Det här protokollet beskriver kvantifiering av flera cytokin mål samtidigt i vävnad cellkulturer som samlats in från stimuleras mus splenocytes använder multiplex pärla baserad immunoassay plattform och en flödescytometer.
Bead-baserade immunanalyser anställa samma grundläggande princip som smörgås immunanalyser. Fånga pärlor, som kan differentieras efter storlek och interna allophycocyanin (APC) fluorescensintensiteten, konjugeras till antikroppar som är specifika för en viss analyt. Nästa, en vald panel av definierade inspelningsuppsättningar pärla inkuberas med ett biologiskt prov innehållande mål analyter specifika för fånga antikropparna. En biotinylerade detektionsantikropp cocktail tillsätts, vilket leder till bildandet av capture pärla-analyt-detektionsantikropp smörgåsar.
Slutligen läggs streptividin-fykoerytrin (SA-PE), som binder till biotinylerade upptäcka antikroppar, som ger fluorescerande signal stödnivåer i proportion till den bundna analyten. PE fluorescerande signal av analyten-specifika pärlor regioner kvantifieras med hjälp av flödescytometri och koncentrationerna av särskilda analyter bestäms med hjälp av data analysprogram och standardkurvan genereras i analysen.
I detta experiment använder vi en mus T helper cytokin panel samtidigt kvantifiera koncentration av 13 separata cytokin mål i vävnad cellkulturer som samlats in från mus splenocytes odlade olika stimulerande villkor.
I sin roll som lösliga signalmolekyler medla cytokiner de mycket samordnat och multifaktoriell processer som styr värd immunologiska svar. De uttrycks under alla stadier av den inflammatoriska processen, från initiering till resolution, och reglera ett komplext samspel nätverk som inkluderar sin egen syntes och att deras cellulära receptorer1. Detta kommunikationsnätet är skiktad med en komplexitet som går utöver de synergistiska eller antagonistiska relationer som kan finnas mellan enskilda komponenter. Faktiskt, många cytokiner är kända för att dela redundant eller åtminstone delvis överlappande funktioner2,3.
Integrerade system biologi metoder som samtidigt kvantifiera flera cytokin analyter för närvarande tillhandahåller en alltmer omfattande förståelse för den unika cytokinomes som dirigera immunsvaret underliggande flera sjukdom har4,5. Sjukdom har allt från generaliserad inflammation på cancer, neurodegenerativa och hjärt-kärlsjukdom6,7,8,9.
Sådana cytokin nät kan förhöras effektivt med LEGENDplex pärla-baserade immunanalyser. Dessa analyser baseras på samma princip som smörgås enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), och använda fluorescens kodade mikrosfärer med capture antikroppar kovalent bifogas deras yta. Dessa antikroppar är orörlig på ytor som är mycket mindre än de som krävs enligt traditionell ELISA-format. Detta gör att sådana analyser skall utföras med långt mindre provvolymen, medan på samma gång minska icke-specifik bindning och tillhandahålla multiplexed analys av flera analyter.
Den analysmetod som beskrivs i detta protokoll använder denna teknik för att kvantifiera upp till 13 mål samtidigt. Data från denna analys kan fås med en mängd olika vanligen förekommande flöde cytometers och till skillnad från andra tillgängliga analyser kräver inte användning av dedikerade assay-specifika instrumentering. Med en växande katalog av validerade analyten paneler, har dessa analyser använts i flera pågående biomedicinsk forskning projekt10,11,12,13.
För att demonstrera den lätthet och nyttan av formatet assay, i detta experiment använder vi en mus T helper cytokin panel för att kvantifiera separata 13 cytokin koncentrationer från vävnad cellkulturer från mus splenocytes odlade under flera stimulerande förhållanden. Utöver vävnad cellkulturer, kan denna analys också utföras med hjälp av serum-eller plasmaprover.
8. Gå vidare till dataanalys Obs: The FCS filer genereras på flödescytometer bör analyseras med hjälp av data analys programvara som kan laddas ner gratis 14. Installera data analys programvara på en PC. Överföra alla assay FCS filer till datorn som innehåller analysprogrammet. Licens nyckel dongle (ingår i satsen) ansluts via en USB-port på datorn. Starta data analys programvara. Klicka på blå " Lägg till filer " knappen längst upp på skärmen. Navigera till mappen som innehåller filerna FCS från analysen i pop up fönster som visas. Klicka och dra alla assay FCS filer från pop up-fönstret till programvara displayen. Alla filer ska nu visas i en lista. Klicka på gröna " nästa " knappen på nere till höger i displayen. Vänsterklicka och håll för att dra lilla blå standardkurvan knappar (C7 att C0) till deras motsvarande FCS filer från listan för att definiera standardkurvan. Klicka på gröna " nästa " knappen på nere till höger på displayen för att öppna Usenets pop up fönster. På vänster sida av fönstret Usenets anger namnen på både A och B pärla regioner assay analyten mål och deras associerade pärla-ID (finns i handbok med analys) i stigande ordning. Välj verktyget portande från toppen av pop up-fönstret och använda den för att rita 2 grindar i FSC vs. SSC tomten, en runt A pärlor och en andra runt B pärlorna. Granska APC vs. PE scatter tomter som visas nedanför FSC vs. SSC tomten som visas. Det blir 6 analyten band i A pärlorna (vänster tomt) och 7 analyten band i B pärlorna (rätt tomt). Obs: Gates kan ritas manuellt genom att välja radergummiverktyget i toppen och klicka på ta bort en viss grind. Usenets verktyget kan sedan väljas och används för att manuellt Applicera en grind till regionen önskat band. Klicka på gröna " OK " knappen för att stänga Usenets pop up-fönstret och återgå till listan över FCS filer. Definiera alla spädningar som gjorts i biologiska prover vid rätt klickande en viss fil, välja " utspädning vik " från menyn och rätta värde. Klicka på gröna " kör " knappen nere till höger på displayen för att generera de standard kurvorna för analysen och beräkna koncentrationerna av okända biologiska prover.
Det assay format som beskrivs i detta protokoll kan ge robusta kvantifiering av lösliga medlare profiler i biologiska prover som tillhandahålls av försöksledaren har god laboratoriesed teknik och följer det rekommendera protokollet.
I området i närheten finns det flera viktiga steg som måste följas för att garantera tillförlitliga resultat. Först, rekombinant normerna får Beredes i analysbuffert på heltid som rekommenderas, och efter endast späds med polypropylene rören. Polystyren rören kan främja efterlevnaden av proteiner väggen i rören, vilket kan leda till låga signaler när du genererar standardkurvan. Andra, ordentlig skakar under inkubationsstegen är kritisk. Utan korrekt agitation, kan de bindande egenskaperna av assay pärlor hindras allvarligt. Dessutom krävs också ordentlig tvätt mellan inkubationsstegen. Försöksledaren måste se till att överskott reagenser avlägsnas från brunnarna innan vi påbörjar nästa steg i protokollet. Instrument inställningar för den flödescytometer som används för att förhöra assay pärlorna måste optimeras liksom. I synnerhet måste PMT inställningar justeras för att säkerställa korrekt pärla separation och brett dynamiskt intervall för standard kurvorna. Slutligen, strax före analyseras på cytometer, pärlor måste vara vortexed att försäkra korrekt fjädring och för att undvika bildandet av aggregat som kan förvränga resultaten.
Detta protokoll kan potentiellt ändras för att analysera vävnad homogenates samt de provtyper som diskuteras i detta manuskript, förutsatt att forskaren är villiga att optimera deras lysis protokoll före utför stor, full tallrik analyser. Själva tekniken varierar naturligtvis beroende på vävnadstyp; i allmänhet bör protokollet dock använda ett neutralt pH buffert innehållande fysiologiska koncentrationer av Joniska salter, inga denatureringen kemikalier och helst inga rengöringsmedel. Om rengöringsmedel måste användas, bör icke-joniskt rengöringsmedel koncentrationerna hållas på ett minimum (t.ex. mer än 1%). Bufferten bör också innehålla tillräcklig proteashämmare för att förhindra proteolytisk nedbrytning av målproteiner. Oavsett det lysis protokoll som används, bör de sista förberedelserna vara centrifugeras för att ta bort partiklar före analys.
Angående analys begränsningar, koncentrationerna av analyten mål i typer av biologiska prov kan variera kraftigt. För att korrekt vis kvantifiera analyten koncentrationer, måste de falla inom de övre och nedre värdena för standardkurvan. Extrapolering av värden av kurvan är inte nödvändigtvis pålitlig och rekommenderar inte. Utredarna måste därför optimera utspädningar av sina särskilda prover i pilotförsök innan du kör en full-plate assay. Dessutom är försiktig utarbetandet av de biologiska proverna som skall analyseras avgörande för framgången för detta test format. Prover som lipemiska, hemolyserade, eller innehålla protein skräp kommer att påverka det antigen-antikropp samspel som definierar core principen om denna immunoassay, och återge resultaten som är det.
Denna analys är betydelse med avseende på befintliga metoder för kvantifiering av flera skäl. När kör ordentligt, kan formatet assay kvantifiera upp till 13 analyter från ett prov med långt mindre volymer än skulle vara skyldiga att analysera provet med traditionell ELISA-analyser. Denna assay format också kräver inte särskild instrumentering för att utföras. Detta är en fördel jämfört med andra kommersiellt tillgängliga pärla-baserade immunoanalyser som analysen kan köras med valfritt antal vanliga flöde cytometers.
Vetenskaplig undersökning in i rollen som spelas av utsöndrade faktorer och cytokin nätverk i hälsa och sjukdom expanderar. Det assay format som beskrivs i detta manuskript kan vara ett värdefullt verktyg för forskare som försöker förstå dessa mångfacetterade och komplexa fenomen. Aktiva biomedicinsk forskningsprogram börjar utforska rollen som cytokin nätverk inte bara områden såsom generaliserad inflammation6, men också i samband med särskilda sjukdomstillstånd såsom åderförkalkning, cancer och neuroinflammation 15,16,17. Utan tvekan, undersökningen kommer att fortsätta att växa i dessa områden som sökandet efter nya läkemedel för att behandla dessa kroniska tillstånd expanderar. Behovet av korrekt och tillförlitlig kvantifiering av den lösliga mediatorer som förknippas med dessa sjukdomar kommer att förbli en kritisk forskning prioritet.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna bidrag av biomarkörer och Immuno-analyser produktutveckling team till utvecklingen av analysen. Dessutom vill vi tacka Vigene Tech, Inc. för deras gemensamma ansträngningar att utforma data analys programvarupaket.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |