इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक साथ ऊतक संस्कृति supernatants उत्तेजित माउस से एकत्र में एकाधिक cytokine लक्ष्य के ठहराव का उपयोग splenocytes मल्टीप्लेक्स मनका आधारित immunoassay मंच और एक प्रवाह cytometer ।
मनका आधारित immunoassays सैंडविच immunoassays के रूप में एक ही मूल सिद्धांत को रोजगार । कैप्चर मोतियों, जो आकार और आंतरिक allophycocyanin (APC) प्रतिदीप्ति तीव्रता से विभेदित किया जा सकता है, एक विशेष analyte के लिए विशेष एंटीबॉडी के लिए संयुग्मित हैं । अगले, परिभाषित कब्जा मनका सेट का एक चयनित पैनल एक जैविक नमूना कब्जा एंटीबॉडी के लिए विशिष्ट analytes युक्त नमूने के साथ मशीन है । एक biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ा गया है, जो कैप्चर मनका-analyte-डिटेक्शन एंटीबॉडी सैंडविच के गठन की ओर जाता है ।
अंत में, streptavidin-phycoerythrin (एसए-पीई) जोड़ा है, जो biotinylated डिटेक्शन एंटीबॉडी को बांधता है, बाध्य analyte की राशि के अनुपात में फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता प्रदान करते हैं । analyte के पीई फ्लोरोसेंट संकेत-विशिष्ट मोती क्षेत्रों प्रवाह cytometry का उपयोग कर मात्रा है, और विशेष रूप से analytes की सांद्रता डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर और मानक परख में उत्पंन वक्र का उपयोग कर निर्धारित कर रहे हैं ।
इस प्रयोग में, हम एक माउस टी हेल्पर cytokine पैनल का उपयोग करने के लिए एक साथ ऊतक संस्कृति supernatants में 13 अलग cytokine लक्ष्यों की एकाग्रता को बढ़ाता है माउस splenocytes विभिंन stimulatory शर्तों के तहत संस्कृति से एकत्र की ।
के रूप में अपनी भूमिका में घुलनशील अणुओं संकेत, साइटोकिंस मध्यस्थता उच्च समंवित और multifactorial प्रक्रियाओं है कि मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को नियंत्रित । वे भड़काऊ प्रक्रिया के सभी चरणों के दौरान व्यक्त कर रहे हैं, दीक्षा से संकल्प करने के लिए, और एक जटिल संपर्क नेटवर्क है कि अपने स्वयं के संश्लेषण भी शामिल है और अपने सेलुलर रिसेप्टर्स की है कि1को विनियमित. इस संचार नेटवर्क एक जटिलता है कि synergistic या विरोधी संबंधों कि व्यक्तिगत घटकों के बीच मौजूद हो सकता है परे चला जाता है के साथ स्तरित है । वास्तव में, कई साइटोकिंस को निरर्थक या कम से आंशिक रूप से ओवरलैपिंग कार्यों2,3साझा करने के लिए जाना जाता है ।
एकीकृत सिस्टंस जीवविज्ञान दृष्टिकोण है कि एक साथ कई cytokine analytes यों तो वर्तमान में अद्वितीय cytokinomes की एक तेजी से व्यापक समझ प्रदान कर रहे है कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं कई रोग अंतर्निहित आर्केस्ट्रा राज्यों4,5। इन रोग राज्यों सामान्यीकृत सूजन से कैंसर, तंत्रिका अपक्षयी स्थितियों, और हृदय रोग6,7,8,9के लिए सीमा ।
ऐसे cytokine नेटवर्क को प्रभावी ढंग से LEGENDplex मनका आधारित immunoassays का उपयोग कर पूछताछ की जा सकती है । इन परख सैंडविच एंजाइम के रूप में एक ही सिद्धांत पर आधारित है Immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े हुए हैं, और उपयोग प्रतिदीप्ति कब्जा एंटीबॉडी के साथ microspheres इनकोडिंग covalently उनकी सतह से जुड़ी । इन एंटीबॉडी की सतह क्षेत्रों पर मैटीरियल बहुत पारंपरिक एलिसा स्वरूपों द्वारा आवश्यक उन से छोटे हैं । इस तरह की परख अब तक कम नमूना मात्रा के साथ प्रदर्शन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है, जबकि एक ही समय में गैर विशिष्ट बंधन को कम करने और कई analytes के मल्टीप्लेक्स विश्लेषण प्रदान ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख इस तकनीक का इस्तेमाल करने के लिए 13 लक्ष्यों को एक साथ quantitate । इस परख से डेटा आमतौर पर उपलब्ध प्रवाह cytometers की एक विस्तृत विविधता का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है और अंय उपलब्ध परख के विपरीत समर्पित परख के उपयोग की आवश्यकता नहीं विशिष्ट उपकरण । मांय analyte पैनलों की एक विस्तृत सूची के साथ, इन परख कई चल रहे बायोमेडिकल अनुसंधान परियोजनाओं में इस्तेमाल किया गया है10,11,12,13।
को आसानी और परख प्रारूप की उपयोगिता, इस प्रयोग में हम एक माउस टी सहायक cytokine पैनल का उपयोग करने के लिए ऊतक संस्कृति supernatants से 13 अलग cytokine सांद्रता quantitate माउस से प्राप्त splenocytes एकाधिक के तहत संस्कृति का प्रदर्शन stimulatory अटी आहेत. ऊतक संस्कृति supernatants के अलावा, इस परख भी सीरम या प्लाज्मा नमूनों का उपयोग किया जा सकता है ।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख प्रारूप जैविक नमूनों में घुलनशील मध्यस्थ प्रोफाइल के मजबूत ठहराव प्रदान कर सकते है प्रयोगकर्ता अच्छा प्रयोगशाला तकनीक है और अनुशंसित प्रोटोकॉल का पालन करता है ।
वहां कई महत्वपूर्ण कदम है कि आदेश में विश्वसनीय परिणाम की गारंटी के बाद किया जाना चाहिए रहे हैं । सबसे पहले, संयोजक मानकों को परख बफर पूरा समय की सिफारिश में पुनर्गठन की अनुमति दी जानी चाहिए, और के बाद ही के लिए ट्यूब में पतला । Polystyrene ट्यूबों ट्यूब की दीवार के लिए प्रोटीन के पालन को बढ़ावा देने के कर सकते हैं, जो कम संकेत जब मानक वक्र पैदा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । दूसरा, उचित मशीन कदम के दौरान मिलाते महत्वपूर्ण है । उचित आंदोलन के बिना, परख मोतियों की बाध्यकारी विशेषताओं बुरी तरह से बाधा हो सकती है । इसके अलावा, गर्मी कदम के बीच उचित धुलाई भी आवश्यक है । प्रयोगकर्ता को यह सुनिश्चित करना होगा कि प्रोटोकॉल में अगला कदम शुरू करने से पहले ही कुओं से अतिरिक्त रिएजेंट निकाल दिए जाएं । प्रवाह cytometer के लिए उपकरण सेटिंग्स परख मोती पूछताछ के लिए इस्तेमाल के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जाना चाहिए । विशेष रूप से, PMT सेटिंग्स उचित मनका जुदाई और मानक curves के लिए व्यापक गतिशील पर्वतमाला सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए. अंत में, बस से पहले cytometer पर विश्लेषण किया जा रहा है, मोती उचित निलंबन बीमा और एग्रीगेट के गठन से बचने के लिए जो परिणाम विषम कर सकते है भंवर होना चाहिए ।
इस प्रोटोकॉल संभावित को ऊतक homogenates विश्लेषण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूना इस पांडुलिपि में चर्चा प्रकार संशोधित किया जा सकता है, बशर्ते शोधकर्ता को अपने lysis प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने से पहले बड़े, पूर्ण थाली परख प्रदर्शन करने को तैयार है । वास्तविक तकनीक पाठ्यक्रम के ऊतकों के प्रकार के आधार पर भिंन होगा; हालांकि, सामांय में प्रोटोकॉल एक तटस्थ पीएच ईओण लवण, कोई denaturing रसायनों की शारीरिक सांद्रता युक्त बफर का उपयोग करना चाहिए, और अधिमानतः कोई डिटर्जेंट । यदि डिटर्जेंट इस्तेमाल किया जाना चाहिए, गैर ईओण डिटर्जेंट सांद्रता एक ंयूनतम पर रखा जाना चाहिए (जैसे कोई अधिक से अधिक 1%) । बफर भी लक्ष्य प्रोटीन के proteolytic क्षरण को रोकने के लिए पर्याप्त छेड़ने अवरोधकों को शामिल करना चाहिए । lysis प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया, के बावजूद अंतिम तैयारी विश्लेषण करने से पहले कण को दूर करने के लिए केंद्रापसारक होना चाहिए ।
परख सीमाओं के बारे में, जैविक नमूना प्रकार में analyte लक्ष्यों की सांद्रता बहुत भिंन हो सकते हैं । आदेश में ठीक से analyte सांद्रता यों तो, वे मानक वक्र के लिए ऊपर और नीचे मूल्यों के भीतर गिर चाहिए । वक्र के मूल्यों के एक्सट्रपलेशन जरूरी विश्वसनीय नहीं है और सिफारिश नहीं है । जांचकर्ताओं इसलिए एक पूर्ण थाली परख चलाने से पहले पायलट प्रयोगों में अपने विशेष नमूनों की कमजोर पड़ने का अनुकूलन करना चाहिए । इसके अलावा जैविक नमूनों की सावधानीपूर्वक तैयारी को परख कर इस परख स्वरूप की सफलता को सर्वोपरि मानते हैं । नमूने है कि lipemic, hemolyzed, या प्रोटीन मलबे होते है प्रतिजन एंटीबॉडी बातचीत है कि इस immunoassay के मुख्य सिद्धांत को परिभाषित करने को प्रभावित करेगा, और जो व्याख्यात्मक परिणाम प्रदान करते हैं ।
यह परख कई कारणों के लिए मौजूदा ठहराव तरीकों के संबंध में महत्वपूर्ण है । जब ठीक से चलाने के लिए, परख प्रारूप तक एक नमूना से 13 analytes तक quantitate कर सकते है अब तक छोटे संस्करणों का उपयोग करने के लिए पारंपरिक एलिसा परख का उपयोग नमूना विश्लेषण की आवश्यकता होगी । इस परख प्रारूप भी समर्पित इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है ताकि प्रदर्शन किया जाएगा । यह एक लाभ के लिए अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मनका की तुलना में immunoassays आधारित है परख आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रवाह cytometers के किसी भी संख्या का उपयोग कर चलाया जा सकता है ।
गुप्त कारकों और स्वास्थ्य और रोग में cytokine नेटवर्क द्वारा निभाई गई भूमिका में वैज्ञानिक जांच का विस्तार है । इस पांडुलिपि में वर्णित परख प्रारूप शोधकर्ताओं के लिए इन बहुमुखी और जटिल घटना को समझने की मांग के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण हो सकता है । सक्रिय जैव चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम न केवल क्षेत्रों में cytokine नेटवर्क की भूमिका का पता लगाने के लिए शुरू कर रहे है जैसे सामान्यीकृत सूजन6, लेकिन यह भी atherosclerosis, कैंसर, और neuroinflammation जैसे विशिष्ट रोग राज्यों के संदर्भ में 15,16,17. निस्संदेह, जांच के लिए उपंयास चिकित्सीय उपचार के लिए खोज के रूप में इन क्षेत्रों में विकसित करने के लिए इन पुरानी स्थितियों का इलाज जारी रहेगा फैलता है । इन रोगों से जुड़े घुलनशील मध्यस्थों के सटीक और विश्वसनीय ठहराव की आवश्यकता एक महत्वपूर्ण शोध प्राथमिकता बनी रहेगी.
The authors have nothing to disclose.
लेखकों के योगदान को स्वीकार करना चाहते हैं और bliss-परख उत्पाद विकास टीम के विकास के लिए परख है । इसके अलावा, हम डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर संकुल को डिजाइन करने में उनके सहयोगात्मक प्रयासों के लिए Vigene टेक, Inc शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |