Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.
Boncuk tabanlı uzun aynı temel ilke olarak sandviç uzun istihdam. Boncuklar, boyutu ve iç allophycocyanin (APC) floresan yoğunluğu tarafından ayrıştırılan, belirli bir analit için özel antikorlar için Birleşik yakalamak. Ardından, seçilen bir panel tanımlanmış yakalama boncuk kümeleri içeren hedef analitler yakalama karşı antikorlar için belirli bir biyolojik örnek ile inkübe. Hangi yakalama boncuk analit algılama antikor sandviç oluşumuna yol açar bir biotinylated algılama antikor kokteyl eklenir.
Son olarak, hangi biotinylated algılama antikorlar, floresan sinyal şiddetlerde bağlı analit miktarı ile orantılı olarak sağlayan bağlar streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) eklenir. PE sinyal analit özel boncuk bölgelerin Akış Sitometresi kullanarak sayısal ve belirli analitler konsantrasyonları assay olarak oluşturulan standart eğri ve veri analiz yazılımı kullanarak belirlenir floresan.
Bu deneyde, aynı anda doku kültürü supernatants fare splenocytes çeşitli uyarıcı koşullar altında kültürlü toplanan 13 ayrı sitokin hedeflerin konsantrasyon ölçmek için bir fare T yardımcı sitokin panelini kullanın.
Çözünen sinyal molekülleri olarak onların rolü, sitokinler ana bilgisayar immünolojik yanıt-e doğru yönetmek son derece koordineli ve multifaktöriyel işlemleri aracılık. İnflamatuar işleminden başlatılması için çözünürlük, tüm aşamalarında ifade edilir ve kendi sentezi ve bu onların hücresel reseptörleri1oluşan karmaşık etkileşim ağ düzenler. Bu iletişim ağı bileşenler arasında varolabilir sinerjik veya antagonistik ilişki gider bir karmaşıklığı ile katmanlı. Gerçekten de, birçok sitokinler gereksiz ya da en azından kısmen çakışan fonksiyonlar2,3paylaşmak için bilinir.
Aynı anda birden fazla sitokin analitler ölçmek entegre sistemleri Biyoloji yaklaşımlar şu anda altta yatan birden çok hastalık bağışıklık yanıtı alacak benzersiz cytokinomes giderek kapsamlı bir anlayış sağlamak 4,5devletler. Bu hastalık Birleşik arasında değişir yaygın iltihap kanser, nöro-dejeneratif koşulları ve kalp-damar hastalıkları6,7,8,9.
Böyle sitokin ağlar etkin bir şekilde kullanarak LEGENDplex boncuk tabanlı uzun sorguya çekilmeyi. Bu deneyleri sandviç Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) olarak aynı ilkeye dayanır ve kovalent bağlı onların yüzeye yakalama antikorlar ile kodlanmış Floresans mikroküreler kullanın. Bu antikorlar yüzey alanlarını çok geleneksel ELISA biçimleri tarafından gerekli olanlar daha küçük üzerinde immobilize. Bu aynı zamanda azaltılması non-spesifik bağlama ve sağlayan çeşitli analitlerin analizini multiplexed ise çok daha az numune hacmi ile gerçekleştirilecek bu tür deneyleri sağlar.
Bu protokol için açıklanan tahlil kadar 13 hedefleri aynı anda quantitate için bu teknolojiyi kullanır. Bu tahlil verilerinden çok çeşitli yaygın olarak bulunan akış cytometers kullanılarak elde edilebilir ve diğer kullanılabilir deneyleri özel tahlil özel araçları kullanımı gerektirmez. Doğrulanmış analit panelleri genişleyen bir katalog ile bu deneyleri birkaç devam eden Biyomedikal Araştırma Projeleri10,11,12,13‘ te kullanılmıştır.
Kolaylığı ve tahlil biçiminin bir fare T yardımcı sitokin panel quantitate için kullandığımız bu denemede yarar göstermek için sitokin konsantrasyonlarda doku kültürü supernatants altında birden çok kültürlü fare splenocytes elde edilen üzerinden 13 ayrı uyarıcı koşulları. Doku kültürü supernatants ek olarak, bu tahlil serum veya plazma numuneleri kullanılarak da gerçekleştirilebilir.
8. Veri analizi için devam Not: Akış Sitometresi üretilen FCS dosyaları-var analiz ücretsiz 14-ebilmek var olmak downloaded veri analiz yazılımı kullanarak. Veri analiz yazılımı install üstünde PC. Tüm tahlil FCS dosyaları analiz yazılımı içeren bilgisayara aktarmak. Belgili tanımlık ruhsat anahtar dongle (kit ile birlikte) bir bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın. Veri analiz yazılımı başlatmak. Mavi tıklatın " dosyaları ekle " düğmesini ekranın üst kısmında bulunan. Görünür pencere açılır tahlil FCS dosyaları içeren klasöre gidin. Tıklayın ve tüm tahlil FCS dosyaları pencere açılır yazılım görüntüye sürükleyin. Tüm dosyaları şimdi bir listesinde görüntülenmesi gerekir. ‘I tıklatın yeşil " sonraki " ekranın sağ alt düğmesini. Sol tıklatın ve küçük sürüklemek için basılı tutun mavi standart eğri standart eğri tanımlamak için listeden ilgili FCS dosyalarına (C7 C0) düğmeleri. Yeşil tıklatın " sonraki " pencere gating açılır açmak için ekranın sağ alt düğmesini. Gating penceresinin sol tarafında her iki a girin ve B boncuk bölgeleri tahlil analit hedefleri ve onların ilişkili boncuk ID (tahlil ile sağlanan elle kurmak) artan sırada. Pencere açılır tepesinden gating aracını seçin ve FSC SSC arsa içinde 2 geçitleri, A boncuk etrafında bir ve ikinci B boncuk etrafında çizmek için kullanın. APC vs scatter araziler görünür FSC SSC arsa görünen PE gözden geçirin. A boncuk (sol çizgi) 6 analit bantlarında ve B boncuk (doğru çizgi) 7 analit bantlarında olacak. Not: Gates el ile üst Silgi aracını seçip belirli bir kapı silmek için tıklatarak çizilmesi. Perdeleme aracı daha sonra seçili olabilir ve el ile bir kapı istenen bant bölgeye uygulamak için kullanılan. Yeşil tıklatın " Tamam " pencere gating açılır kapatmak ve FCS dosyalar listesine dönmek için düğmeyi. Tanımlamak için biyolojik örnek belirli bir dosya tıklayarak, seçerek sağ tarafından yapılan herhangi bir dilutions " seyreltme kat " menü ve giriş doğru değeri. Yeşil tıklatın " çalıştırmak " tahlil için standart eğriler oluşturmak ve bilinmeyen biyolojik örnekler konsantrasyonları hesaplamak için ekranın sağ alt düğmesini.
Bu protokol için tahlil biçimde deneyci sağlanan biyolojik örnek profillerinde çözünür arabulucu sağlam miktar için önerilen bir protokoldür aynılarını ve iyi laboratuar tekniği vardır sağlar.
Güvenilir sonuçlar sağlamak için takip edilmesi gereken birkaç temel adım vardır. İlk olarak, rekombinant standartları tahlil arabellek önerilen tam zamanlı ve sonra sadece polipropilen tüplerde seyreltilmiş reconstitute için izin gerekir. Polistren tüpler proteinler bağlılığı düşük sinyalleri için standart eğri oluşturma sırasında neden olabilir tüpler, duvarına yükseltebilirsiniz. İkinci, doğru sallayarak kuluçka adımları sırasında önemlidir. Uygun ajitasyon tahlil boncuk bağlama özellikleri ciddi engel. Buna ek olarak, kuluçka adımlar arasında uygun yıkama da gereklidir. Deneyci aşırı reaktifler kuyulardan protokol sonraki adımda başlıyor önce kaldırılır emin olmalısınız. Aletleri ayarları tahlil boncuk sorguya çekmek için kullanılan Akış Sitometresi için de optimize edilmiş olması gerekir. Özellikle, devresel_ödeme ayarları uygun boncuk ayrılık ve geniş dinamik aralığı standart Eğriler için emin olmak için ayarlanması gerekir. Son olarak, sadece üzerinde sitometresi önce analiz ediliyor, boncuk vortexed uygun süspansiyon sigorta ettirmeleri ve sonuçları çarpık toplamları oluşumunu önlemek için olmalıdır.
Bu iletişim kuralı, araştırmacı büyük, tam plaka deneyleri gerçekleştirmeden önce onların lizis protokolü en iyi duruma getirmek için istekli olması koşuluyla bu el yazması açıklanan örnek türleri yanı sıra doku homogenates de analiz için potansiyel olarak değiştirilebilir. Gerçek teknik tabii doku türüne bağlı olarak değişir; Ancak, genel olarak protokol iyonik tuzlar fizyolojik konsantrasyonları, denaturing hiçbir kimyasal madde ve tercihen hiç deterjanlar içeren bir nötr pH tampon kullanmanız gerekir. Deterjan kullanılmalıdır, non-iyonik deterjan konsantrasyonları (örneğin en fazla % 1) en azından tutulmalıdır. Arabellek aynı hedef proteinlerin proteolitik yıkımı önlemek için yeterli proteaz inhibitörleri içermelidir. Kullanılan lizis protokole bakılmaksızın son hazırlıklar tanecikleri analiz önce kaldırmak için centrifuged.
Tahlil ile ilgili sınırlamalar, biyolojik örnek türleri analit hedefleri konsantrasyonları büyük ölçüde değişebilir. Düzgün analitin konsantrasyonlarının ölçmek için onlar için standart eğri üst ve alt değerleri içinde olmalıdır. Değerleri eğrinin ekstrapolasyon mutlaka güvenilir değildir ve tavsiye etmiyorum. Araştırmacılar bu nedenle onların belirli örnekler tam plaka tahlil çalıştırmadan önce pilot deneylerde dilutions optimize etmek gerekir. Buna ek olarak, denetlesinler biyolojik örnekler dikkatli hazırlanması bu tahlil biçim başarısı için her şeyden önemlidir. Numunelerde olan, hemolyzed veya protein enkaz içeren örneklerini bu immunoassay temel prensibi tanımlamak antijen antikor etkileşimleri etkiler ve uninterpretable sonuçlar işlemek.
Bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı mevcut miktar yöntemler açısından önemlidir. Düzgün çalıştırdığınızda, tahlil biçim geleneksel ELISA testleri kullanarak örnek analiz etmek için gerekli olacağını daha çok küçük birimleri kullanarak bir örnek üzerinden en fazla 13 analitler quantitate. Bu tahlil biçimi de özel araçları gerçekleştirilmesi için gerek yoktur. Bu tahlil pek çok yaygın olarak kullanılan akış cytometers kullanarak çalıştırılabilir olarak piyasada bulunan diğer boncuk tabanlı uzun karşılaştırıldığında bir avantajdır.
Bilimsel araştırma rolüne salgılanan faktörler ve sitokin tarafından sağlık ağlarda oynadı ve hastalık genişletiyor. Bu el yazması tahlil biçimde bu çok yönlü ve karmaşık olayları anlamak isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olabilir. Etkin Biyomedikal Araştırma programları sitokin ağları sadece gibi Genelleştirilmiş alanları iltihabı6rolü, aynı zamanda belirli hastalık durumlarında ateroskleroz, kanser ve neuroinflammation gibi içinde bağlamında keşfetmeye başlıyor 15,16,17. Hiç şüphesiz, soruşturma bu kronik koşulları tedavi etmek yeni tedavi için arama genişledikçe bu alanlarda büyümeye devam edecektir. Doğru ve güvenilir miktar bu hastalıklar ile ilişkili çözünür arabulucu ihtiyacını bir kritik araştırma öncelik olmaya devam edecektir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Biyomarkörler ve IMMUNO-deneyleri katkıları kabul etmek istiyorum ürün geliştirme ekibi tahlil gelişimi için. Buna ek olarak, Vigene teknoloji, Inc veri analizi yazılım paketleri tasarlama ortak çabaları için teşekkür etmek istiyorum.
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |