. Gegevens uit deze test kunnen worden verkregen met behulp van een grote verscheidenheid van algemeen beschikbare flow cytometers en in tegenstelling tot andere beschikbare tests vereist niet het gebruik van speciale assay-specifieke instrumentatie. Met een groeiende catalogus van gevalideerde analyt panelen, zijn deze tests gebruikt in verschillende lopende biomedisch onderzoek projecten10,11,12,,13.
Om aan te tonen van het gemak en de nut van de bepaling-indeling, in dit experiment we een muis T-helper cytokine-panel gebruiken om te kwantificeren scheiden 13 cytokine concentraties van weefselkweek supernatant muis splenocytes gekweekt onder meerdere verkregen stimulerend voorwaarden. Naast weefselkweek supernatant, kan deze test ook worden uitgevoerd met behulp van serum of plasma monsters.
8. Ga naar gegevensanalyse Opmerking: de FCS bestanden gegenereerd op de stroom cytometer moeten worden geanalyseerd met behulp van de data analysesoftware, die kan worden gedownload voor gratis 14. Installeren van de software van de analyse van de gegevens op een PC. Alle assay FCS bestanden overbrengen naar de computer waarop de analysesoftware. De licentie sleutel dongle (meegeleverd in de kit) aansluit op een USB-poort van de computer. Lanceren van de data-analysesoftware. Klik op de blauwe " bestanden toevoegen " knop bevindt zich aan de bovenkant van het scherm. Navigeer naar de map waarin de bestanden van de FCS van de bepaling in het pop-upvenster dat verschijnt. Klik en sleep alle assay FCS-bestanden uit het pop omhooggaande venster naar het display van de software. Alle bestanden moeten nu worden weergegeven in een lijst. Klik op de groene " volgende " knop op het bodemrecht van het scherm. Klik met de linkermuisknop ingedrukt houden om te slepen van de kleine blauwe standaard curve knoppen (C7 aan C0) naar hun overeenkomstige FCS-bestanden uit de lijst te definiëren van de standaard curve. Klik op de groene " volgende " knop op het bodemrecht van het scherm te openen de gating knal opwaarts venster. Aan de linkerzijde van het gating venster Voer de namen van zowel de A en B kraal regio’s assay analyt doelstellingen en hun bijbehorende kraal ID (te vinden in de handleiding met de bepaling) in oplopende volgorde. Selecteer het gating gereedschap vanaf de bovenkant van het pop omhooggaande venster en gebruik het om te tekenen 2 poorten in het proefvlak FSC vs. SSC, een rond de A-kralen en een tweede rond de B kralen. Bekijk de APC vs. PE scatter percelen die verschijnen onder de FSC vs. SSC plot die worden weergegeven. Er zullen 6 banden van de analyt in de A-kralen (linker perceel) en 7 analyt bands in de B-kralen (juiste perceel). Opmerking: Gates kan worden getekend handmatig door te selecteren met het gereedschap Gummetje aan de bovenkant en klikken om te verwijderen van een bepaalde poort. De gating tool kan vervolgens worden geselecteerd en gebruikt een poort handmatig toe te passen om de gewenste band regio. Klik op de groene " OK " knop aan de gating knal opwaarts venster sluiten en terugkeren naar de lijst met bestanden van FCS. Definiëren van eventuele verdunningen die zijn aangebracht in biologische monsters door rechts te klikken op een bestand, het selecteren van " verdunning vouwen " in het menu, en de invoer de juiste waarde. Klik op de groene " lopen " knoop bij het bodemrecht van het scherm te genereren van de standaard curven voor de bepaling en het berekenen van de concentraties van onbekende biologische monsters.
De indeling van de test die wordt beschreven in dit protocol kan gebruikers robuuste kwantificering van oplosbare bemiddelaar profielen in biologische monsters als bedoeld de experimentator heeft goede laboratoriumpraktijken techniek en voldoet aan de aanbevolen protocol.
Er zijn enkele belangrijke stappen die moeten worden gevolgd teneinde betrouwbare resultaten. Ten eerste, de recombinante normen moeten kunnen reconstrueren in assay buffer de full-time aanbevolen, en daarna alleen verdund in polypropyleen tubes. Polystyreen buizen kunnen de bevordering van de hechting van de eiwitten van de wanden van de buizen, die tot lage signalen leiden kan bij het genereren van de standaard curve. Tweede, goed schudden tijdens de incubatie stappen is van cruciaal belang. Zonder juiste agitatie, kunnen de bindende eigenschappen van de kralen assay ernstig worden belemmerd. Daarnaast is goede wassen tussen incubatie stappen ook vereist. De experimentator moet zorgen dat overtollige reagentia worden verwijderd uit de putten vóór de volgende stap in het protocol. Instrumenten-instellingen voor de cytometer van de stroom gebruikt om te ondervragen de assay kralen moeten eveneens worden geoptimaliseerd. In het bijzonder, moeten bet-instellingen worden aangepast om ervoor te zorgen de juiste kraal scheiding en brede dynamische bereik voor de standaard curven. Tot slot, net vóór de analyse wordt uitgevoerd op de cytometer, kralen moeten vortexed te verzekeren van de juiste schorsing en om te voorkomen dat de vorming van aggregaten die resultaten kunnen scheeftrekken.
Dit protocol kan mogelijk worden aangepast voor het analyseren van weefsel homogenates, alsmede de vormen van de steekproef besproken in dit manuscript, mits de onderzoeker bereid is voor het optimaliseren van hun lysis-protocol vóór het uitvoeren van grote, volledige plaat testen. De werkelijke techniek hangt natuurlijk af van weefseltype; het protocol moet echter in het algemeen een neutrale pH buffer met fysiologische concentraties van ionogene zouten, geen denatureren chemicaliën en bij voorkeur geen schoonmaakmiddelen gebruiken. Als wasmiddel moet worden gebruikt, dient niet-ionogene wasmiddel concentraties worden bewaard bij een minimum (bijvoorbeeld niet meer dan 1%). De buffer moet ook voldoende proteaseinhibitors Voorkom Proteolytische afbraak van doel eiwitten bevatten. Ongeacht de lysis-protocol gebruikt, moeten de laatste voorbereidingen worden gecentrifugeerd om te verwijderen van de deeltjes vóór de analyse.
Met betrekking tot beperkingen van de test, de concentratie van de analyt doelen in biologische steekproef typen kunnen sterk variëren. Om goed kwantificeren concentraties van de analyt, moeten ze vallen binnen de hoogste en laagste waarden voor de standaard curve. Extrapolatie van de waarden van de curve is niet noodzakelijkerwijs betrouwbaar en niet aan te bevelen. Onderzoekers moeten daarom optimaliseren verdunningen voor hun bijzondere samples in proefprojecten voordat u een volledige-plaat assay. Daarnaast is de zorgvuldige voorbereiding van de biologische monsters te worden vehiculumcontrolegroep primordiaal voor het welslagen van deze bepaling-indeling. Monsters die zijn lipemic, hemolyzed of bevatten eiwitten puin zal beïnvloeden de antigeen-antilichaam interactie die het basisprincipe van deze immunoassay definiëren en maken van de resultaten die uninterpretable zijn.
Deze bepaling is van belang met betrekking tot bestaande kwantificering methoden om verschillende redenen. Wanneer het goed wordt uitgevoerd, kan de bepaling-indeling maximaal 13 analyten uit een monster via een veel kleiner volume dan nodig zijn zou om het analyseren van het monster met behulp van traditionele ELISA-testen, kwantificeren. Deze bepaling-indeling ook vereist geen speciale instrumentatie om te worden uitgevoerd. Dit is een voordeel ten opzichte van andere verkrijgbare kraal gebaseerde immunoassay zoals de test kan worden uitgevoerd met behulp van een willekeurig aantal veelgebruikte flow cytometers.
Wetenschappelijk onderzoek naar de rol gespeeld door secreted factoren en cytokine netwerken in gezondheid en ziekte breidt zich uit. De indeling van de test die wordt beschreven in dit manuscript kunnen een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers willen begrijpen van deze veelzijdige en complexe verschijnselen. Actieve biomedisch onderzoek programma’s beginnen te verkennen van de rol van cytokine netwerken in niet alleen gebieden zoals veralgemeende ontsteking6, maar ook in context van bepaalde ziekte staten zoals atherosclerose, kanker, en neuroinflammation 15,16,17. Onderzoek zal ongetwijfeld blijven groeien in deze gebieden, zoals het zoeken naar nieuwe therapeutics naar deze chronische aandoeningen breidt zich uit. De noodzaak voor accurate en betrouwbare kwantificering van de oplosbare bemiddelaars die zijn gekoppeld aan deze ziekten zullen een kritisch onderzoeksprioriteit blijven.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs wil erkennen van de bijdragen van de Biomarkers en Immuno-assays Product Development team voor de ontwikkeling van de bepaling. Daarnaast bedank we Vigene Tech, Inc. voor hun gezamenlijke inspanningen bij het ontwerpen van de data-analyse software-pakketten.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |