Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma

doi: 10.3791/56440 Published: November 9, 2017

Summary

Bu iletişim kuralı birden fazla sitokin hedeflerin aynı anda doku kültürü supernatants multiplex boncuk tabanlı immunoassay platform ve bir Akış Sitometresi kullanarak uyarılmış fare splenocytes toplanan miktar açıklar.

Abstract

Boncuk tabanlı uzun aynı temel ilke olarak sandviç uzun istihdam. Boncuklar, boyutu ve iç allophycocyanin (APC) floresan yoğunluğu tarafından ayrıştırılan, belirli bir analit için özel antikorlar için Birleşik yakalamak. Ardından, seçilen bir panel tanımlanmış yakalama boncuk kümeleri içeren hedef analitler yakalama karşı antikorlar için belirli bir biyolojik örnek ile inkübe. Hangi yakalama boncuk analit algılama antikor sandviç oluşumuna yol açar bir biotinylated algılama antikor kokteyl eklenir.

Son olarak, hangi biotinylated algılama antikorlar, floresan sinyal şiddetlerde bağlı analit miktarı ile orantılı olarak sağlayan bağlar streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) eklenir. PE sinyal analit özel boncuk bölgelerin Akış Sitometresi kullanarak sayısal ve belirli analitler konsantrasyonları assay olarak oluşturulan standart eğri ve veri analiz yazılımı kullanarak belirlenir floresan.

Bu deneyde, aynı anda doku kültürü supernatants fare splenocytes çeşitli uyarıcı koşullar altında kültürlü toplanan 13 ayrı sitokin hedeflerin konsantrasyon ölçmek için bir fare T yardımcı sitokin panelini kullanın.

Introduction

Çözünen sinyal molekülleri olarak onların rolü, sitokinler ana bilgisayar immünolojik yanıt-e doğru yönetmek son derece koordineli ve multifaktöriyel işlemleri aracılık. İnflamatuar işleminden başlatılması için çözünürlük, tüm aşamalarında ifade edilir ve kendi sentezi ve bu onların hücresel reseptörleri1oluşan karmaşık etkileşim ağ düzenler. Bu iletişim ağı bileşenler arasında varolabilir sinerjik veya antagonistik ilişki gider bir karmaşıklığı ile katmanlı. Gerçekten de, birçok sitokinler gereksiz ya da en azından kısmen çakışan fonksiyonlar2,3paylaşmak için bilinir.

Aynı anda birden fazla sitokin analitler ölçmek entegre sistemleri Biyoloji yaklaşımlar şu anda altta yatan birden çok hastalık bağışıklık yanıtı alacak benzersiz cytokinomes giderek kapsamlı bir anlayış sağlamak 4,5devletler. Bu hastalık Birleşik arasında değişir yaygın iltihap kanser, nöro-dejeneratif koşulları ve kalp-damar hastalıkları6,7,8,9.

Böyle sitokin ağlar etkin bir şekilde kullanarak LEGENDplex boncuk tabanlı uzun sorguya çekilmeyi. Bu deneyleri sandviç Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) olarak aynı ilkeye dayanır ve kovalent bağlı onların yüzeye yakalama antikorlar ile kodlanmış Floresans mikroküreler kullanın. Bu antikorlar yüzey alanlarını çok geleneksel ELISA biçimleri tarafından gerekli olanlar daha küçük üzerinde immobilize. Bu aynı zamanda azaltılması non-spesifik bağlama ve sağlayan çeşitli analitlerin analizini multiplexed ise çok daha az numune hacmi ile gerçekleştirilecek bu tür deneyleri sağlar.

Bu protokol için açıklanan tahlil kadar 13 hedefleri aynı anda quantitate için bu teknolojiyi kullanır. Bu tahlil verilerinden çok çeşitli yaygın olarak bulunan akış cytometers kullanılarak elde edilebilir ve diğer kullanılabilir deneyleri özel tahlil özel araçları kullanımı gerektirmez. Doğrulanmış analit panelleri genişleyen bir katalog ile bu deneyleri birkaç devam eden Biyomedikal Araştırma Projeleri10,11,12,13' te kullanılmıştır.

Kolaylığı ve tahlil biçiminin bir fare T yardımcı sitokin panel quantitate için kullandığımız bu denemede yarar göstermek için sitokin konsantrasyonlarda doku kültürü supernatants altında birden çok kültürlü fare splenocytes elde edilen üzerinden 13 ayrı uyarıcı koşulları. Doku kültürü supernatants ek olarak, bu tahlil serum veya plazma numuneleri kullanılarak da gerçekleştirilebilir.

Protocol

tüm hayvan deneyleri bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları için kılavuzu içinde yer NIH öneriler göre gerçekleştirilen ve BioLegend, IACUC tarafından kabul edildi.

Figure 1
Resim 1: Filtre plaka tahlil yordamı Özeti. Filtre plakaları kullanarak tahlil gerçekleştirmek için protokol anahtar tahlil bileşenleri ve kuluçka adımları gösteren bir diyagram olarak temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

1. biyolojik örnek hazırlık

Not: kan toplama hacmi ve seçilen anatomik site her bireysel araştırmacı takdirine bırakılır ve tahlil sonucunu etkilemez. Bir kez onlar elde edilir, ancak, örnekleri aşağıda listelenen adımları göre ele alınmalıdır.

  1. Serum numuneleri hazırlık
    1. tercih edilen toplama tüp içine kan istenen hacmi toplamak ve en az 30 dk pıhtısı izin
    2. Örnek için oda sıcaklığında 1000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi.
    3. Çıkarın serum ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve örnekleri, saklayın ≤ -20 ° c
  2. Plazma numuneleri hazırlık
    1. toplamak istediğiniz birimin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) kullanarak kan kan toplama tüpler kaplı.
    2. Koleksiyonu 10 dk, 30 dk içinde oda sıcaklığında 1000 x g için santrifüj.
    3. Çıkarın plazma ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve örnekleri, saklayın ≤ -20 ° c
  3. Hazırlık doku kültürü süpernatant örnekleri
    1. örnek için 1.500 x g 4 ° C'de hücreler ve enkaz kaldırmak için de 10 dk santrifüj kapasitesi.
    2. Adlı toplamanız süpernatant ve hemen tahlil veya aliquot polipropilen microcentrifuge tüpler içine ve ≤ -20 ° c
  4. Çözdürme donmuş biyolojik örnekleri
    1. tamamen buz ve girdap kullanmadan önce kısa bir süre daha önce dondurulmuş herhangi bir biyolojik örnekler çözülme. 2'den fazla donma/çözülme döngüsü önlemek.
      Not: Bu protokol için kullanılan örnekleri BALB/c fare splenocytes kültür tarafından elde edilmiştir (1 x 10 6 hücreler çeşitli koşullar altında 37 ° C + %5 CO 2: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/plaka kaplı mL) + αCD28 (1 µg/mL çözünür), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kültür supernatants 48 saat sonra toplanmıştır ve 1.3 bölümünde açıklandığı gibi işlenebilir.

2. Reaktif hazırlık

  1. Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized boncuk
    1. Sonicate öncesi karışık boncuk şişe bir sonicator banyoda oda sıcaklığında ve sonra girdap kullanmadan 30 s önce için 1 dk için. Sonicator banyo yok varsa, 1 dk. girdap süresini artırmak
  2. Hazırlık yıkama arabellek
    1. Bring 20 x yıkama arabellek (20 x PBS % 1 ile ara-20) oda sıcaklığında ve tüm tuzları çözümü haline getirmek için girdap kit ile sağlanan.
    2. 20 x 475 mL deiyonize su ile yıkama tampon 25 mL seyreltik. 2 ° C ve bir ay boyunca 8 ° C arasında kullanılmayan kısmı mağaza.
  3. Matris B hazırlık (Serum ve plazma örnekleri yalnızca ile kullanmak için)
    1. 5.0 için liyofilize matris B. izin ver en az 15 dk tam reconst için içeren şişe seti dahil mL tahlil arabellek (PBS % 1 BSA ile) ekleyin itution, o zaman girdap iyice karıştırın. Artık Sulandırılan matris B depolanan ≤-70 ° C en fazla bir ay için.

3. Standart hazırlık

Not: Bu bölmedeki her analit 10.000 pg/mL bir üst standart konsantrasyonu vardır.

  1. Ekleyin 250 µL tahlil lyophilized fare Th sitokin standart kokteyl reconstitute için arabellek. Mix kısaca vortexing tarafından ve oda sıcaklığında için 10 dk. oturup şişeyi sağlar
  2. Transfer standart kokteyl etiketli bir polipropilen microcentrifuge tüp " C7 ". Bu üst standart kullanılacaktır.
  3. Etiket 6 polipropilen microcentrifuge tüpler C6, C5, C4, C3, C2 ve C1.
  4. Her birine bu tüpler tahlil arabelleği eklemek 75 µL.
  5. En iyi standart C7 C6 tüp ve mix de vortexing tarafından
  6. transfer 25 µL. Bu C6 standart olacak.
  7. Seri performans devam yeni damlalıklı kullanarak 1:4 dilutions sonraki en düşük standart tüp vortexing tarafından takip tahlil arabelleği µL 75 25 µL önceki standart eklemek her tüp için standartlar C5, C4, C3 elde etmek için ipucu , C1 ve C2. (C0) 0 pg/mL standart olarak tahlil arabellek kullanın.

4. Örnek seyreltme

Not: Bu tahlil ile birden fazla dilutions kullanarak ön pilot deneyleri biyolojik örneklerin belirli bir küme için en uygun seyreltme faktörü belirlemek için gerekli olabilir. Uygun seyreltme faktörü standart eğri sınırları içinde yalan toplama hesaplamaları için örnek üretecek. Aşağıdaki adımları yönergelerine içindir ve ampirik olarak örnek türüne bağlı olarak belirlenecek olabilir.

  1. Dilute serum ya da plazma örnekleri 2 kat tahlil arabelleği ile (örn. örnek 50 µL 50 µL tahlil arabelleği ile seyreltik) polipropilen microcentrifuge tüpler.
    Not: daha fazla Numune dilüsyonu gerekliyse, dilutions matris B ile tahlil tampon yerine doğru ölçüm sağlamak için yapılmalıdır. Seyreltme olmadan ekleyerek serum veya plazma numuneleri düşük tahlil doğruluk neden olur ve filtre plaka yapışmasına neden. Matris B havuza alınan fare serum endojen tahlil hedefleri tükenmiş oluşur. Uzun etkiler analitik duyarlılık için bilinen matris etkilerinden korunmak için bir serum veya plazma örnek seyreltici kullanılır.
  2. Test hücre kültür süpernatant örnekleri olmadan seyreltme.
    Not: Büyük ölçüde örnek örnek analit düzeyleri farklılık gösterebilir. Gerekirse, onların karşılık gelen hücre kültür orta veya tahlil arabellek taze bir hazırlık kullanarak süpernatant örnekleri sulandırmak.

5. Tahlil yordam

Not: Polipropilen filtre plakaları, mikro FACS tüpler veya V-alt Mikroplaka tahlil gerçekleştirilebilir. Filtre plaka tahlil yordamı iyi örnek için örnek nedeniyle tutarlılık, tahlil sağlamlık ve işleme kolaylığı önerilir. Bu yordam bir vakum filtrasyon ünitesi (son kullanıcı tarafından sağlanan) yıkama gerektirir.

  1. Oda sıcaklığında (20-25 ° C) sıcak tüm reaktifler kullanılmadan önce izin.
  2. Kümesi filtre plaka üzerinde bir ters plaka kapak her zaman tahlil kurulum ve kuluçka adımları uyguladığınızda, böylece alt plaka sızıntı neden olabilir gibi herhangi bir yüzey dokunmatik değil.
  3. Plaka boncuk kaybetmemek için çamaşır adımlar da dahil olmak üzere tüm tahlil işlem sırasında dik tutmak.
  4. Karanlık veya tüm kuluçka adımlar için alüminyum folyo ile sarılmış plaka devam.
  5. Tüm standartları ve örnekleri çiftleri bir sırayla tabakta düzenlenmiş, farklı çalıştır.
  6. Filtre plaka her şey için 1 yıkama arabellek x 100 µL ekleyerek önceden ıslak ve oda sıcaklığında 1 dk (filtre alt Mikroplaka kullanıyorsanız) oturmak izin.
  7. Vakum manifold (5-10 lar) kullanarak Kaldır Tampon birim. 10 aşmamak " Hg vakum. Fazla yıkama leke Kalenin altından bir yığın temiz kağıt havlu üzerinde plaka basarak tampon. Plaka ters plaka kapak üstüne yerleştirin.
    Not: Eğer bir V-alt Mikroplaka veya mikro FACS borular kullanarak tahlil gerçekleştirme adımları 5.1-5.2 atlanabilir.
  8. Hücre kültür süpernatant örnekler için tahlil arabelleği 25 µL bütün wells için ekleyin. Her standart 25 µL standart wells için ekleyin. 25 µL her örneği için örnek wells ekleyin.
  9. Serum veya plazma numuneleri ölçmek için matrisin b 25 µL eklemek için standart wells. Tahlil arabelleği 25 µL örnek wells için ekleyin. Her standart 25 µL standart wells için ekleyin. 25 µL her seyreltik serum veya plazma örneği için örnek wells ekleyin.
  10. Girdap boncuk için 30 s. 25 eklemek µL karışık boncuk boncuk şişe zaman zaman yerleşme boncuk önlemek için sallayarak her de karışık. Son hacim boncuk eklenmesinden sonra her iyi 75 µL olmalıdır.
  11. Bir tabak mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın. Plaka üzerinde bir plaka shaker yer, güvenli ve oda sıcaklığında 2 h için yaklaşık 500 rpm'de sallamak. Sızıntı önlemek için pozitif basınç plaka sealer için geçerli değildir.
  12. Ters çevirme olmadan, plaka üzerinde vakum manifold yerleştirin ve vakum daha önce olduğu gibi uygular ve her şey için 1 yıkama arabellek x 200 µL ekler.
  13. Vakum filtrasyon tarafından tahlil plaka wells içeriğini kaldırın. Fazla yıkama arabellek bir emici ped ya da kağıt havlu ile plaka altındaki leke. Bir kez daha bu işlemi tekrarlayın.
    Not: tahlil gerçekleştirilirse V-alt Mikroplaka veya mikro FACS kullanarak atla adım 5.12 ve 5.13 tüpleri. Bunun yerine 1000 x g oda sıcaklığında 5 min için plaka santrifüj kapasitesi, daha sonra bir çok kanallı pipet kullanarak süpernatant kaldırmak.
  14. Ekle 25 µL antikorların (bkz: malzemeler tablo) algılama için her şey.
  15. Taze plaka mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın.
  16. Plaka üzerinde bir plaka shaker yerleştirin ve yaklaşık 500 RPM oda sıcaklığında 1 h için sallamak.
  17. Vakumlama olmadan, SA-PE reaktif 25 µL doğrudan her şey için ekleyin. Hiçbir seyreltme reaktif gereklidir.
  18. Taze plaka mühürleyen ile plaka mühür. Alüminyum folyo ile ters plaka kapak dahil olmak üzere tüm plaka sarın.
  19. Plaka üzerinde bir plaka shaker yerleştirin ve yaklaşık 500 RPM, oda sıcaklığında 30 dakika çalkalanır.
  20. Adım işlemini tekrarlayın yukarıdaki 5.13.
  21. Eklemek 200 µL 1 x yıkama arabellek her şey. 1 dk. bir plaka shaker üstündeki yeniden askıya
  22. Bir çok kanallı damlalıklı kullanarak, örnekleri örnekleri üzerinde bir Akış Sitometresi okumak için FACS tüpler için filtre plaka transfer.
    Not: Numune hacmi 200 µL için 300 µL çalışan kuru örnek önlemek için her tüp bir ekstra 100 µL yıkama arabellek x 1 ekleyerek artırılabilir. Gerekli örnekleri, depolanmış olabilir Eğer 4 ° C ışıktan korunan ve ertesi gün analiz. Ancak, uzun süreli örnek depolama için düşük sinyal açabilir.

6. Akış Sitometresi kurulum

Not: güvenilir veri oluşturmak için Akış Sitometresi düzgün veri toplama önce ayarlanmış olması gerekir. Bu işlem bazı açısından belirli enstrüman tahlil gerçekleştirilir yapılandırmasına bağlı olarak tek tek kullanıcılar için değişiklik gösterir. Genelleştirilmiş kurulum işlemi bir sitometresi PE ve APC ölçmek mümkün ve her ikisi ile donatılmış için 488 ve 633 nm lazer aşağıda ele.

  1. Üretici göre Akış Sitometresi ve satın alma yazılım başlatmak ' araç ile sağlanan s yönergeleri.
  2. Oluşturma bir nokta komplo FSC (ileri dağılım) x ekseni ve y ekseni için SSC (yan dağılım) ile. Doğrusal modu için FSC ve SSC ayarlayın.
  3. İkinci bir nokta çizim için y ekseni PE x ekseni ve APC ile oluşturma. Bu arsa bir günlük tabanlı görüntü moduna ayarlanmalıdır.
  4. Girdap ham boncuk kiti 30 dahil şişe s boncuk yeniden askıya alma. Bu boncuklar ve dahili bir APC boya içeren iki boyutu nüfus oluşmaktadır.
  5. Yeni bir FACS tüp için ham boncuk transfer 400 µL.
  6. Akış Sitometresi debisi düşük ayarla.
  7. Her iki boyutu nüfus bu boncuk gözle görülür ayrılmış ve kapı kolay olması dikkatli bir şekilde kazanç ve gerilim FSC ve SSC için ayarlama ham boncuk çalıştırın.
  8. İstenmeyen olaylar (Yani enkaz veya hava kabarcıkları) dışlamak için FSC eşik ayarlayın.
  9. İçinde FSC vs SSC arsa, tüm boncuk örneğin alınma olasılığını içerir bir kapı çizin.
    Not: Ham boncuk boncuk, iki boyutu nüfus içeren küçük " bir boncuk " ve büyük " B boncuk " bölgeler.
  10. FSC SSC arsa geçişli boncuk gruplarından PE x ekseni ve APC ile ikinci nokta arsa üzerinde görüntülemek için y ekseni.
  11. Tüm nüfus boncuk için 1 x 10 1 ve 5 x 10 3 arasında yatıyor medyan floresan yoğunluğu (MFI) APC sinyal var APC Floresans kanal için Devresel_ödeme gerilim ayarlayın.
  12. Girdap PE kurulum şişe için 30 boncuk boncuk yeniden askıya için s.
  13. Transfer 400 µL PE boncuk yeni bir FACS tüp.
  14. Ham boncuk tüp üzerinden akış sitometresi PE ile değiştir boncuk tüp.
  15. Ayarlamak photomultiplier tüp (PMT) gerilim MFI PE boncuk bulunan çok özel Aralık arasında düşer sağlamak için PE Floresans kanal ayarı PE boncuk şişe üzerinde listelenen için.
    Not: PE kurulum boncuk boncuk bir popülasyon boyutu içeren (" bir boncuk " sadece).

7. Veri toplama

Not: veri belirli bir cihazda edinimi ile ilgili tam yordamlar değişebilir ve sitometresi üzerinde bağımlı olan ' s yapılandırma özellikleri ve kullanılan arabirim yazılımı. Aşağıdaki talimatlar bu nedenle assay olarak istihdam sitometresi ne olursa olsun tahlil alınması için gereken adımlar vurgulamak için tasarlanmıştır.

  1. Sitometresi akış hızı hala olarak doğrulayın düşük.
  2. Yaklaşık 300 başına analit için elde edilebilir için boncuk olayların sayısını ayarlayın. 13-plex için bu eşittir 3900 olaylar elde etmek paneli birlikte her iki Boncuk boyutu gruplarından (A + B boncuklar).
  3. Girdap her örnek için 5 s analiz önce.
  4. Okunur örnekleri. Örnekleri okurken, Akış Sitometresi kurulum ilk modunda ve boncuk nüfus satın alma moduna geçmeden önce stabil kadar bekleyin.
  5. Basit ardışık veri dosyaları için numaralandırma ile veri çözümlemesini kolaylaştıran etmek için kullanın.
  6. Yalnızca (A + B boncuk bölgeler) geçişli olaylar yerine tüm olaylar ihracat.
  7. Tüm FCS dosyalarını her tahlil için aynı klasörde depolar. Birden çok testleri çalıştıran, her tahlil için ayrı bir klasör oluşturun.
< p sınıfı"jove_title" = > 8. Veri analizi için devam

Not: Akış Sitometresi üretilen FCS dosyaları-var analiz ücretsiz 14-ebilmek var olmak downloaded veri analiz yazılımı kullanarak.

  1. Veri analiz yazılımı install üstünde PC.
  2. Tüm tahlil FCS dosyaları analiz yazılımı içeren bilgisayara aktarmak.
  3. Belgili tanımlık ruhsat anahtar dongle (kit ile birlikte) bir bilgisayarın USB bağlantı noktasına takın.
  4. Veri analiz yazılımı başlatmak.
  5. Mavi tıklatın " dosyaları ekle " düğmesini ekranın üst kısmında bulunan.
  6. Görünür pencere açılır tahlil FCS dosyaları içeren klasöre gidin.
  7. Tıklayın ve tüm tahlil FCS dosyaları pencere açılır yazılım görüntüye sürükleyin. Tüm dosyaları şimdi bir listesinde görüntülenmesi gerekir.
  8. 'I tıklatın yeşil " sonraki " ekranın sağ alt düğmesini. Sol tıklatın ve küçük sürüklemek için basılı tutun mavi standart eğri standart eğri tanımlamak için listeden ilgili FCS dosyalarına (C7 C0) düğmeleri.
  9. Yeşil tıklatın " sonraki " pencere gating açılır açmak için ekranın sağ alt düğmesini.
  10. Gating penceresinin sol tarafında her iki a girin ve B boncuk bölgeleri tahlil analit hedefleri ve onların ilişkili boncuk ID (tahlil ile sağlanan elle kurmak) artan sırada.
  11. Pencere açılır tepesinden gating aracını seçin ve FSC SSC arsa içinde 2 geçitleri, A boncuk etrafında bir ve ikinci B boncuk etrafında çizmek için kullanın.
  12. APC vs scatter araziler görünür FSC SSC arsa görünen PE gözden geçirin. A boncuk (sol çizgi) 6 analit bantlarında ve B boncuk (doğru çizgi) 7 analit bantlarında olacak.
    Not: Gates el ile üst Silgi aracını seçip belirli bir kapı silmek için tıklatarak çizilmesi. Perdeleme aracı daha sonra seçili olabilir ve el ile bir kapı istenen bant bölgeye uygulamak için kullanılan.
  13. Yeşil tıklatın " Tamam " pencere gating açılır kapatmak ve FCS dosyalar listesine dönmek için düğmeyi.
  14. Tanımlamak için biyolojik örnek belirli bir dosya tıklayarak, seçerek sağ tarafından yapılan herhangi bir dilutions " seyreltme kat " menü ve giriş doğru değeri.
  15. Yeşil tıklatın " çalıştırmak " tahlil için standart eğriler oluşturmak ve bilinmeyen biyolojik örnekler konsantrasyonları hesaplamak için ekranın sağ alt düğmesini.

Representative Results

Bu iletişim kuralı bir immunoassay boncuk tabanlı platform Akış Sitometresi kullanarak biyolojik örnekleri profillerden sitokin aynı anda quantitate için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Tahlil biçimi de serum veya plazma numuneleri ile kullanmak için doğrulandı, ancak bu örnekte kullanılan biyolojik örnekler hücre kültür supernatants daha önce çeşitli aktive koşullarda inkübe fare splenocytes gelen vardı.

Tahlil oluşturulan veri çoğaltılmış panelindeki bütün analitler için standart eğriler oluşturmak için kullanılır. Veri analiz yazılımı bir benzersiz Boncuk boyutu ve APC yoğunluk dayalı belirli her analit sınıflandırır ve PE muhabir kullanarak quantifies. Dinamik aralıkları yanı sıra tahlil duyarlılığını çizilen şekil 2Abir günlük günlük ölçekte zaman gösterdi. Yazılım tahlil veri kullanır ve doğru bir şekilde sadece kullanıcı analitler konsantrasyonları hesaplamak için bir 5-parametre eğri uydurma algoritması biyolojik örnekler aynı zamanda algılama sınırları sağlanan her iki yüksek ve düşük üstünde son-in tüm standart eğrileri (Tablo 1 ). Bu protokol için açıklanan biçimi aynı zamanda son derece sağlam tahlil hassas sağlar. Şekil 2B ve 2 C veri her analit Intra-tahlil değişkenlik gösteren sunulmaktadır. İki ayrı standart protein konsantrasyonları (yüksek ve düşük) ile 16 çoğaltır her örnek için bir tahlil analiz edildi. Şekil 2C ve 2D hedef analitler arası tahlil değişkenliği üç bağımsız deneyleri temsil eder. Intra-tahlil hassas deneyler ile yüksek ve düşük standart konsantrasyonları 3 ile analiz edildi gibi her bağımsız deneyler çoğaltır. Hedef proteinlerin hesaplanan konsantrasyon en az değişkenlik açıkça görülmeye başlıyor.

Sitokin ifade profilleri sorguya içinde boncuk tabanlı sitometrik deneyleri programı göstermek için fare splenocytes çeşitli aktive koşullar altında inkübe. Unstimulated bir kontrol ek olarak, hücreleri de LPS, anti-CD3/anti-CD28 antikorlar, veya phorbol 12-myristate 13-asetat ve ionomycin ile inkübe. Hücre kültür supernatants 48 saat sonra ve fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak bölümü toplanmıştır. Bu deney miktar sonuçlarından şekil 3 ' te gösterilir ve sitokin konsantrasyonları stimülasyon koşulları etkisi açıkça belirlendi.

Sürece deneyci iyi laboratuar tekniği vardır ve sağlanan tahlil iletişim kuralı izler yukarıda açıklanan sonuçlar tipiktir. Bu tahlil biçiminde hata kaynakları sapmalar kuluçka zamanlarda, yıkama, reaktif birimleri veya yanlış Devresel_ödeme ayarları örnekleri analiz etmek için kullanılan Akış Sitometresi ortaya çıkabilir. Şekil 4A bir dağılım komplo başarılı bir tahlil dan açıkça tanımlanan 2 ayrı boncuk nüfus gösterir. Bu rakam 4Bnerede zavallı çamaşır ve protokol bağlılık yol açmıştır bu iki popülasyonun bulanıklık boncuk toplamları için contrasted olabilir. Buna ek olarak, sol alt çeyrekte enkaz kanıtladığı gibi toplam sitometresi olayları analiz için tercih edilen biçim olduğu geçişli olaylar sadece yerine verildi. Uygun sitometresi kurmak güvenilir veri bu tahlil oluşturmak için önemlidir. Şekil 4 c uygun Devresel_ödeme her biri 6 analitlerin APC sınıflandırma kanaldaki çözümlenmesi için ayarlar sağlar. Yanlış Devresel_ödeme ayarları APC kanal boncuk nüfus ile örtüşen sınıflandırma yoğunluklarda bulunduğu şekil 4 d sunulan benzer veri neden olur. Analitin konsantrasyonlarının olmadan tahlil boncuk açıkça tanımlanmış örneğin alınma olasılığını hesaplamak imkansız olacağından bu tahlil geçersiz hale gelecektir.

Figure 2
Şekil 2: Standart eğri aralıkları ve tahlil hassas. (A) fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak oluşturulan bir temsilcisi standart eğri. Standart bir eğri ile her tahlil çalıştırmanız gerekir. (B-C) Intra-tahlil hassas. Farklı hedef proteinler (yüksek ve düşük) konsantrasyonları ile iki örnek ile 16 çoğaltır her örnek için bir tahlil analiz edildi. Verileri ortalama + standart sapma temsil edilir. (D-E) Arası tahlil hassas. Farklı hedef proteinler (yüksek ve düşük) konsantrasyonları ile iki örnek üç bağımsız deneyleri her örnek için 3 çoğaltır ile analiz edildi. Verileri ortalama + standart sapma temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: miktar temsilcisi sonuçlarının. Fare splenocytes (1 x 106 hücreler) 37 ° C + %5 CO2 çeşitli koşullarda kültürlü: unstimulated, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/plaka kaplı mL) + αCD28 (1 µg/mL çözünür), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kültür supernatants 48 saat sonra toplanmıştır sonra fare T yardımcı sitokin panelini kullanarak sayılabilir. Fark sitokin ifade profilleri yanıt olarak uyarılması koşulları açıkça görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: sonuç başarılı başarısız deneyleri vs den. (A) başarılı deneyleri ayrı boncuk nüfus microsphere nüfus için olacaktır. (B) başarısız deneyleri yoksul nüfus ayırma, boncuk toplamları ve çok fazla toplanan olayların olacaktır. (C) başarılı deneyleri açıkça kapı ve ölçmek kolay sınıflandırma Floresans kanalda yoğunluklarda tanımlamaktadır. (D) başarısız deneyleri kötü ayrılmış ve birden çok boncuk nüfus miktar zorlaştırır, üst üste sınıflandırma yoğunluklarda. Bu hataların pek çok dikkatli bağlılık tahlil protokolü ile önlenebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Standart eğri Hassasiyet (pg/mL)
Analit Uygun formül CV R2 Min. Max.
IFN γ 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) %1.77 0,99 2.1 18105.0
IL-5 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) %1,32 1 1.9 14514.0
TNF-α 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) %1.48 0,99 1.9 20109.0
IL-2 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) %1.34 1 1.9 25109.0
IL-6 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)
TD>1.70% 0,99 2.0 7022.0 IL-4 5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36) %1,36 1 2.0 13273.0 IL-10 5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61) %1.81 0,99 2.2 5190.0 IL-9 5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45) %1,82 1 1.9 12602.0 IL-17A 5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32) %0.99 1 2.0 12285.0 IL-17F 5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34) %0.92 1 2.0 14841.0 IL-21 5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11) %0,79 1 9.0 12943.0 IL-22 5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39) %1,16 1 2.0 6408.0 IL-13 5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45) %1.11 1 2.1 16728.0

Tablo 1: Standart eğri uydurma ve tahlil duyarlılık. Veri analiz yazılımı multiplex tahlil içinde bulunan bütün analitler için standart eğriler oluşturmak için kullanılmıştır. Bu tam otomatik analizi algoritması tahlil seyreltme serisi standartlara uygun sağlam bir 5-parametre eğrisi uygular ve ayrıca tahlil hassasiyeti algılama teorik sınırlarını kullanarak tanımlamak için kullanıldı.

Discussion

Bu protokol için tahlil biçimde deneyci sağlanan biyolojik örnek profillerinde çözünür arabulucu sağlam miktar için önerilen bir protokoldür aynılarını ve iyi laboratuar tekniği vardır sağlar.

Güvenilir sonuçlar sağlamak için takip edilmesi gereken birkaç temel adım vardır. İlk olarak, rekombinant standartları tahlil arabellek önerilen tam zamanlı ve sonra sadece polipropilen tüplerde seyreltilmiş reconstitute için izin gerekir. Polistren tüpler proteinler bağlılığı düşük sinyalleri için standart eğri oluşturma sırasında neden olabilir tüpler, duvarına yükseltebilirsiniz. İkinci, doğru sallayarak kuluçka adımları sırasında önemlidir. Uygun ajitasyon tahlil boncuk bağlama özellikleri ciddi engel. Buna ek olarak, kuluçka adımlar arasında uygun yıkama da gereklidir. Deneyci aşırı reaktifler kuyulardan protokol sonraki adımda başlıyor önce kaldırılır emin olmalısınız. Aletleri ayarları tahlil boncuk sorguya çekmek için kullanılan Akış Sitometresi için de optimize edilmiş olması gerekir. Özellikle, devresel_ödeme ayarları uygun boncuk ayrılık ve geniş dinamik aralığı standart Eğriler için emin olmak için ayarlanması gerekir. Son olarak, sadece üzerinde sitometresi önce analiz ediliyor, boncuk vortexed uygun süspansiyon sigorta ettirmeleri ve sonuçları çarpık toplamları oluşumunu önlemek için olmalıdır.

Bu iletişim kuralı, araştırmacı büyük, tam plaka deneyleri gerçekleştirmeden önce onların lizis protokolü en iyi duruma getirmek için istekli olması koşuluyla bu el yazması açıklanan örnek türleri yanı sıra doku homogenates de analiz için potansiyel olarak değiştirilebilir. Gerçek teknik tabii doku türüne bağlı olarak değişir; Ancak, genel olarak protokol iyonik tuzlar fizyolojik konsantrasyonları, denaturing hiçbir kimyasal madde ve tercihen hiç deterjanlar içeren bir nötr pH tampon kullanmanız gerekir. Deterjan kullanılmalıdır, non-iyonik deterjan konsantrasyonları (örneğin en fazla % 1) en azından tutulmalıdır. Arabellek aynı hedef proteinlerin proteolitik yıkımı önlemek için yeterli proteaz inhibitörleri içermelidir. Kullanılan lizis protokole bakılmaksızın son hazırlıklar tanecikleri analiz önce kaldırmak için centrifuged.

Tahlil ile ilgili sınırlamalar, biyolojik örnek türleri analit hedefleri konsantrasyonları büyük ölçüde değişebilir. Düzgün analitin konsantrasyonlarının ölçmek için onlar için standart eğri üst ve alt değerleri içinde olmalıdır. Değerleri eğrinin ekstrapolasyon mutlaka güvenilir değildir ve tavsiye etmiyorum. Araştırmacılar bu nedenle onların belirli örnekler tam plaka tahlil çalıştırmadan önce pilot deneylerde dilutions optimize etmek gerekir. Buna ek olarak, denetlesinler biyolojik örnekler dikkatli hazırlanması bu tahlil biçim başarısı için her şeyden önemlidir. Numunelerde olan, hemolyzed veya protein enkaz içeren örneklerini bu immunoassay temel prensibi tanımlamak antijen antikor etkileşimleri etkiler ve uninterpretable sonuçlar işlemek.

Bu tahlil çeşitli nedenlerden dolayı mevcut miktar yöntemler açısından önemlidir. Düzgün çalıştırdığınızda, tahlil biçim geleneksel ELISA testleri kullanarak örnek analiz etmek için gerekli olacağını daha çok küçük birimleri kullanarak bir örnek üzerinden en fazla 13 analitler quantitate. Bu tahlil biçimi de özel araçları gerçekleştirilmesi için gerek yoktur. Bu tahlil pek çok yaygın olarak kullanılan akış cytometers kullanarak çalıştırılabilir olarak piyasada bulunan diğer boncuk tabanlı uzun karşılaştırıldığında bir avantajdır.

Bilimsel araştırma rolüne salgılanan faktörler ve sitokin tarafından sağlık ağlarda oynadı ve hastalık genişletiyor. Bu el yazması tahlil biçimde bu çok yönlü ve karmaşık olayları anlamak isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olabilir. Etkin Biyomedikal Araştırma programları sitokin ağları sadece gibi Genelleştirilmiş alanları iltihabı6rolü, aynı zamanda belirli hastalık durumlarında ateroskleroz, kanser ve neuroinflammation gibi içinde bağlamında keşfetmeye başlıyor 15,16,17. Hiç şüphesiz, soruşturma bu kronik koşulları tedavi etmek yeni tedavi için arama genişledikçe bu alanlarda büyümeye devam edecektir. Doğru ve güvenilir miktar bu hastalıklar ile ilişkili çözünür arabulucu ihtiyacını bir kritik araştırma öncelik olmaya devam edecektir.

Disclosures

Yazarlar bu el yazması açıklanan Kimyasalları üreten BioLegend tarafından istihdam edilmektedir. Vigene teknoloji, Inc. bu el yazması açıklanan tahlil üretilen verileri çözümlemek için kullanılan LEGENDplex veri analiz yazılımı geliştirdi.

Acknowledgments

Yazarlar Biyomarkörler ve IMMUNO-deneyleri katkıları kabul etmek istiyorum ürün geliştirme ekibi tahlil gelişimi için. Buna ek olarak, Vigene teknoloji, Inc veri analizi yazılım paketleri tasarlama ortak çabaları için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor Beckman Coulter 366816 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel BioLegend 740005 Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format
Anti-mouse CD28 antibody BioLegend 102112 Clone 37.51, low endotoxin, azide free format
Vacuum Pump EMD Millipore WP6111560 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Vacuum Manifold EMD Millipore MSVMHTS00 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher Scientific 07-200-130 Or equivalent
Polypropylene MicroFACS Tubes Fisher Scientific 11-842-90 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
Pipette Kit Fisher Scientific 14-388-100 Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL)
Multi-Channel Pipette Fisher Scientific FA10011G capable of dispensing 5 μL to 200 μL
Microplate Shaker Fisher Scientific 88880023 Or equivalent
Microcentrifuge Fisher Scientific 75002410 Or equivalent
FACS tubes Fisher Scientific NC9885747 12 x 75 mm round bottom
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma-Aldrich L-8274 Escherichia coli O26:B6
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Branson B200 Ultrasonic Cleaner Sigma-Aldrich Z305359 Or equivalent
Microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505 1.5 mL polypropylene tubes
Flow Cytometer Various Various Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm
96-Well Polypropylene Plate VWR 82050-662 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
  2. Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
  3. Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
  4. Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
  5. Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. 3064643 (2016).
  6. Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
  7. Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
  8. Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
  9. Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
  10. Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
  11. Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
  12. Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
  13. Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
  14. LEGENDplex Multiplex Assays. Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
  15. Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
  16. West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
  17. Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
Multiplex sitokin Immunoassay sitometrik boncuk tabanlı platformu kullanarak uyarılmış fare Splenocytes profil oluşturma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).More

Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter