Dieses Protokoll beschreibt die Quantifizierung der mehrere Zytokin Ziele gleichzeitig in Gewebekultur Überstände von stimulierten Maus Splenocyten Multiplex-Perle-basierte Immunoassay-Plattform mit einem Durchflusszytometer gesammelt.
Perle-basierten Immunoassays beschäftigen das gleiche Grundprinzip als Sandwich-Immunoassays. Perlen, die unterscheiden sich durch Größe und interne Allophycocyanin (APC) Fluoreszenz-Intensität, sind Antikörper, die spezifisch für einen bestimmten Analyten konjugiert zu erfassen. Als nächstes wird eine ausgewählte Jury aus definierte Abscheidung Bead Sets mit einer biologischen Probe mit Ziel Analyten spezifisch für die Capture-Antikörper inkubiert. Eine biotinylierte Detektionsantikörper cocktail wird hinzugefügt, was führt zur Bildung von Capture Wulst-Analyten-Detektionsantikörper Sandwiches.
Zu guter Letzt wird Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE) hinzugefügt, die an biotinylierte Erkennung Antikörper, Bereitstellung von fluoreszierenden Signalintensitäten im Verhältnis zur Menge des gebundenen Analyten bindet. Die PE fluoreszierendes Signal der Analyt-spezifische Perlen Regionen wird mit Durchflusszytometrie quantifiziert und die Konzentrationen von bestimmten Analyten werden mit Daten-Analyse-Software und der Standardkurve generiert in der Probe bestimmt.
In diesem Experiment verwenden wir eine Maus T Helfer Zytokin Panel, um gleichzeitig die Konzentration von 13 separate Zytokin-Ziele in Gewebekultur Überstände von Maus Splenocyten kultivierten verschiedene stimulierende Bedingungen gesammelt zu quantifizieren.
In ihrer Rolle als lösliche Signalmoleküle vermitteln Zytokine die hochgradig koordinierten und multifaktorielle Prozesse, die Host Immunreaktionen zu regieren. Sie werden in allen Phasen des entzündlichen Prozesses, von der Initiierung, Auflösung, ausgedrückt und ein komplexes Zusammenspiel-Netzwerk, das eigene Synthese und dazu ihre zellulären Rezeptoren1gehört zu regulieren. Dieses Kommunikationsnetz ist geschichtet mit einer Komplexität, die die synergistischen oder antagonistischen Beziehungen, die eventuell existieren zwischen den einzelnen Komponenten hinausgeht. In der Tat sind viele Zytokine bekannt, überflüssig oder zumindest teilweise überlappenden Funktionen2,3teilen.
Integrierte Systeme Biologie-Ansätze, die gleichzeitig mehrere Zytokin Analyten zu quantifizieren sind derzeit zunehmend umfassenden Einblick in die einzigartige Cytokinomes zur Verfügung, die die Immunantwort mehrere Grunderkrankung zu orchestrieren 4,5erklärt. Diese Krankheit Staaten reichen von generalisierten Entzündung, Krebs, Neuro-degenerativen Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Krankheit6,7,8,9.
Diese Zytokin-Netze können effektiv mit LEGENDplex Wulst-basierten Immunoassays abgefragt werden. Diese Tests basieren auf dem gleichen Prinzip wie das Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) und verwenden Fluoreszenz codiert Mikrosphären mit Capture Antikörper kovalent an ihrer Oberfläche befestigt. Diese Antikörper sind auf Flächen, die viel kleiner als die von traditionellen ELISA Formate immobilisiert. Dadurch können solche Tests mit weit weniger Probenvolumen durchgeführt werden, während bei gleichzeitiger Verringerung der unspezifischen Bindung und bietet Analyse von mehreren Analyten gemultiplext.
Der Test in diesem Protokoll beschriebenen nutzt diese Technologie, um bis zu 13 Ziele gleichzeitig quantitate. Daten aus dieser Assay können mit einer Vielzahl von gängigen fließen Cytometers bezogen werden und im Gegensatz zu anderen verfügbaren Tests erfordert nicht die Verwendung von speziellen Assay-spezifische Instrumentierung. Mit einem wachsenden Katalog von validierten Analyten Platten wurden diese Tests in mehreren biomedizinischen Forschung Projekte10,11,12,13verwendet.
Um zu demonstrieren, die Leichtigkeit und den Nutzen des Formates Assay in diesem Experiment, das wir eine Maus T Helfer Zytokin-Fenster verwenden, um quantitate trennen 13 Zytokin-Konzentrationen von Gewebekultur Überstände Maus Splenocyten kultiviert unter mehreren gewonnenen stimulierende Bedingungen. Neben Gewebekultur Überstände kann dieser Test auch mit Serum bzw. Plasma-Proben durchgeführt werden.
In diesem Protokoll beschriebene Assay-Format bieten robuste Quantifizierung der löslichen Mediator Profile in biologischen Proben zur Verfügung gestellt des Experimentators hat gute Labortechnik und hält sich an die empfohlene Protokoll.
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die befolgt werden müssen, um zuverlässige Ergebnisse zu gewährleisten. Erstens darf die rekombinante Standards in Testpuffer die volle Zeit empfohlen, und nach nur verdünnt in Polypropylenröhrchen wiederherzustellen. Polystyrol-Röhren können die Einhaltung der Proteine an der Wand der Rohre, fördern, die zu geringe Signale führen kann, Erstellung die Standardkurve. Zweite, richtige Schütteln während Inkubationsschritte ist von entscheidender Bedeutung. Ohne richtige Erregung können die Bindungseigenschaften der Assay-Perlen stark behindert werden. Darüber hinaus ist auch richtige waschen zwischen Inkubationsschritte erforderlich. Der Experimentator muss dafür sorgen, dass überschüssige Reagenzien aus dem Brunnen vor dem Beginn des nächsten Schritt im Protokoll entfernt werden. Instrumenten-Einstellungen für das Durchflusszytometer verwendet, um die Assay-Perlen zu verhören müssen auch optimiert werden. Insbesondere müssen RMZ Einstellungen angepasst werden, um richtige Wulst Trennung und breite dynamische Bereiche für die standard Kurven zu gewährleisten. Schließlich müssen nur vor auf die Cytometer analysiert, Perlen liegen verwirbelt, richtige Aufhängung zu versichern und die Bildung von Aggregaten die Ergebnisse verzerren können, zu vermeiden.
Dieses Protokoll kann möglicherweise geändert werden, um Gewebe Homogenates sowie die Probentypen diskutiert in dieser Handschrift zu analysieren, vorausgesetzt, die Forscher bereit, ihrer Lyse-Protokoll vor der Durchführung großer, volle Platte Assays zu optimieren. Die eigentliche Technik variiert natürlich je nach Gewebetyp; im Allgemeinen sollten das Protokoll jedoch einen neutralen pH-Puffer mit physiologischen Konzentrationen der ionische Salze, keine denaturierenden Chemikalien und vorzugsweise keine Reinigungsmittel verwenden. Wenn Waschmittel verwendet werden muss, sollte nicht-ionische Waschmittel Konzentrationen auf ein Minimum (z.B. nicht mehr als 1 %) gehalten werden. Der Puffer sollte auch ausreichend Protease-Inhibitoren zur Vermeidung proteolytischen Abbau von Zielproteinen enthalten. Unabhängig von der Lyse-Protokoll verwendet sollten die letzten Vorbereitungen zentrifugiert werden, um Partikel vor der Analyse zu entfernen.
Über Assay Einschränkungen können die Konzentrationen von Analyten Ziele in biologischen Probentypen stark variieren. Um richtig Analytkonzentrationen quantifizieren, müssen sie in der oberen und unteren Werten für die Standardkurve fallen. Extrapolation der Werte der Kurve ist nicht unbedingt zuverlässig und nicht empfehlen. Die Ermittler müssen daher Verdünnungen von ihrer bestimmten Proben in Pilotversuchen vor dem Ausführen eines voll-Platte-Assays optimieren. Darüber hinaus ist die sorgfältige Vorbereitung der biologischen Proben zu untersucht werden ausschlaggebend für den Erfolg des Datenformats Assay. Proben, die Lipämische, hämolysiert, oder enthalten Protein-Ablagerungen beeinträchtigen die Antigen Antikörper-Interaktionen, die das Grundprinzip dieses Immunoassay definieren sowie Rendern nicht interpretierbar sind.
Dieser Test ist in Bezug auf bestehende Quantifizierungsmethoden aus mehreren Gründen bedeutsam. Wenn richtig ausgeführt, kann der Assay-Format quantitate bis zu 13 Analyten aus einer Stichprobe mit weit geringeren Umfang als wäre erforderlich, um die Probe mit traditionellen ELISA-Assays zu analysieren. Dieser Assay-Format erfordert auch keine dedizierten Instrumentierung um durchgeführt werden. Dies ist ein Vorteil im Vergleich zu anderen handelsüblichen Bead-basierten Immunoassays, wie der Test mit einer beliebigen Anzahl von häufig verwendeten fließen Cytometers ausgeführt werden kann.
Wissenschaftliche Untersuchung über die Rolle gespielt von sezernierten Faktoren und Zytokin-Netzwerke in Gesundheit und Krankheit erweitert. In diesem Manuskript beschriebene Assay-Format kann ein wertvolles Werkzeug für die Forscher versuchen, diese vielschichtige und komplexe Phänomene zu verstehen. Aktive biomedizinische Forschungsprogramme fangen an, die Rolle der Zytokin-Netzwerke nicht nur Bereiche wie generalisierte Entzündung6, aber auch in Zusammenhang mit bestimmten Krankheitszuständen wie Arteriosklerose, Krebs und Neuroinflammation erkunden 15,16,17. Zweifellos wird die Untersuchung weiterhin in diesen Bereichen zu wachsen, wie die Suche nach neuer Therapeutika zur Behandlung dieser chronischen Erkrankungen erweitert. Die genaue und zuverlässige Quantifizierung der löslichen Mediatoren verbunden mit diesen Krankheiten wird eine kritische Forschungspriorität bleiben.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die Beiträge von Biomarkern und Immuno-Assays erkennen Product Development Team zur Entwicklung des Assays. Darüber hinaus möchten wir danken Vigene Tech, Inc. für deren gemeinsamen Anstrengungen bei der Gestaltung der Daten-Analyse-Software-Pakete.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |