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Immunology and Infection

एक Cytometric मनका आधारित Immunoassay मंच का उपयोग कर उत्तेजित माउस Splenocytes के मल्टीप्लेक्स Cytokine profiling

doi: 10.3791/56440 Published: November 9, 2017

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक साथ ऊतक संस्कृति supernatants उत्तेजित माउस से एकत्र में एकाधिक cytokine लक्ष्य के ठहराव का उपयोग splenocytes मल्टीप्लेक्स मनका आधारित immunoassay मंच और एक प्रवाह cytometer ।

Abstract

मनका आधारित immunoassays सैंडविच immunoassays के रूप में एक ही मूल सिद्धांत को रोजगार । कैप्चर मोतियों, जो आकार और आंतरिक allophycocyanin (APC) प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभेदित किया जा सकता है, एक विशेष analyte के लिए विशेष एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित हैं । अगले, परिभाषित कब्जा मनका सेट का एक चयनित पैनल एक जैविक नमूना कब्जा एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट analytes युक्त नमूने के साथ मशीन है । एक biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ा गया है, जो कैप्चर मनका-analyte-डिटेक्शन एंटीबॉडी सैंडविच के गठन की ओर जाता है ।

अंत में, streptavidin-phycoerythrin (एसए-पीई) जोड़ा है, जो biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी को बांधता है, बाध्य analyte की राशि के अनुपात में फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता प्रदान करते हैं । analyte के पीई फ्लोरोसेंट संकेत-विशिष्ट मोती क्षेत्रों प्रवाह cytometry का उपयोग कर मात्रा है, और विशेष रूप से analytes की सांद्रता डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और मानक परख में उत्पंन वक्र का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं ।

इस प्रयोग में, हम एक माउस टी हेल्पर cytokine पैनल का उपयोग करने के लिए एक साथ ऊतक संस्कृति supernatants में 13 अलग cytokine लक्ष्यों की एकाग्रता को बढ़ाता है माउस splenocytes विभिंन stimulatory शर्तों के तहत संस्कृति से एकत्र की ।

Introduction

के रूप में अपनी भूमिका में घुलनशील अणुओं संकेत, साइटोकिंस मध्यस्थता उच्च समंवित और multifactorial प्रक्रियाओं है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित । वे भड़काऊ प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान व्यक्त कर रहे हैं, दीक्षा से संकल्प करने के लिए, और एक जटिल संपर्क नेटवर्क है कि अपने स्वयं के संश्लेषण भी शामिल है और अपने सेलुलर रिसेप्टर्स की है कि1को विनियमित. इस संचार नेटवर्क एक जटिलता है कि synergistic या विरोधी संबंधों कि व्यक्तिगत घटकों के बीच मौजूद हो सकता है परे चला जाता है के साथ स्तरित है । वास्तव में, कई साइटोकिंस को निरर्थक या कम से आंशिक रूप से ओवरलैपिंग कार्यों2,3साझा करने के लिए जाना जाता है ।

एकीकृत सिस्टंस जीवविज्ञान दृष्टिकोण है कि एक साथ कई cytokine analytes यों तो वर्तमान में अद्वितीय cytokinomes की एक तेजी से व्यापक समझ प्रदान कर रहे है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कई रोग अंतर्निहित आर्केस्ट्रा राज्यों4,5। इन रोग राज्यों सामान्यीकृत सूजन से कैंसर, तंत्रिका अपक्षयी स्थितियों, और हृदय रोग6,7,8,9के लिए सीमा ।

ऐसे cytokine नेटवर्क को प्रभावी ढंग से LEGENDplex मनका आधारित immunoassays का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है । इन परख सैंडविच एंजाइम के रूप में एक ही सिद्धांत पर आधारित है Immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े हुए हैं, और उपयोग प्रतिदीप्ति कब्जा एंटीबॉडी के साथ microspheres इनकोडिंग covalently उनकी सतह से जुड़ी । इन एंटीबॉडी की सतह क्षेत्रों पर मैटीरियल बहुत पारंपरिक एलिसा स्वरूपों द्वारा आवश्यक उन से छोटे हैं । इस तरह की परख अब तक कम नमूना मात्रा के साथ प्रदर्शन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है, जबकि एक ही समय में गैर विशिष्ट बंधन को कम करने और कई analytes के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्रदान ।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख इस तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए 13 लक्ष्यों को एक साथ quantitate । इस परख से डेटा आमतौर पर उपलब्ध प्रवाह cytometers की एक विस्तृत विविधता का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है और अंय उपलब्ध परख के विपरीत समर्पित परख के उपयोग की आवश्यकता नहीं विशिष्ट उपकरण । मांय analyte पैनलों की एक विस्तृत सूची के साथ, इन परख कई चल रहे बायोमेडिकल अनुसंधान परियोजनाओं में इस्तेमाल किया गया है10,11,12,13

को आसानी और परख प्रारूप की उपयोगिता, इस प्रयोग में हम एक माउस टी सहायक cytokine पैनल का उपयोग करने के लिए ऊतक संस्कृति supernatants से 13 अलग cytokine सांद्रता quantitate माउस से प्राप्त splenocytes एकाधिक के तहत संस्कृति का प्रदर्शन stimulatory अटी आहेत. ऊतक संस्कृति supernatants के अलावा, इस परख भी सीरम या प्लाज्मा नमूनों का उपयोग किया जा सकता है ।

Protocol

< p class = "jove_content" > सभी पशु प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड के भीतर निहित NIH सिफारिशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था और IACUC द्वारा की स्वीकृति दी गई ।

< p class = "jove_content" फो: रख-जुलकर । भीतर-पृष्ठ = "1" > < img alt = "चित्रा 1" class = "xfigimg" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg"/>
चित्रा 1: फ़िल्टर प्लेट परख प्रक्रिया सारांश. फिल्टर प्लेट का उपयोग परख प्रदर्शन के लिए प्रोटोकॉल एक प्रमुख परख घटकों और गर्मी कदम चित्रण चित्र के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । < a href = "//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target = "blank" > इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

< p class = "jove_title" > 1. जैविक नमूना तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: चुना संरचनात्मक साइट और रक्त संग्रह की मात्रा प्रत्येक व्यक्ति अंवेषक के विवेक को छोड़ दिया है और परख के परिणाम को प्रभावित नहीं करेगा । हालांकि, एक बार वे प्राप्त कर रहे हैं, नमूने नीचे सूचीबद्ध चरणों के अनुसार संभाला जाना चाहिए ।

  1. सीरम के नमूनों की तैयारी
    1. पसंदीदा संग्रह ट्यूब में रक्त की वांछित मात्रा इकट्ठा करने और यह थक्का करने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए अनुमति देते हैं.
    2. 10 मिनट के लिए नमूना केंद्रापसारक कमरे के तापमान पर १,००० x g पर ।
    3. निकालें सीरम और परख तुरंत या aliquot में microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर नमूनों में & #8804;-20 & #176; ग.
  2. प्लाज्मा के नमूनों की तैयारी
    1. ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) लेपित रक्त संग्रह ट्यूबों का उपयोग रक्त की वांछित मात्रा इकट्ठा ।
    2. 10 मिनट के लिए १,००० एक्स जी में कमरे के तापमान पर संग्रह के 30 मिनट के भीतर केंद्रापसारक ।
    3. तुरंत प्लाज्मा और परख निकालें, या aliquot में microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर नमूनों में & #8804;-20 & #176; C.
  3. टिशू कल्चर Supernatant के नमूने तैयार
    1. के लिए नमूना 10 मिनट पर १,५०० x g पर 4 & #176; C कोशिकाओं और मलबे को हटाने के लिए.
    2. इकट्ठा supernatant और परख तुरंत या aliquot में microcentrifuge ट्यूबों और स्टोर में & #8804;-20 & #176; ग.
  4. जमे हुए जैविक नमूनों की गल
    1. पूरी तरह से पिघल बर्फ पर किसी भी पहले जमे हुए जैविक नमूने, और भंवर संक्षेप में उपयोग करने से पहले । से अधिक 2 फ्रीज/गल चक्र से बचें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त नमूनों को संवर्धन बालब/सी माउस splenocytes (1 x 10 6 कोशिकाओं पर ३७ & #176 द्वारा प्राप्त किया गया था; c + 5% कं 2 के तहत विभिन्न शर्तें: उत्तेजित, एलपीएस (१०० एनजी/एमएल), & #945; CD3 (1 & #181; g/एमएल प्लेट कोटेड) + & #945; CD28 (1 & #181; छ/एमएल घुलनशील), पमा (20 एनजी/एमएल) + Ionomycin (५०० एनजी/ कल्चर supernatants ४८ h के बाद एकत्र किए गए और धारा १.३ में वर्णित के रूप में संसाधित किया गया ।
< p class = "jove_title" > 2. रिएजेंट की तैयारी

  1. पूर्व-मिश्रित एंटीबॉडी-मैटीरियल मोतियों की तैयारी
    1. Sonicate एक sonicator स्नान में कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पूर्व मिश्रित मोतियों की बोतल, और फिर भंवर 30 एस के लिए उपयोग करने से पहले । यदि कोई sonicator स्नान उपलब्ध है, भंवर समय बढ़ाने के लिए 1 min.
  2. की तैयारी धो के बफर
    1. लाएगी 20x & #160; धो बफर (20x & #160;P 1% के बीच के साथ बी एस-20) कमरे के तापमान और भंवर के लिए किट के साथ आपूर्ति के समाधान में सभी लवण लाने के लिए ।
    2. पतला 25 मिलीलीटर की 20x & #160; ४७५ मिलीलीटर पानी के साथ धो बफर । अप्रयुक्त भाग को 2 & #176 के बीच संग्रहीत करें; c और 8 & #176; c एक माह तक के लिए ।
  3. मैट्रिक्स बी की तैयारी (सीरम और प्लाज्मा के नमूने के साथ प्रयोग के लिए केवल)
    1. जोड़ें ५.० परख बफर की मिलीलीटर (1% BSA के साथ पंजाब) बोतल lyophilized मैट्रिक्स बी युक्त करने के लिए किट में शामिल itution, तो भंवर अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए । बचे हुए पुनर्गठन मैट्रिक्स B को & #8804 पर संग्रहित किया जा सकता है;-७० & #176; C एक माह तक के लिए ।
< p class = "jove_title" > 3. मानक तैयारी

< p class = "jove_content" > नोट: इस पैनल में प्रत्येक analyte १०,००० स्नातकोत्तर की एक शीर्ष मानक एकाग्रता है/
  1. Add २५० & #181; परख के एल बफर lyophilized माउस गु Cytokine मानक कॉकटेल का पुनर्गठन करने के लिए । संक्षेप में भंवर से मिश्रण और शीशी 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति
  2. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए मानक कॉकटेल हस्तांतरण लेबल & #34; C7 & #34;. यह शीर्ष मानक के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
  3. लेबल 6 के रूप में microcentrifuge ट्यूबों सी 5, C5, C4, C3, C2, और C1.
  4. Add ७५ & #181; परख के एल इन ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए बफर ।
  5. अंतरण 25 & #181; एल सी ट्यूब के लिए शीर्ष मानक C7 के L और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण. यह सी 6 मानक होगा ।
  6. जारी रखने के सीरियल 1:4 कमजोर पड़ने प्रत्येक ट्यूब के लिए एक नया प्लास्टिक टिप का उपयोग करके 25 & #181 जोड़ने के लिए, पिछले मानक के ७५ & #181 के लिए l; परख के एल अगले सबसे कम मानक ट्यूब में बफर के मानकों को प्राप्त करने के लिए के बाद के लिए C5, C4, C3 , C2 और C1. 0 स्नातकोत्तर/एमएल मानक (C0) के रूप में परख बफर का प्रयोग करें ।
< p class = "jove_title" > 4. नमूना कमजोरियां

< p class = "jove_content" > नोट: प्रारंभिक पायलट प्रयोगों कई कमजोर पड़ने के साथ इस परख का उपयोग करने के लिए जैविक नमूनों की एक विशेष सेट के लिए सबसे उपयुक्त कमजोर पड़ने कारक निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. एक उचित कमजोर पड़ने कारक नमूना है कि मानक वक्र की सीमा के भीतर झूठ के लिए एकाग्रता गणना का उत्पादन होगा । निंन चरणों का पालन दिशानिर्देशों के रूप में होती है और नमूना प्रकार के आधार पर empirically निर्धारित करना पड़ सकता है ।

  1. सीरम या प्लाज्मा नमूनों को पतला 2-परख बफर के साथ गुना ( उदा . पतला ५० & #181; ५० & #181 के साथ नमूना के l.) के एल के microcentrifuge ट्यूबों में नोट: यदि आगे के नमूने कमजोर पड़ने की आवश्यकता है, कमजोर पड़ने के बजाय मैट्रिक्स के साथ किया जाना चाहिए B परख बफर की सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए । कमजोर पड़ने के बिना सीरम या प्लाज्मा नमूने जोड़ने कम परख सटीकता में परिणाम होगा और फिल्टर प्लेट रोकना हो सकता है । मैट्रिक्स बी परित माउस अंतर्जात परख लक्ष्य के समाप्त सीरम के शामिल है । यह एक सीरम या प्लाज्मा नमूना मंदक के रूप में प्रयोग किया जाता है मैट्रिक्स प्रभाव से बचने के लिए, जो immunoassays के विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है.
  2. टेस्ट सेल कल्चर supernatant के नमूने कमजोर पड़ने के बिना ।
    नोट: analyte के स्तर नमूने से नमूना बहुत भिंन हो सकते हैं । यदि आवश्यक हो, supernatant नमूने उनके इसी सेल संस्कृति मध्यम या परख बफर की एक ताजा तैयारी का उपयोग कर पतला ।
< p class = "jove_title" > 5. परख प्रक्रिया

< p class = "jove_content" > नोट: परख के रूप में किया जा सकता है के रूप में फ़िल्टर प्लेटें, माइक्रो FACS ट्यूबों, या वी नीचे microplates । फिल्टर प्लेट परख प्रक्रिया नमूना स्थिरता, परख मजबूत करने के लिए अच्छा नमूना के कारण की सिफारिश की है, और हैंडलिंग में आसानी । इस प्रक्रिया को धोने के लिए एक वैक्यूम निस्पंदन इकाई की आवश्यकता है (अंत उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान की) ।

  1. सभी रिएजेंटों कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति दें (20-25 & #176; C) उपयोग करने से पहले.
  2. एक औंधा प्लेट पर फिल्टर प्लेट सेट परख सेटअप और गर्मी चरणों के दौरान हर समय कवर, ताकि प्लेट के नीचे किसी भी सतहों के रूप में यह लीक कारण हो सकता है स्पर्श नहीं करता है ।
  3. पूरी परख प्रक्रिया के दौरान, धोने के कदम सहित प्लेट ईमानदार रखने के लिए, मोतियों को खोने से बचने के लिए ।
  4. अंधेरे में थाली रखने के लिए या सभी गर्मी कदम के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ लिपटे ।
  5. सभी मानकों और डुप्लिकेट के रूप में नमूने, एक अनुक्रमिक क्रम में प्लेट पर व्यवस्थित चलाते हैं ।
  6. प्री-भीगी हुई फ़िल् टर प्लेट को जोड़कर १०० & #181; 1x & #160 के एल; एक अच्छी तरह से धोने बफर और यह कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए बैठते हैं (यदि फिल्टर-नीचे microplate का उपयोग कर).
  7. बफ़र वॉल्यूम निर्वात कई गुना (5-10 s) का उपयोग करके निकालें । 10 & से अधिक मत #34; वैक्यूम के पारा । दाग अतिरिक्त धोने प्लेट के नीचे से बफर साफ कागज तौलिए के ढेर पर प्लेट दबाकर । प्लेट को उल्टे प्लेट कवर के ऊपर रखें ।
    नोट: चरण ५.१-५.२ अगर एक वी नीचे microplate या सूक्ष्म FACS ट्यूबों का उपयोग परख प्रदर्शन लोप हो सकता है ।
  8. सेल कल्चर supernatant नमूनों के लिए
  9. , 25 & #181 जोड़ें; सभी कुओं को परख बफर के एल । मानक कुओं को प्रत्येक मानक के 25 & #181; L को जोड़ें । नमूना कुओं के लिए प्रत्येक नमूने के 25 & #181; L को जोड़ें ।
  10. सीरम या प्लाज्मा नमूनों को मापने के लिए
  11. , मानक कुओं के लिए मैट्रिक्स बी के 25 & #181; L जोड़ें । जोड़ें 25 & #181; परख के एल नमूना कुओं को बफर । मानक कुओं को प्रत्येक मानक के 25 & #181; L को जोड़ें । जोड़ें 25 & #181; प्रत्येक पतला सीरम या प्लाज्मा नमूने के नमूने कुओं के एल ।
  12. भंवर मिश्रित मोतियों के लिए 30 एस जोड़ने के लिए 25 & #181; एक अच्छी तरह से मिश्रित मोतियों की एल, मिलाते मनका बोतल आवर्तक रूप मनका बसने से बचने के लिए । अंतिम मात्रा मोतियों के जोड़ के बाद प्रत्येक कुआं में ७५ & #181; L का होना चाहिए.
  13. थाली मुहर के साथ प्लेट सील
  14. । एल्यूमीनियम पंनी के साथ, उल्टे प्लेट कवर सहित पूरी थाली लपेटें । प्लेट एक प्लेट शेखर पर प्लेस, यह सुरक्षित है, और लगभग ५०० rpm पर 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिला । लीक को रोकने के लिए, प्लेट मुहर के लिए सकारात्मक दबाव लागू नहीं है ।
  15. उल्टे बिना
  16. , प्लेट को वैक्यूम कई गुना पर लगाएं और पहले की तरह वैक्यूम लागू करें और २०० & #181; 1x & #160 के L को जोड़ें; प्रत्येक अच्छी तरह से बफर को धोएं ।
  17. वैक्यूम निस्पंदन द्वारा परख प्लेट कुओं की सामग्री को हटा दें । दाग अतिरिक्त एक शोषक पैड या कागज तौलिए के साथ थाली के नीचे से धो बफर । इस चरण को एक और बार दोहराएं ।
    नोट: यदि परख एक V-नीचे microplate या सूक्ष्म FACS ट्यूबों का उपयोग कर किया जाता है कदम ५.१२ और ५.१३ छोड़ । इसके बजाय कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए १,००० x g पर थाली केंद्रापसारक, तो एक मल्टीचैनल पिपेट.
  18. का उपयोग कर supernatant निकालें
  19. Add 25 & #181; खोज एंटीबॉडी के एल (सामग्री की मेज देखें) के लिए एक अच्छी तरह से ।
  20. प्लेट सील एक ताजा प्लेट मुहर के साथ । पूरी थाली लपेट, उल्टे प्लेट कवर सहित, एल्यूमीनियम पंनी के साथ ।
  21. एक प्लेट शेखर पर थाली प्लेस और लगभग ५०० rpm पर 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर हिला ।
  22. बिना निर्वात के, 25 & #181 जोड़ें; एसए के एल-पे रिएजेंट सीधे एक अच्छी तरह से । एजेंट का कोई कमजोर पड़ने आवश्यक है ।
  23. प्लेट सील एक ताजा प्लेट मुहर के साथ । पूरी थाली लपेट, उल्टे प्लेट कवर सहित, एल्यूमीनियम पंनी के साथ ।
  24. एक प्लेट शेखर पर थाली प्लेस और लगभग ५०० rpm पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए शेक ।
  25. दोहराएँ चरण ५.१३ ऊपर.
  26. Add २०० & #181; L of 1x & #160; प्रत्येक कुआं के लिए बफर धो लें । फिर से 1 min.
  27. के लिए एक प्लेट शेखर पर मोतियों को सस्पेंड एक मल्टीचैनल प्लास्टिक का उपयोग
  28. , फिल्टर प्लेट से नमूने FACS ट्यूबों के लिए एक प्रवाह cytometer पर नमूनों को पढ़ने के लिए स्थानांतरण.
    नोट: नमूना मात्रा बढ़ सकता है से २०० & #181; l से ३०० & #181; l को जोड़कर एक अतिरिक्त १०० & #181; l of 1x & #160; प्रत्येक ट्यूब के लिए बफर धो सूखी चल रहे नमूने से बचने के लिए । यदि आवश्यक नमूनों पर संग्रहित किया जा सकता है 4 & #176; C प्रकाश से सुरक्षित और अगले दिन विश्लेषण । हालांकि, लंबे समय तक नमूना संग्रह कम संकेत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
< p class = "jove_title" > 6. फ्लो Cytometer सेट-अप

< p class = "jove_content" > नोट: विश्वसनीय डेटा जनरेट करने के लिए, प्रवाह Cytometer डेटा प्राप्ति से पहले ठीक से सेट होना चाहिए. इस प्रक्रिया को विशेष रूप से साधन परख पर किया जाता है के विंयास के आधार पर कुछ संबंध में व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं के लिए भिंन होगा । पीई और APC को मापने में सक्षम cytometer के लिए एक सामान्यीकृत सेटअप प्रक्रिया और दोनों एक ४८८ और ६३३ एनएम लेजर के साथ सुसज्जित नीचे चर्चा की है ।

  1. शुरू करने के लिए प्रवाह cytometer और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के अनुसार निर्माता & #39; s निर्देश लिखत के साथ दिए गए.
  2. Y-अक्ष के लिए X-अक्ष और एसएससी (साइड स्कैटर) पर FSC (फॉरवर्ड स्कैटर) के साथ एक डॉट प्लॉट बनाएं । FSC और SSC को रेखीय मोड में सेट करें.
  3. X-अक्ष पर पीई के साथ एक दूसरे डॉट प्लॉट बनाएं और Y-अक्ष के लिए APC । यह प्लॉट लॉग-आधारित प्रदर्शन मोड पर सेट किया जाना चाहिए ।
  4. भंवर कच्चे मोतियों की शीशी 30 एस के लिए किट में शामिल करने के लिए फिर से निलंबित मोती । ये मोती एक आंतरिक APC डाई होते है और दो आकार आबादी के शामिल हैं ।
  5. अंतरण ४०० & #181; क L कच्चे मोतियों का एक नया FACS tube.
  6. प्रवाह cytometer प्रवाह दर को कम करने के लिए सेट करें ।
  7. कच्चे मोती चलाने के लिए, ध्यान से लाभ और FSC और एसएससी के लिए वोल्टेज इतना है कि इन मोतियों की दोनों आकार आबादी दिख अलग और फाटक के लिए आसान कर रहे है समायोजन ।
  8. अवांछित घटनाओं ( यानी मलबे या हवा के बुलबुले) को बाहर करने के लिए FSC थ्रेशोल्ड समायोजित करें ।
  9. FSC बनाम एसएससी भूखंड में
  10. , एक फाटक है कि सभी मनका आबादी शामिल ड्रा ।
    नोट: कच्चे मोतियों में दो आकार की आबादी होती है मोतियों की, छोटी & #34; ए मोतियों का & #34; और बड़ा & #34; ब मनका & #34; क्षेत्रको.
  11. प्रदर्शन पर FSC बनाम एसएससी प्लॉट से gated मनका आबादी X-अक्ष पर पीई के साथ दूसरी डॉट भूखंड पर और Y-अक्ष के लिए APC.
  12. समायोजित PMT वोल्टेज apc प्रतिदीप्ति चैनल के लिए इतना है कि सभी मनका आबादी के लिए apc संकेत एक औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) है कि 1 x 10 1 और 5 x 10 3 के बीच निहित है.
  13. भंवर 30 एस के लिए पीई सेटअप मोती की शीशी को फिर से निलंबित मोतियों ।
  14. Transfer ४०० & #181; L पे मोतियों का एक नया FACS tube.
  15. की जगह कच्चे मोतियों का ट्यूब पे मोतियों की ट्यूब के साथ प्रवाह cytometer से.
  16. photomultiplier ट्यूब (PMT) वोल्टेज पे प्रतिदीप्ति चैनल की स्थापना के लिए समायोजित करें जिससे कि MFI पे मोतियों की बहुत-विशिष्ट रेंज पीई मोतियों की शीशी पर सूचीबद्ध पाया के बीच गिर जाता है.
    नोट: पीई सेटअप मोती एक जनसंख्या आकार के मोती होते है (& #34; ए मोती & #34; केवल).
< p class = "jove_title" > 7. डाटा अर्जन

< p class = "jove_content" > नोट: किसी दिए गए इंस्ट्रूमेंट पर डेटा के अर्जन से जुड़ी सटीक प्रक्रियाएँ भिन्न हो सकती हैं और cytometer & #39; s कॉन्फ़िगरेशन विनिर्देशों और उपयोग किए गए इंटरफ़ेस सॉफ़्टवेयर पर निर्भर हैं. नीचे दिए गए निर्देश इसलिए आवश्यक कदम को उजागर करने के लिए परख में cytometer की परवाह किए बिना परख में ले लिया है इरादा कर रहे हैं ।

  1. cytometer प्रवाह दर अभी भी कम करने के लिए सेट किया गया है सत्यापित करें ।
  2. मनका घटनाओं की संख्या सेट के बारे में ३०० analyte प्रति के लिए अधिग्रहीत किया जाएगा । एक 13-plex पैनल के लिए यह ३,९०० दोनों मनका आकार आबादी से संयुक्त घटनाओं को प्राप्त करने के लिए समानताएं (a + बी मोती) ।
  3. भंवर विश्लेषण से पहले 5 एस के लिए प्रत्येक नमूने ।
  4. के नमूने पढ़े । जब पढ़ने के नमूने, सेटअप मोड के लिए प्रवाह cytometer सेट पहले और मनका जनसंख्या अधिग्रहण मोड में स्विचन से पहले स्थिर है जब तक इंतजार ।
  5. डेटा विश्लेषण की सुविधा के लिए डेटा फ़ाइलों के लिए क्रमिक क्रमांकन के साथ साधारण नामों का उपयोग करें ।
  6. निर्यात केवल gated घटनाओं (A + B मनका क्षेत्रों) के बजाय कुल घटनाओं.
  7. प्रत्येक परख के लिए एक ही फ़ोल्डर में सभी FCS फ़ाइलें स्टोर । यदि कई परख चल रहे हैं, प्रत्येक परख के लिए एक अलग फ़ोल्डर बनाएं ।
< p वर्ग= "jove_title" > 8. डेटा विश्लेषण पर जाएं

< p class = "jove_content" > नोट: FCS प्रवाह cytometer पर जनरेट की गई फ़ाइलें डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया जाना चाहिए, जो मुक्त करने के लिए डाउनलोड किया जा सकता < सुप वर्ग = "xref" > १४ .

  1. एक पीसी पर डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर स्थापित करें.
  2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर शामिल है जो कंप्यूटर के लिए सभी परख FCS फ़ाइलें स्थानांतरित करें ।
  3. लाइसेंस कुंजी dongle प्लग (किट में शामिल) कंप्यूटर के एक यूएसबी पोर्ट में ।
  4. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर लांच.
  5. क्लिक करें नीला & #34; जोड़ें फ़ाइलें & #34; बटन स्क्रीन के शीर्ष पर स्थित है ।
  6. फ़ोल्डर है कि पॉप अप विंडो प्रकट होता है में परख से FCS फ़ाइलें शामिल करने के लिए नेविगेट ।
  7. क्लिक करें और पॉप अप विंडो से सभी परख FCS फ़ाइलों को खींचें सॉफ्टवेयर प्रदर्शन के लिए । सभी फ़ाइलें अब किसी सूची में प्रकट होना चाहिए ।
  8. क्लिक करें ग्रीन & #34; नेक्स्ट & #34; बटन डिस्प्ले के नीचे दाईं ओर । बाएँ क्लिक करें और मानक वक्र परिभाषित करने के लिए सूची से उनके इसी FCS फ़ाइलों के लिए छोटे नीले मानक वक्र बटन (C7 C0) खींचें करने के लिए पकड़.
  9. लिक द ग्रीन & #34; नेक्स्ट & #34; गेटिंग पॉप अप विंडो खोलने के लिए प्रदर्शन के नीचे दाईं ओर बटन.
  10. गेटिंग खिड़की के बाईं ओर
  11. दोनों ए और बी मनका क्षेत्रों परख analyte लक्ष्य और उनके संबद्ध मनका आईडी के नाम दर्ज करें (मैनुअल परख के साथ आपूर्ति में पाया) आरोही क्रम में ।
  12. विंडो ऊपर पॉप के ऊपर से गेटिंग उपकरण का चयन करें और यह FSC बनाम एसएससी प्लॉट, एक मोतियों के चारों ओर एक और बी मोतियों के आसपास एक दूसरे में 2 फाटकों आकर्षित करने के लिए उपयोग करें ।
  13. जो दिखाई FSC बनाम एसएससी साजिश के नीचे दिखाई APC बनाम पीई तितर बितर भूखंड की समीक्षा करें । एक मोतियों में 6 analyte बैंड (बाएं प्लॉट) और बी मोतियों (सही प्लॉट) में 7 analyte बैंड होंगे ।
    नोट: गेट्स शीर्ष पर इरेज़र उपकरण का चयन करके और किसी दिए गए गेट को हटाने के लिए क्लिक करके मैन्युअल रूप से फिर से तैयार हो सकता है । गेटिंग उपकरण तो चयनित किया जा सकता है और मैन्युअल रूप से वांछित बैंड क्षेत्र के लिए एक गेट लागू करने के लिए इस्तेमाल किया.
  14. क्लिक करें हरी & #34; OK & #34; बटन गेटिंग पॉप अप विंडो को बंद करने और FCS फ़ाइलों की सूची पर वापस जाने के लिए ।
  15. किसी दी गई फ़ाइल को राइट क्लिक करके जैविक नमूनों में किए गए किसी भी कमजोर पड़ने को परिभाषित करें, & #34;D ilution फ़ोल्ड & #34; मेनू से, और सही मान इनपुट करें ।
  16. क्लिक करें हरी & #34; रन & #34; प्रदर्शन के नीचे दाईं ओर बटन को परख के लिए मानक घटता उत्पंन और अज्ञात जैविक नमूनों की सांद्रता की गणना ।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे एक मनका आधारित immunoassay मंच एक साथ जैविक नमूनों से cytokine प्रोफाइल quantitate एक प्रवाह cytometer का उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जैविक नमूने इस उदाहरण में इस्तेमाल किया था सेल संस्कृति supernatants से माउस splenocytes है कि पहले किया गया था विभिंन स्थितियों को सक्रिय करने के तहत, हालांकि परख प्रारूप भी सीरम या प्लाज्मा नमूनों के साथ प्रयोग के लिए मांय किया गया है ।

परख से उत्पंन डेटा के लिए मल्टीप्लेक्स पैनल में सभी analytes के लिए मानक curves के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है । डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर वर्गीकृत प्रत्येक विशेष analyte एक अद्वितीय मनका आकार और APC तीव्रता के आधार पर, और quantifies उन्हें एक पीई रिपोर्टर का उपयोग कर. गतिशील पर्वतमाला, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परख की संवेदनशीलता का प्रदर्शन कर रहे है जब एक लॉग-लॉग पैमाने पर चित्रा 2aमें साजिश रची । सॉफ्टवेयर परख डेटा और एक 5-पैरामीटर वक्र फिटिंग एल्गोरिथ्म का उपयोग करता है सही ढंग से न केवल उपयोगकर्ता में analytes की सांद्रता की गणना जैविक नमूनों लेकिन यह भी दोनों पर पता लगाने की सीमा के उच्च और सभी मानक वक्रों के अंत (तालिका 1 ). इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रारूप भी अत्यधिक मजबूत परख परिशुद्धता प्रदान करता है । चित्रा 2 बी और 2c डेटा में प्रत्येक analyte के अंतर परख परिवर्तनशीलता चित्रण प्रस्तुत कर रहे हैं । दो अलग मानक प्रोटीन सांद्रता (उच्च और कम) के साथ एक परख में विश्लेषण किया गया 16 प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिकृतियां । चित्रा 2c और 2d तीन स्वतंत्र परख से लक्ष्य analytes की अंतर परख परिवर्तनशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं । अंतर परख परिशुद्धता प्रयोगों के साथ के रूप में, उच्च और कम मानक सांद्रता 3 स्वतंत्र प्रयोगों में से प्रत्येक में प्रतिकृति के साथ विश्लेषण किया गया । लक्ष्य प्रोटीन की गणना एकाग्रता में ंयूनतम परिवर्तनशीलता स्पष्ट रूप से दिखाई है ।

आदेश में मनका की उपयोगिता-cytokine अभिव्यक्ति प्रोफाइल पूछताछ में cytometric परख आधारित प्रदर्शित करने के लिए, माउस splenocytes विभिंन स्थितियों को सक्रिय करने के अंतर्गत थे । एक उत्तेजित नियंत्रण के अलावा, कोशिकाओं को भी एलपीएस, विरोधी CD3/विरोधी CD28 एंटीबॉडी, या phorbol 12-myristate 13-एसीटेट और ionomycin के साथ मशीन थे । सेल संस्कृति supernatants ४८ ज बाद में एकत्र और माउस टी सहायक cytokine पैनल का उपयोग कर परख रहे थे । इस प्रयोग से ठहराव परिणाम चित्रा 3 में दर्शाए गए है और cytokine सांद्रता पर उत्तेजना की स्थिति का प्रभाव स्पष्ट रूप से delineated है ।

ऊपर वर्णित परिणाम विशिष्ट हैं, जब तक प्रयोगकर्ता अच्छा प्रयोगशाला तकनीक है और प्रदान की परख प्रोटोकॉल निंनानुसार है । इस परख प्रारूप में त्रुटि के सूत्रों की मशीन समय में विचलन से पैदा कर सकते हैं, एजेंट की मात्रा, धोने, या गलत पीएमटी सेटिंग्स प्रवाह cytometer पर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया । चित्रा 4a में एक सफल परख से एक तितर बितर भूखंड 2 अलग मनका आबादी है कि स्पष्ट रूप से परिभाषित कर रहे है दिखाता है । यह आंकड़ा 4B, जहां गरीब धोने और प्रोटोकॉल पालन मनका समुच्चय जो दो आबादी कलंक के लिए नेतृत्व किया है के विपरीत हो सकता है । इसके अलावा, निचले बाएँ चक्र में मलबे के रूप में सबूत के रूप में, कुल cytometer घटनाओं केवल gated घटनाओं के पसंदीदा प्रारूप के बजाय विश्लेषण के लिए निर्यात किया गया. उचित cytometer स्थापित इस परख में विश्वसनीय डेटा पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण है । चित्र 4c में उचित PMT सेटिंग्स APC वर्गीकरण चैनल में 6 analytes में से प्रत्येक के समाधान के लिए अनुमति देते हैं. अनुचित PMT सेटिंग्स डेटा में जो चित्रा 4d में प्रस्तुत करने के लिए इसी तरह का परिणाम होगा, जहां APC चैनल अतिव्यापी वर्गीकरण तीव्रता के साथ मनका आबादी है । यह परख अमान्य होगा क्योंकि यह स्पष्ट रूप से परख मोतियों की आबादी को परिभाषित बिना analyte सांद्रता की गणना करने के लिए असंभव हो जाएगा ।

Figure 2
चित्रा 2: मानक वक्र पर्वतमाला और परख परिशुद्धता. (a) एक प्रतिनिधि मानक वक्र माउस T सहायक cytokine पैनल का उपयोग कर उत्पंन । एक मानक वक्र प्रत्येक परख के साथ चलाया जाना चाहिए । (बी-सी) अंतर परख परिशुद्धता । लक्ष्य प्रोटीन (उच्च और कम) के विभिंन सांद्रता के साथ दो नमूनों के साथ एक परख में विश्लेषण किया गया 16 प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिकृतियां । डेटा माध्य + मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । (डी-ई) अंतर परख परिशुद्धता । लक्ष्य प्रोटीन (उच्च और कम) के विभिंन सांद्रता के साथ दो नमूनों के साथ तीन स्वतंत्र परख में विश्लेषण किया गया 3 प्रत्येक नमूने के लिए प्रतिकृतियां । डेटा माध्य + मानक विचलन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: प्रतिनिधि परिणामों का ठहराव. माउस splenocytes (1 x 106 कोशिकाओं) विभिंन शर्तों के तहत ३७ डिग्री सेल्सियस + 5% सह2 पर संस्कृति थे: उत्तेजित, एलपीएस (१०० एनजी/एमएल), αCD3 (1 µ जी/एमएल प्लेट-लेपित) + αCD28 (1 µ जी/एमएल घुलनशील), पमा (20 एनजी/एमएल) + Ionomycin (५०० एनजी/ कल्चर supernatants के बाद एकत्र किए गए ४८ ज तो माउस टी हेल्पर cytokine पैनल का उपयोग कर मात्रा. उत्तेजना की स्थिति के जवाब में अंतर cytokine अभिव्यक्ति प्रोफाइल स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: सफल बनाम असफल परख से परिणाम । (क) सफल परख microsphere आबादी के लिए विशिष्ट मनका आबादी होगा । (ख) असफल परख गरीब आबादी जुदाई होगा, मनका समुच्चय, और भी कई एकत्र की घटनाओं । (ग) सफल परख स्पष्ट रूप से वर्गीकरण प्रतिदीप्ति चैनल जो फाटक और यों तो आसान कर रहे है में तीव्रता परिभाषित किया है । (घ) असफल परख खराब अलग है और वर्गीकरण तीव्रता जो कई मनका आबादी ओवरलैप होगा, ठहराव मुश्किल बना । इन त्रुटियों के कई परख प्रोटोकॉल के लिए सावधान पालन के माध्यम से बचा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मानक वक्र संवेदनशीलता (pg/
Analyte सूत्र फ़िट अनुवादित r2 मिनट. अधिकतम.
IFN-γ 5-P. log (०.५४, १४.४०, ०.०१, ९.११) १.७७% ०.९९ २.१ १८१०५.०
आईएल-5 5-P. log (, १२.६८, ०.६४, ५.७३, ०.३६) १.३२% 1 १.९ १४५१४.०
TNF-α 5-P. log (, ११.६३, ०.७९, ५.४५, ०.३७) १.४८% ०.९९ १.९ २०१०९.०
आईएल-2 5-P. log (4.46, १२.६२, ०.७८, ५.०७, ०.३४) १.३४% 1 १.९ २५१०९.०
आईएल-6 5-P. log (4.58, ११.६६, ०.६४, ५.७७, ०.३७)
टीडी > 1.70% ०.९९ २.० ७०२२.० आईएल-4 5-P. log (4.27, १२.२३, ०.६२, ५.७२, ०.३६) १.३६% 1 २.० १३२७३.० आईएल-10 5-P. log (4.67, ११.६५, १.२०, ६.२८, ०.६१) १.८१% ०.९९ २.२ ५१९०.० आईएल-9 5-P. log (4.32, १३.८६, ०.८६, ५.९०, ०.४५) १.८२% 1 १.९ १२६०२.० IL-17A 5-P. log (4.06, १४.०३, ०.४७, ६.५२, ०.३२) ०.९९% 1 २.० १२२८५.० IL-17F 5-P. log (4.52, १२.१५, ०.६१, ५.५२, ०.३४) ०.९२% 1 २.० १४८४१.० आईएल-21 5-P. log (4.90, ८.०३, १.७७, ४.७४, १.११) ०.७९% 1 ९.० १२९४३.० आईएल-22 5-P. log (4.57, १२.५६, ०.६३, ६.०६, ०.३९) १.१६% 1 २.० ६४०८.० आईएल-13 5-P. log (4.40, ११.४४, ०.२२, ३.१९, १.४५) १.११% 1 २.१ १६७२८.०

1 तालिका: मानक वक्र फिटिंग और परख संवेदनशीलता । डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर मल्टीप्लेक्स परख में निहित सभी analytes के लिए मानक curves उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । यह पूरी तरह से स्वचालित विश्लेषण एक मजबूत 5-पैरामीटर वक्र परख से कमजोर पड़ने श्रृंखला मानकों को एल्गोरिथ्म पर लागू होता है और भी परख पता लगाने की सैद्धांतिक सीमा का उपयोग कर संवेदनशीलता को परिभाषित किया गया ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख प्रारूप जैविक नमूनों में घुलनशील मध्यस्थ प्रोफाइल के मजबूत ठहराव प्रदान कर सकते है प्रयोगकर्ता अच्छा प्रयोगशाला तकनीक है और अनुशंसित प्रोटोकॉल का पालन करता है ।

वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि आदेश में विश्वसनीय परिणाम की गारंटी के बाद किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, संयोजक मानकों को परख बफर पूरा समय की सिफारिश में पुनर्गठन की अनुमति दी जानी चाहिए, और के बाद ही के लिए ट्यूब में पतला । Polystyrene ट्यूबों ट्यूब की दीवार के लिए प्रोटीन के पालन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं, जो कम संकेत जब मानक वक्र पैदा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । दूसरा, उचित मशीन कदम के दौरान मिलाते महत्वपूर्ण है । उचित आंदोलन के बिना, परख मोतियों की बाध्यकारी विशेषताओं बुरी तरह से बाधा हो सकती है । इसके अलावा, गर्मी कदम के बीच उचित धुलाई भी आवश्यक है । प्रयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना होगा कि प्रोटोकॉल में अगला कदम शुरू करने से पहले ही कुओं से अतिरिक्त रिएजेंट निकाल दिए जाएं । प्रवाह cytometer के लिए उपकरण सेटिंग्स परख मोती पूछताछ के लिए इस्तेमाल के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जाना चाहिए । विशेष रूप से, PMT सेटिंग्स उचित मनका जुदाई और मानक curves के लिए व्यापक गतिशील पर्वतमाला सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. अंत में, बस से पहले cytometer पर विश्लेषण किया जा रहा है, मोती उचित निलंबन बीमा और एग्रीगेट के गठन से बचने के लिए जो परिणाम विषम कर सकते है भंवर होना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल संभावित को ऊतक homogenates विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूना इस पांडुलिपि में चर्चा प्रकार संशोधित किया जा सकता है, बशर्ते शोधकर्ता को अपने lysis प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने से पहले बड़े, पूर्ण थाली परख प्रदर्शन करने को तैयार है । वास्तविक तकनीक पाठ्यक्रम के ऊतकों के प्रकार के आधार पर भिंन होगा; हालांकि, सामांय में प्रोटोकॉल एक तटस्थ पीएच ईओण लवण, कोई denaturing रसायनों की शारीरिक सांद्रता युक्त बफर का उपयोग करना चाहिए, और अधिमानतः कोई डिटर्जेंट । यदि डिटर्जेंट इस्तेमाल किया जाना चाहिए, गैर ईओण डिटर्जेंट सांद्रता एक ंयूनतम पर रखा जाना चाहिए (जैसे कोई अधिक से अधिक 1%) । बफर भी लक्ष्य प्रोटीन के proteolytic क्षरण को रोकने के लिए पर्याप्त छेड़ने अवरोधकों को शामिल करना चाहिए । lysis प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, के बावजूद अंतिम तैयारी विश्लेषण करने से पहले कण को दूर करने के लिए केंद्रापसारक होना चाहिए ।

परख सीमाओं के बारे में, जैविक नमूना प्रकार में analyte लक्ष्यों की सांद्रता बहुत भिंन हो सकते हैं । आदेश में ठीक से analyte सांद्रता यों तो, वे मानक वक्र के लिए ऊपर और नीचे मूल्यों के भीतर गिर चाहिए । वक्र के मूल्यों के एक्सट्रपलेशन जरूरी विश्वसनीय नहीं है और सिफारिश नहीं है । जांचकर्ताओं इसलिए एक पूर्ण थाली परख चलाने से पहले पायलट प्रयोगों में अपने विशेष नमूनों की कमजोर पड़ने का अनुकूलन करना चाहिए । इसके अलावा जैविक नमूनों की सावधानीपूर्वक तैयारी को परख कर इस परख स्वरूप की सफलता को सर्वोपरि मानते हैं । नमूने है कि lipemic, hemolyzed, या प्रोटीन मलबे होते है प्रतिजन एंटीबॉडी बातचीत है कि इस immunoassay के मुख्य सिद्धांत को परिभाषित करने को प्रभावित करेगा, और जो व्याख्यात्मक परिणाम प्रदान करते हैं ।

यह परख कई कारणों के लिए मौजूदा ठहराव तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है । जब ठीक से चलाने के लिए, परख प्रारूप तक एक नमूना से 13 analytes तक quantitate कर सकते है अब तक छोटे संस्करणों का उपयोग करने के लिए पारंपरिक एलिसा परख का उपयोग नमूना विश्लेषण की आवश्यकता होगी । इस परख प्रारूप भी समर्पित इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है ताकि प्रदर्शन किया जाएगा । यह एक लाभ के लिए अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मनका की तुलना में immunoassays आधारित है परख आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रवाह cytometers के किसी भी संख्या का उपयोग कर चलाया जा सकता है ।

गुप्त कारकों और स्वास्थ्य और रोग में cytokine नेटवर्क द्वारा निभाई गई भूमिका में वैज्ञानिक जांच का विस्तार है । इस पांडुलिपि में वर्णित परख प्रारूप शोधकर्ताओं के लिए इन बहुमुखी और जटिल घटना को समझने की मांग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है । सक्रिय जैव चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम न केवल क्षेत्रों में cytokine नेटवर्क की भूमिका का पता लगाने के लिए शुरू कर रहे है जैसे सामान्यीकृत सूजन6, लेकिन यह भी atherosclerosis, कैंसर, और neuroinflammation जैसे विशिष्ट रोग राज्यों के संदर्भ में 15,16,17. निस्संदेह, जांच के लिए उपंयास चिकित्सीय उपचार के लिए खोज के रूप में इन क्षेत्रों में विकसित करने के लिए इन पुरानी स्थितियों का इलाज जारी रहेगा फैलता है । इन रोगों से जुड़े घुलनशील मध्यस्थों के सटीक और विश्वसनीय ठहराव की आवश्यकता एक महत्वपूर्ण शोध प्राथमिकता बनी रहेगी.

Disclosures

लेखक, जो इस पांडुलिपि में वर्णित पुनर्अभिकर्ताओं का निर्माण करता है, के द्वारा कार्यरत हैं । Vigene टेक, इंक LEGENDplex डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर है कि इस पांडुलिपि में वर्णित परख से उत्पंन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है विकसित की है ।

Acknowledgments

लेखकों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं और bliss-परख उत्पाद विकास टीम के विकास के लिए परख है । इसके अलावा, हम डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल को डिजाइन करने में उनके सहयोगात्मक प्रयासों के लिए Vigene टेक, Inc शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor Beckman Coulter 366816 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel BioLegend 740005 Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format
Anti-mouse CD28 antibody BioLegend 102112 Clone 37.51, low endotoxin, azide free format
Vacuum Pump EMD Millipore WP6111560 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Vacuum Manifold EMD Millipore MSVMHTS00 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher Scientific 07-200-130 Or equivalent
Polypropylene MicroFACS Tubes Fisher Scientific 11-842-90 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
Pipette Kit Fisher Scientific 14-388-100 Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL)
Multi-Channel Pipette Fisher Scientific FA10011G capable of dispensing 5 μL to 200 μL
Microplate Shaker Fisher Scientific 88880023 Or equivalent
Microcentrifuge Fisher Scientific 75002410 Or equivalent
FACS tubes Fisher Scientific NC9885747 12 x 75 mm round bottom
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma-Aldrich L-8274 Escherichia coli O26:B6
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Branson B200 Ultrasonic Cleaner Sigma-Aldrich Z305359 Or equivalent
Microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505 1.5 mL polypropylene tubes
Flow Cytometer Various Various Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm
96-Well Polypropylene Plate VWR 82050-662 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)

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एक Cytometric मनका आधारित Immunoassay मंच का उपयोग कर उत्तेजित माउस Splenocytes के मल्टीप्लेक्स Cytokine profiling
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Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).More

Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).

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