このプロトコルでは、数量的なマルチプレックス ビーズ ベース イムノアッセイ ・ システムと流れの cytometer を使用して刺激マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に同時に複数のサイトカイン目標について説明します。
ビーズを用いたイムノアッセイ サンドイッチ免疫測定と同じ基本的な原理を採用しています。ビーズのサイズと内部アロフィコシアニン (APC) 蛍光強度によって区別することができます、特定の試料に特異抗体に共役をキャプチャします。次に、定義されているキャプチャ ビーズ セットの選択したパネルは、キャプチャー抗体に固有のターゲット analytes を含む生物学的サンプルと培養です。ビオチン標識検出抗体のカクテルが追加されます、キャプチャ ビーズ検体検出抗体サンドイッチの形成に 。
最後に、バインドされた試料の量に比例した蛍光信号強度を提供するビオチン検出抗体に結合するストレプトアビジン-フィコエ リスリン (SA PE) が追加されます。PE は蛍光ビーズ検体特異的領域の信号が、フローサイトメトリーを用いた定量化し、特定検体の濃度は、データ分析ソフトウェアとアッセイで生成される標準の曲線を使用して決定されます。
この実験では、マウス T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、同時に様々 な刺激条件下で培養マウス脾細胞から収集した組織培養上清中に 13 の独立したサイトカイン ターゲットの濃度を定量化します。
水溶性のシグナル伝達分子としての役割、サイトカインは宿主免疫反応を支配する因子と高い調整能力のプロセスを仲介します。彼らは解像度に開始からの炎症性プロセスのすべての段階の間に表現し、独自の合成とその細胞の受容体1を含む複雑な相互作用ネットワークを調整します。この通信ネットワークは個々 のコンポーネント間があります相乗的あるいは敵対関係を超えた複雑さと階層化します。確かに、冗長または少なくとも部分的に重なり合う機能2,3を共有する多くのサイトカインが知られています。
同時に複数のサイトカイン analytes を定量化する統合システムバイオロジーは現在複数疾患の基になる免疫反応を調整するユニークな cytokinomes のますます包括的な理解を提供します。4、5 を状態します。これら疾患状態まで炎症から癌、神経変性疾患、および心血管疾患6,7,8,9です。
LEGENDplex ビーズを用いたイムノアッセイを効果的に使用してこのようなサイトカイン ネットワークを尋問することができます。これらの試金はサンドイッチ酵素免疫測定法 (ELISA) と同じ原理に基づいています、エンコードされた蛍光マイクロスフィアを使用し表面に共有結合接続キャプチャ抗体。これらの抗体は ELISA の従来のフォーマットに必要なそれらより小さい表面領域に固定します。これにより、このような試金をはるかに少ないサンプル量と同時に非固有のバインドおよび提供を減らすいくつかの検体の分析を多重実行します。
このプロトコルで説明アッセイは、同時に最大 13 ターゲット量的にこの技術を利用しています。この試金のデータはさまざまな一般的な流れの cytometers を使用して取得することができますとは異なり、他の利用可能なアッセイを必要としない専用の試金固有のインストルメンテーションを使用。検証済み試料パネルの拡大カタログ、いくつか継続的な生物医学研究プロジェクト10、11,12,13これらのアッセイを使用されています。
使いやすさとマウスの T ヘルパー サイトカイン パネルを使用して、量的にこの実験で、アッセイ フォーマットの有用性を実証するには、13 別の複数の下で培養したマウス脾細胞から得られた培養上清からのサイトカイン濃度刺激の条件。組織培養上清、に加えてこのアッセイも実行できます血清または血漿サンプルを使用しています。
8。データの分析に進む 注: 14 無料でダウンロードすることができますデータ解析ソフトウェアを使用して流れの cytometer で生成された、FCS ファイルを分析する必要があります。 データ解析ソフトウェアを PC にインストールします。 すべてのアッセイ FCS ファイル解析ソフトウェアが含まれているコンピューターに転送します。 (キットに付属)、ライセンス キー ・ ドングルをコンピューターの USB ポートに差し込みます。 データ解析ソフトウェアを起動します。 青をクリックして " ファイルを追加 " ボタンが画面の上部にある。 ポップアップ表示されるウィンドウにアッセイから FCS ファイルを含むフォルダーに移動します。 をクリックしてポップアップ ウィンドウからソフトウェア表示にすべてのアッセイ FCS ファイルをドラッグします。すべてのファイルがリストに表示されます。 は緑をクリックして " 次 "、ディスプレイの右下のボタン。左クリックしてままドラッグして、小青の標準曲線は標準曲線を定義するリストから対応する FCS ファイルに (C7 c0) をボタンします。 緑をクリックして " 次 " ゲーティング ポップアップ ウィンドウを開くには画面の右下のボタンです。 ゲートのウィンドウの左側にある A の名前を入力し、B ビーズ地域分析試料ターゲットおよびその関連付けられたビード ID (アッセイに付属のマニュアルで確認) 昇順。 ポップアップ ウィンドウの上部からゲーティング ツールを選択し、FSC 対 SSC プロットの 2 つのゲート、A ビーズの周りの 1 つ、2 番目の B ビーズ周りを描画するために使用します。 は、APC 対 PE 散布図表示される FSC 対 SSC プロットの下に表示されるを確認します。6 試料バンド A ビーズ (左プロット) と 7 試料バンド B ビーズ (右の図) があります 。 注: ゲートは、上部に [消しゴム] ツールを選択し、所定のゲートを削除をクリックして手動で描画可能性があります。ゲーティング ツール可能性があります、選択し、目的バンド領域にゲートを手動で適用するために使用します。 緑をクリックして " OK " ゲーティング ポップアップ ウィンドウを閉じ、FCS ファイルの一覧に戻る] ボタンをクリックします。 右特定のファイルをクリックすると、選択することによって生物学的サンプルに加えられた希釈を定義 " 希釈倍 " メニュー適切な値を入力からします。 緑をクリックして " を実行 " 試金のための標準的な曲線を生成し、未知試料の濃度を計算表示の右下にあるボタンです。
このプロトコルで記述されているアッセイ フォーマットは、実験者を提供された生体試料中の可溶性調停プロファイルの堅牢な定量化は良い研究室技術と推奨されるプロトコルに準拠して提供できます。
信頼性の高い結果を保証するために従う必要がありますいくつかの主要な手順があります。まず、ポリプロピレン チューブにのみ希釈後、アッセイバッファー推奨、フルタイムを再構成する組換え基準を許可しなければなりません。ポリスチレンのチューブは、蛋白質の標準曲線を生成するときに低信号につながることができるチューブの壁への付着を促進することが。第二に、適切な培養手順中に揺れが重要です。適切な撹拌せず試金ビーズの結合特性を著しく妨げられること。さらに、インキュベーションのステップの間の適切な洗浄も必要です。実験者は過剰試薬がプロトコルの次のステップを開始する前に井戸から削除されることを確認してください。使用して試金ビーズ フローサイトの機器設定は、同様に最適化されなければなりません。特に、PMT の設定を調整して、適切なビードの分離と標準的なカーブの広いダイナミック レンジを確保する必要があります。最後に、cytometer で分析される直前にビーズに vortexed 適切なサスペンションを保証するために、集計結果を曲げるの形成を回避する必要があります。
このプロトコルは、研究者はプレート全体の大規模な分析を実行する前に、換散のプロトコルを最適化するために喜んで提供される組織乳剤として本稿で説明したサンプルの種類を分析する可能性のある変更ことができます。実際の手法は、組織の種類によってもちろん異なりますただし、一般的にプロトコルがイオンの塩の生理学的濃度、変性無農薬、好ましくない洗剤を含む中性 pH バッファーを使用する必要があります。洗剤を使用する必要がある場合非イオン性洗剤濃度は最小値 (例えばは 1% 以上) に保つ必要があります。バッファーは、標的タンパク質の分解を防ぐために十分なプロテアーゼ阻害剤を含める必要があります。換散のプロトコルが使用されるに関係なく微粒子分析の前に削除する最終準備を遠心する必要があります。
試金の制限に関する生物学的サンプルの型内の試料ターゲットの濃度が異なります。適切濃度を定量化するために、標準的なカーブのための上位および下位の値に収まる必要があります。カーブの値の外挿は、必ずしも信頼性がないと、お勧めしません。したがって調査官は、完全版の試金を実行する前にパイロット実験でそれらの特定のサンプルの希釈液を最適化する必要があります。さらに、試金するのに生物学的サンプルの入念な準備は、このアッセイの形式の成功に重要です。Lipemic、溶血されました、または蛋白質の破片を含むサンプルはこの免疫測定法の基本原則を定義する抗原抗体の相互作用に影響を与える、解釈である結果をレンダリングします。
この試金はいくつかの理由のための既存の定量化方法に関して重要です。正しく実行されると、アッセイの形式することができます量的に表わす伝統的な ELISA アッセイを使用してサンプルを分析する必要があるよりもはるかに小さいボリュームを使用してサンプルから最大 13 検体。このアッセイ フォーマットも必要ありません専用計測を実行するために。これは、アッセイは、一般的に使用される流れの cytometers の任意の数を使用して実行できる、他の市販のビーズを用いたイムノアッセイと比較利点です。
健康ネットワーク分泌因子とサイトカイン演じる役割への科学的な調査と病が拡大しています。本稿で説明している分析書式は、これらの多面的で複雑な現象を理解しようとする研究者にとって貴重なツールを使用できます。アクティブな生物医学研究プログラムは、だけでなくエリアなど、一般化された炎症6、におけるサイトカイン ネットワークの役割だけでなく、アテローム性動脈硬化、癌、neuroinflammationなど特定の病気の状態のコンテキストを探検し始めています。15,16,17。間違いなく、調査は、これら慢性疾患治療の検索が拡張されるとこれらの分野で成長を続けるでしょう。これらの疾患に関連付けられている溶性メディエーターの正確性と信頼性の定量化のための必要性は、重要な研究の優先順位になります。
The authors have nothing to disclose.
著者はバイオ マーカーと免疫アッセイの貢献を認識したいアッセイの開発製品開発チーム。さらに、データ分析ソフトウェア パッケージの設計の彼らの共同の努力の Vigene テクノロジー株式会社に感謝したいと思います。
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |