该协议描述了多细胞因子靶点的定量, 同时在组织培养清收集的刺激小鼠脾使用多路微珠基免疫分析平台和流式仪。
Bead-based 免疫采用与三明治免疫相同的基本原理。捕获珠, 可以区分大小和内部复方 (APC) 荧光强度, 是共轭的抗体特有的特定分析物。接下来, 一个被定义的捕获珠集的选择面板孵化与一个生物样品包含目标分析特异的捕获抗体。化检测抗体鸡尾酒, 这导致形成捕获珠分析物检测抗体三明治。
最后, 加入亲和-藻 (SA PE), 它结合到化检测抗体, 提供荧光信号强度的比例与绑定的分析物的数量。利用流式细胞仪对分析物特定珠区的 PE 荧光信号进行量化, 并利用数据解析软件和该检测中生成的标准曲线确定特定分析的浓度。
在本实验中, 我们使用小鼠 T 帮助细胞因子的小组, 同时量化的浓度13分离细胞因子目标的组织培养清收集的小鼠脾在不同的刺激条件下培养。
作为可溶性信号分子的作用, 细胞因子介导了控制宿主免疫应答的高度协调和多因素过程。它们是在炎症过程的所有阶段, 从起始到解决, 并调节一个复杂的相互作用网络, 包括他们自己的合成和他们的细胞受体1。这种通信网络的复杂性超出了单个组件之间可能存在的协同或对抗性关系。事实上, 许多细胞因子是已知的共享冗余或至少部分重叠的功能2,3。
综合系统生物学方法, 同时量化多个细胞因子分析目前正在提供一个越来越全面的理解独特的 cytokinomes, 协调免疫反应的基础上多疾病状态4,5。这些疾病状态范围从普遍的炎症到癌症, 神经退化的情况和心血管疾病6,7,8,9。
这种细胞因子网络可以使用 LEGENDplex bead-based 免疫进行有效的审讯。这些化验是基于与夹心酶联免疫吸附法 (ELISA) 相同的原理, 并使用荧光编码微球与捕获抗体共价键连接到他们的表面。这些抗体固定在比传统 ELISA 格式所要求的表面积小得多的表面上。这使得这样的化验能够以更少的样本量进行, 同时减少非特异性结合, 并提供多分析的多路复用分析。
本协议中描述的检测方法利用这一技术来同时定量多达13目标。从这个分析数据可以得到使用广泛的各种常见的流动 cytometers, 不像其他可用的化验不需要使用专门的化验专用仪器。随着经过验证的分析物面板的扩展目录, 这些化验已被用于几个正在进行的生物医学研究项目10,11,12,13。
为了证明化验格式的易用性和实用性, 在本实验中, 我们使用小鼠 T 帮助细胞因子定量13分离细胞因子的浓度从组织培养清得到的小鼠脾培养下多刺激条件。除了组织培养清, 这种检测也可以使用血清或血浆样品进行。
本协议所描述的检测格式可以提供生物样品中可溶性介质的定量, 只要实验者有良好的实验室技术, 并遵守推荐的协议。
为了保证可靠的结果, 必须遵循几个关键步骤。首先, 必须允许重组的标准, 在化验缓冲区的全部时间建议, 并在只稀释后, 聚丙烯管。聚苯乙烯管可以促进蛋白质粘附在管子的壁上, 在生成标准曲线时会导致低信号。第二, 在孵化过程中适当的晃动是至关重要的。没有适当的搅拌, 检测珠子的结合特性就会受到严重的阻碍。此外, 还需要在孵化步骤之间进行适当的冲洗。实验者必须确保在开始下一步的协议之前从油井中除去多余的试剂。仪器设置的流式细胞仪用于审问的化验珠子, 必须优化, 以及。特别是, PMT 设置必须调整, 以确保正确的珠分离和广泛的动态范围的标准曲线。最后, 在对细胞仪进行分析之前, 必须 vortexed 珠, 以确保适当的悬浮和避免形成的骨料, 可以扭曲的结果。
该协议可能会被修改, 以分析组织匀以及本手稿中讨论的样本类型, 只要研究员愿意优化他们的裂解协议之前, 执行大型, 全板的化验。实际的技术当然会因组织类型的不同而有所不同;然而, 一般来说, 该协议应使用一个中性的 pH 缓冲, 其中含有离子盐的生理浓度, 没有变性化学品, 最好没有洗涤剂。如果必须使用洗涤剂, 非离子洗涤剂浓度应保持在最低限度 (如不超过 1%)。该缓冲液还应含有足够的蛋白酶抑制剂, 以防止靶蛋白水解降解。无论使用何种裂解协议, 最后的准备工作都应离心, 以便在分析之前去除微粒。
关于化验的限制, 生物样品类型中分析物靶点的浓度可能有很大差异。为了正确地量化分析物的浓度, 它们必须属于标准曲线的顶部和底部值。对曲线值的推断不一定可靠, 也不推荐。因此, 研究者必须在进行 full-plate 试验之前, 在试验中优化稀释的样品。此外, 仔细准备要化验的生物样品对这种化验格式的成功至关重要。lipemic、溶血或含有蛋白质碎片的样品会影响抗原抗体相互作用, 从而确定免疫分析的核心原理, 并呈现出 uninterpretable 的结果。
对于现有的量化方法, 由于多种原因, 这种检测具有重要意义。当正常运行时, 检测格式可以定量13分析从一个样本使用远远小于需要分析样品使用传统的 ELISA 测定。这种化验格式也不需要专门的仪器, 以执行。这是一个优势相比, 其他商业可用的 bead-based 免疫, 因为化验可以运行使用任何数量的常用流 cytometers。
科学探究分泌因子和细胞因子网络在健康和疾病中所起的作用正在扩大。这篇手稿中描述的化验格式可以成为研究人员了解这些复杂现象的重要工具。积极的生物医学研究计划正在开始探索细胞因子网络的作用, 不仅在诸如广泛性炎症6, 而且在特定的疾病状态, 如动脉粥样硬化, 癌症和 neuroinflammation 的背景下,15,16,17。毫无疑问, 调查将继续在这些领域增长, 因为寻找治疗这些慢性病的新疗法扩大。对与这些疾病相关的可溶性介质的准确和可靠的定量化的需要仍然是一个重要的研究重点。
The authors have nothing to disclose.
作者希望确认生物标志物和免疫测定产品开发团队对该方法的发展的贡献。此外, 我们还要感谢 Vigene 技术, Inc. 在设计数据分析软件包方面的合作。
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |