Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес Лептоспире interrogans Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Здесь мы опишем технику, которая сочетает в себе transposon мутагенеза с высокой пропускной способностью последовательности для идентификации и количественной оценки transposon leptospiral мутантов в тканях после вызова хомяков. Этот протокол может использоваться для экрана мутантов для выживания и распространения в животных и могут также применяться к в vitro исследования.

Abstract

В этой рукописи мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) техника для идентификации и количественной оценки Лептоспире interrogans мутантов, изменены в фитнес во время инфекции Золотой сирийских хомяков. TN-Seq сочетает в себе случайных transposon мутагенеза с силой высокопроизводительного секвенирования технологии. Животных сталкиваются с бассейном transposon мутантов (ввода бассейн), следуют заготовки крови и тканей через несколько дней позже определить и подсчитать количество мутантов в каждом органе (вывода бассейны). Бассейны вывода по сравнению с ввода бассейна оценить фитнес в естественных условиях каждого мутант. Этот подход позволяет скрининг большого пула мутантов в ограниченное количество животных. С незначительными изменениями этот протокол может выполняться с любого животного модель лептоспироза, водохранилище принимающей таких крыс и острой инфекции модели таких хомячков, а также в vitro исследования. TN-Seq обеспечивает мощный инструмент для экрана для мутантов с дефектами фитнес в vivo и in vitro .

Introduction

Идентификация генов вирулентности для некоторых бактерий, таких как Leptospira spp., затруднено из-за ограниченного числа генетических инструментов, доступных. Один из часто используемых подходов является создание коллекции мутантов, случайных transposon мутагенеза, следуют идентификации включение сайта в каждом мутант и вирулентности тестирование отдельных transposon мутантов в животной модели. Этот подход является длительным, дорогостоящим и требует большое количество животных.

При случайных мутагенеза была впервые разработана для патогена Лептоспире interrogans, генов, участвующих в вирулентности были определены путем тестирования отдельных мутантов в животной модели1. Мутанты были отобраны на основе таких критериев, как их потенциальной роли в сигнализации подвижности или их предсказал внешней мембраны или поверхности местоположение. Как и большинство leptospiral гены кодируют гипотетических белки неизвестной функции2, выбрав мутантов основанный на эти критерии ограничения возможность обнаружения генов вирулентности Роман leptospiral.

Совсем недавно бассейны л interrogans transposon мутантов были экранированы для инфективности в хомяк и мыши модели3. Каждое животное было оспорено с бассейном до 10 мутантов. Инфективности мутант был забит как положительным, если он был обнаружен методом ПЦР культур, полученных из крови и почек. PCR тестирования был трудоемким, потому что он требует индивидуальной реакции PCR для каждого мутант в бассейне. Потому что частота каждого мутант в культурах количественно не оценивалась, подход был предвзято к идентификации весьма ослабленный мутантов.

Мы описываем transposon виртуализации (Tn-Seq) технику, как стратегия более эффективно экран для генов вирулентности. TN-seq состоит из создания библиотеки мутантов transposon мутагенеза, следуют массивной параллельной последовательности4,5,6. Кратко transposon мутантов пуле, привитых животных и впоследствии оправился от различных органов (вывода бассейны). ДНК из пулов вывода извлечены и переваривается с энзимами ограничения или стриженый sonication. Два раунда ПЦР ориентации развязок transposon вставки сайтов выполняются. Этот шаг позволяет адаптеров, необходимые для последовательности. Результате продукты PCR анализируются высокопроизводительного секвенирования для выявления transposon вставки сайт каждого мутант бассейна наряду с их относительного изобилия, который сравнивается с первоначальный состав пула мутант.

Основным преимуществом этого подхода является возможность одновременно экран большое количество мутантов с небольшое количество животных. TN-Seq не требует предварительных знаний о transposon вставки сайты, что увеличивает шансы выявления новых Leptospira-специфических генов, участвующих в вирулентности с меньше времени и повышения эффективности. Поскольку бремя leptospiral в тканях является относительно высоким в грызун модели восприимчивы к смертельной инфекции (обычно 104 108 бактерий/g ткани)7,8,9 , также как и хозяева водохранилище 10,11, тканей могут быть проанализированы непосредственно, без необходимости культуры, снижения отклонений вследствие роста в пробирке .

В большинство бактериальных патогенов, описанные на сегодняшний день исследований, Tn-Seq высокая частота инсерционному мутагенезу допускается инфекции с большими бассейнами, содержащие мутантов вместе с нескольких близко расположенных transposon вставок в каждый ген4 ,12,,1314. TN-Seq была также разработана для бактерий, для которого мутагенеза частота является намного ниже6. С Leptospiraбиблиотека transposon мутантов могут создаваться путем введения transposon на мобилизационный плазмиды путем конъюгации, как описано в Slamti et al15. Однако частота transposon мутагенеза л interrogans является низким. Когда Himar1 transposon была введена на сопряженных плазмида, частота transconjugant сообщается только 8,5 x 10-8 для каждого получателя ячейки с Лай штамм L. interrogans16 и, вероятно, будет Аналогичным образом бедных с большинства других штаммов L. interrogans. В части, на основе, которая разработана для Borrelia burgdorferi, в котором частота transposon инсерционному мутагенезу является также низкая6протокол, описанных здесь.

Для нашего эксперимента с протоколом17мы провели transposon мутагенеза с л interrogans серовар штамм Manilae L495 из-за успеха других групп в Изолирующие вставки мутантов transposon в штамм наряду с его низкой LD50 (летальная доза) для вирулентности1. Мы экранированный 42 мутантов, Tn-Seq и определили несколько мутантов кандидатов дефектных в вирулентности, включая два с вставками в гене Аденилатциклаза кандидата. Индивидуальные испытания двух мутантов в хомяков подтвердил, что они являются несовершенными в вирулентности17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Предупреждение: Патогенные штаммы Leptospira spp. должны быть обработаны согласно процедурам включения 2-го уровня биобезопасности (BSL-2). Необходимо носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). Класс II биобезопасности кабинета должны использоваться для всех манипуляций патогенных Leptospira spp.

1. Создание Transposon мутант библиотеки15

  1. Перевод transposon в spp Лептоспире . путем конъюгации (Рисунок 1)
    1. Прививать тома экспоненциальной фазе культуры патогенного Leptospira spp., соответствующий 107 клеток в 10 мл Ellinghausen-Маккалоу-Джонсон-Харрис среднего (EMJH)18,19. Инкубируйте на 30 ° C с 150 об/мин, тряски до тех пор, пока плотность достигает 2-8 x 108 клеток/мл.
      Примечание: Время удвоения патогенных leptospires является 12-24 ч, в зависимости от штамма.
    2. Прививать 50 мкл доноров штамм кишечной палочки β216320 , перевозящих мобилизационный transposon плазмиды (pCjTKS2)16 в 5 мл Лурия бульон (LB), дополнены 0,3 мм 2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 мкг/мл канамицин (км) и 50 мкг/мл спектиномицин (Spc) и место на ночь в инкубатора 37 ° C на 255 об/мин.
    3. Прививать 60 мкл клеток кишечной палочки в 3 мл EMJH, дополненный 0,3 мм DAP (EMJH + DAP). Инкубируйте при 37 ° C на 255 об/мин агитации за 3-4 ч до600nm≈ OD 0.3.
    4. Для сборки фильтрующего блока (рис. 1), поместите основание на стороне 125 мл-рука колбу Эрленмейера, позиция фильтр ацетат целлюлозы (размер пор 0,1 мм; диаметр 25 мм) на базе и зажим воронку на базу. Подключите блок фильтрации к вакуумной системой.
    5. Добавьте 5 мл LeptospiraСПП. Культура и 0,5 мл культуры е. coli в воронку. Пылесосом жидкости через фильтр.
    6. Передача фильтр с поверхности бактерий вверх на EMJH + DAPplate. Инкубируйте на 30 ° C ночь с фильтром, обращенной вверх.
    7. Установите фильтр в 15 мл трубку, содержащие 1 мл EMJH и вихревые для 10 s выпустить бактерий в средствах массовой информации. Распространение 200 мкл суспензии на 5 EMJH platescontaining 50 мкг/мл км с использованием 10-15 1 мм стерильные стеклянные бусы или стерильные одноразовые разбрасывателя. Оберните пластины с парафина и инкубировать их вниз головой в 30 ° C для 3-4 недели до колоний видны.
    8. Перевести колонии индивидуально в 3 мл EMJH, содержащих 50 мкг/мл (EMJH + км) при 30° C под 150 об/мин агитации за 7-10 дней до тех пор, пока культура достигает плотность ≈10/8мл.
      Примечание: Культур может храниться при температуре-80 ° C или в жидком азоте (с 4% глицерина).
  2. Идентификация сайта вставки transposon вложенных ПЦР (Рисунок 2)
    1. Лизируйте 50 мкл каждого transposon мутант в пробирках, ПЦР по инкубации на 95 ° C в течение 15 мин.
      Примечание: ДНК могут быть очищены, с помощью комплекта экстракции ДНК.
    2. Подготовьте смесь ПЦР с Deg1 и Tnk1 грунты (Таблица 3) согласно таблице 1. Передача 23.7 мкл смеси в каждую ПЦР-пробирку и 1.3 мкл лизированных клетках. Запустить программу: 95° C за 5 мин; 40 циклов: 95 ° C 15 s, 40 ° C за 1 мин., 72 ° C на 2 мин; 72 ° C для 10 мин.
    3. Сделайте смесь ПЦР с тегом и TnkN1 грунты (Таблица 3) согласно таблице 2. Передача 24.2 мкл смеси в каждую ПЦР-пробирку и 0,8 мкл реакции PCR #1. Запустить программу: 95 ° C за 5 мин; 35 циклов: 95 ° C 15 s, 55 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин; 72 ° C для 10 мин.
    4. Запуск 3 мкл продуктов ПЦР на геле агарозы 1% с 1 X трис-ацетат-ЭДТА (ТЭ) буфера на 10-15 V/см (рис. 2B).
    5. Очищайте продукты PCR положительных образцов, используя комплект для очистки ПЦР. Элюировать ДНК с низким объемом комплект разрешено максимальной концентрации ДНК выздоровел.
    6. Отправьте очищенных продуктов ПЦР для Сэнгер виртуализации с помощью TnkN1 грунт (Таблица 3).
    7. Определите места вставки путем сравнения результирующая последовательность с родительский сорт генома BLASTN анализа (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) или с помощью базы данных (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) SpiroScope21.
    8. Подтвердите включение сайта transposon методом ПЦР с праймерами, отжиг Фланкируя последовательности узлов.
      Примечание: Transposon увеличивает размер одичал тип последовательности на ≈ 2 КБ.

2. животных эксперимент (рис. 3)

  1. Культура Leptospira мутантов
    1. Растут индивидуально каждой выбранной transposon мутант в 10 мл EMJH + км при 30 ° C на 150 об/мин агитации плотность 107-108 leptospires/мл.
    2. Граф leptospires, Микроскопия темного поля с Petroff-Хауссер счетчиком или как описано Миллер23.
    3. Разбавьте каждой культуры в EMJH же плотности, например 106 клеток/мл.
    4. Чтобы собрать входные бассейн, смешайте разреженных культур в равных объемах.
      Примечание: Включить элементы управления в бассейне ввода путем добавления мутантов с известными фитнес такие дефекты, как loa2217,24 и мутанты с неизменным фитнес например ligB17,25, соответственно. Бассейны мутанты могут храниться с глицерина 4% при температуре-80 ° C или в жидком азоте.
  2. Вызов
    Примечание: Методы, описанные здесь были утверждены ветеранов дел более Лос-Анджелес институциональных животное уход и использование Комитетом (протокол #09018-14).
    1. Придать внутрибрюшинно 1 мл ввода пула для каждого животного с инсулина шприц U-100 с 26G x ½" иглы.
      Примечание: В эксперимент, 8 животных были оспорены с 1 мл ввода пула, т.е., 106 бактерий всего17. Инфекция было разрешено продолжать следовать за 4 дня до эвтаназии.
    2. Собирать 10 мл ввода бассейна и спина на 20 мин в 3220 x g. тщательно удалить супернатант не нарушая гранулы. Храните клетки гранул на - 80˚с до использования (шаг 3.1.3).
    3. Мониторинг животных ежедневно до тех пор, пока они завершаются в заранее определенной конечной точке. Весят хомяков ежедневно и искать критерии конечной точки: потеря аппетита, походка или дыхание трудности, прострация, трепал мех, или > 10% достигли максимального веса.
  3. В vitro эксперимент
    1. В день задача прививать 3 флаконы по 25 мл EMJH + км с 5 мл ввода бассейна. Расти культур при 30 ° C при агитации 150 об/мин.
    2. Граф leptospires ежедневно с помощью одного из методов раздел 2.1.2. При плотности достигает ≈ 1 x 10-8/мл, спина вниз каждый подвеска для 20 минут, 3220 x g.
    3. Храните клетки окатышей на-80 ° C до использования.
  4. Заготовка и хранение тканей
    1. Усыпить животных при вдыхании изофлюрановая последовали двусторонние торакотомия26.
    2. Немедленно собирайте 1-2 мл крови, сердца пункция с 3 мл шприца и иглы 25 g x 5/8". Передача крови в пробирку, содержащую ЭДТА. Смешайте инверсии, 5-6 раз.
    3. Соберите одной почки и ⅓ ½ брюшной средний лепесток печени в cryotubes.
    4. Магазин тканей при температуре-80 ° C до использования.

3. Строительство геномные библиотеки для высокопроизводительного секвенирования (рис. 4)

  1. Экстракции ДНК
    1. Экстракции ДНК из крови.
      1. Передавать 100 мкл крови от ЭДТА трубы пробки microcentrifuge.
      2. Очищают с помощью комплекта экстракции ДНК ДНК. Следуйте инструкциям производителя.
    2. Экстракции ДНК из тканей.
      1. С помощью скальпеля и ножницы, кости от 50 до 80 мг каждого органа на мелкие кусочки (1 мм x 1 мм) и передачи их в трубку сухой стерильной колпачок. Измерьте Вес ткани с точностью баланса.
      2. Добавьте 500 мкл стерильных PBS в трубу.
      3. Однородности выборок с помощью disruptor за 1 мин на 5 движений в секунду.
      4. Вычислите объем, соответствующий 25 мг тканей, используя следующее уравнение:
        Equation 1
      5. Перевести вычислительного объема в комплект экстракции ДНК. Продолжите с ДНК очистки следуя инструкциям производителя.
    3. Экстракции ДНК от ввода бассейн и в пробирке культур.
      1. Оттепель бактериальных гранул при комнатной температуре 5-10 мин.
      2. Приступайте после инструкции, сопровождающих комплект экстракции ДНК.
    4. Магазин ДНК-80 ° c до использования.
  2. Стрижки ДНК (Рисунок 5)
    1. Передача 50 мкл ДНК на трубу microcentrifuge 1,5 мл.
    2. Место труб в стойку sonicator Кубок рожочка с холодной водой (4 ° C).
    3. Запустите sonicator на 3 мин на 80% интенсивности с 10 s на пульс и 5 s покинуть пульс.
      Предупреждение: Носить наушники или беруши для защиты слуха.
    4. Запуск 2,5 мкл стриженый ДНК на 2% агарозном геле, чтобы подтвердить, что большая часть ДНК является < 600 bp в размер.
  3. Добавление C-хвост
    1. Измерение концентрации ДНК с небольшой объем спектрофотометром.
    2. Рассчитать объем соответствует 500 нг ДНК, используя следующее уравнение:
      Equation 2
    3. Подготовьте хвостохранилище реакции (Таблица 4). Инкубировать 1 час при 37 ° C; Инактивирует на 75 ° C в течение 20 мин.
      Примечание: Для образцов, которые требуют корректировки объема больше чем 14,5 мкл, увеличить окончательный объем реакции на 40 мкл и масштабировать остальных компонентов соответственно.
    4. Экологически чистые образцы с комплектом очистки ПЦР. Элюировать ДНК с 12 мкл буфера.
  4. Вложенные PCR
    1. ПЦР #1
      1. Подготовка смеси ПЦР согласно таблицы 3 и 5. Передавать каждую ПЦР-пробирку 22 мкл, комплекса библиотека и 3 мкл очищенная ДНК. Аналогичным образом приступайте к структуре управления.
        Примечание: Праймер TnkN317 специфичные для transposon и грунтовка olj3766 для C-хвост. Сочетание управления хватает TnkN3 грунт, которая специально ориентирована на transposon.
      2. Запустите следующую программу: 95 ° C на 2 мин; 24 циклов: 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин; 72 ° C на 2 мин.
    2. ПЦР #2.
      1. Подготовьте второй ПЦР смеси согласно таблицы 3 и 6. Передача 49 мкл библиотека смеси в каждую ПЦР-пробирку и 1 мкл реакции PCR #1 библиотеки. Передавать каждую ПЦР-пробирку 24.5 мкл, комплекса управления и 0.5 мкл управления реакции PCR #1.
        Примечание: Праймер pMargent2 для transposon, и праймеры IP6 содержат шесть base пара штрих и специфических последовательностей, признанные платформы виртуализации нового поколения.
      2. Запустите следующую программу: 95 ° C на 2 мин; 18 циклов: 95 ° C за 30 сек, 60 ° C за 30 s, 72 ° C на 2 мин; 72 ° C на 2 мин.
    3. Запуск 3 мкл на 2% гель агарозы. Библиотека должна показать мазок с большинством сигнала между 200 до 600 ВР (рис. 6) и не усилители для управления реакции.
  5. Очистка продуктов PCR.
    Примечание: Очистите геномные библиотеки с ПЦР очистки комплект следуя инструкциям производителя. Элюировать ДНК с 30 мкл буфера.
  6. Измерение концентрации ДНК с помощью флуориметр. В среднем 2-3 читает.
  7. Рассчитайте объем каждой библиотеки эквивалент 15 или 20 нг, используя уравнения ниже:
    Equation 3
  8. Смешать все библиотеки вместе предыдущих расчетам. Определение молярной концентрации ДНК с сайта следующие уравнения:
    http://www.molbiol.edu.ru/ENG/Scripts/01_07.HTML
    Предупреждение: ДНК концентрации и объема требования зависят от платформы виртуализации.

4. высокопроизводительного секвенирования и анализ данных

  1. Виртуализация
    1. Последовательности библиотеки как 64 читает один конец bp, используя праймер pMargent3 пользовательские последовательности и стандартных коммерческих последовательность праймера. Платформа виртуализации предоставит вам FastQ файлы с все последовательности чтения.
  2. Анализ с Галактика программного обеспечения
    1. Скачать файл последовательности генома
      1. На домашней странице базы данных SpiroScope (см. шаг 1.2.7 для ссылки), выберите организма, используемые для эксперимента и нажмите кнопку «Нагрузки в ГЕНОМА браузер».
      2. В панели инструментов (в верхней части главной страницы), выберите «Поиск/экспорт > Загрузка данных», в строке «Последовательности (fasta)», нажмите «Геном» скачать последовательности.
      3. Откройте файл в блокноте (PC) или TextEdit (Mac) и переименуйте хромосомы (например «ХПН»). Сохранить в формате fasta.
      4. Выполните те же шаги для загрузки последовательности хромосом II. Объединить обе последовательности хромосом в одном .txt файл путем копирования и вставки.
        Примечание: Хромосома последовательности можно также загрузить на веб-сайте NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) и объединены в единый txt-файл.
    2. Загрузка файлов на сервер галактики
      Примечание: Галактика является открытым исходным кодом, веб-платформа для управления данных интенсивного биоинформатики процессы27,28,29,30 и могут быть доступны на https://usegalaxy.org/.
      1. В меню Сервис, выберите пункт «получить данные > Загрузить файл с вашего компьютера». Перетащите и падение .fastq файлы, генерируемые платформы виртуализации в окно, а затем нажмите кнопку «Пуск».
      2. Выполните те же шаги, чтобы загрузить файл .txt последовательности генома Leptospira .
    3. Жених считывает
      1. Выберите «NGS: QC и манипуляции > FASTQ грумер» из меню Сервис.
      2. Рядом с файлом для жениха, выберите библиотеки загружены на шаге 4.2.2. В тип оценки качества ввода FASTQ выберите систему соответствующей последовательности. Дополнительно оставьте скрыть расширенный управления выбран.
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    4. Удаление последовательности артефактов
      1. Выберите «NGS: QC и манипуляции > удалить артефакты последовательности». Рядом с библиотекой для фильтрации выберите ухоженные файлы, созданные в шаге 4.2.3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    5. Удаление последовательности C-хвост
      Примечание: Повторите эти шаги один или два раза, чтобы обеспечить все C-хвосты удаляются.
      1. Выберите «NGS: QC и манипуляции > клип адаптер последовательности».
      2. Выберите или введите следующее:
        Библиотека для клипа: выберите файлы, созданные в шаге 4.2.4.
        Длина минимум последовательности: 15
        Источник: введите пользовательские последовательности
        Введите пользовательские отсечения последовательность: CCCCCCC
        Введите ненулевое значение, чтобы адаптер последовательности и x баз, которые следуют за ней: 0
        Отменить последовательности с неизвестным баз (N): Да
        Параметры вывода: выходной последовательности подстриженные и не обрезан
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    6. Удалите адаптер последовательности
      1. Выберите «NGS: QC и манипуляции > клип адаптер последовательности».
      2. Выберите или введите следующее:
      3. Библиотека для клипа: выберите файлы, созданные на шаге 4.2.5.
      4. Длина минимум последовательности: 15
      5. Источник: введите пользовательские последовательности
      6. Введите пользовательские отсечения последовательность: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Введите ненулевое значение, чтобы адаптер последовательности и x баз, которые следуют за ней: 0
      8. Отменить последовательности с неизвестным баз (N): Да
      9. Параметры вывода: выходной последовательности подстриженные и не обрезан
      10. Нажмите кнопку «Выполнить».
    7. Читает фильтр, основанный на их качество
      1. Выберите «NGS: QC и манипуляции > фильтр по качеству».
        Примечание: Этот инструмент выбирается читает, основанные на показатели качества.
      2. Выберите следующее:
        Библиотека для фильтрации: выберите файлы, созданные в шаге 4.2.6.
        Порогового значения качества: 20
        Процент баз в последовательности, который должен иметь качество равный к/выше порогового значения: 95
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
        Примечание: С этими параметрами, отбрасываются читает короче, чем 20 нуклеотидов или показатель качества 20 или менее 95% циклов. Адаптировать параметры жесткости для вашего эксперимента.
    8. Карта32 чтений
      1. Выберите «NGS: сопоставление > Bowtie2»32.
      2. В полях в главном окне выберите следующее:
        Это одно- или парные библиотека: один конец
        FASTQ файла: выберите Библиотека, отфильтрованные по качеству от шага 4.2.7.
        Написать невыровненных (в формате fastq) читает отделить файл(ы): нет
        Запись выровненных (в формате fastq) читает для разделения файлов: нет
        Вы выберите ссылку генома из вашей истории или использовать встроенный индекс?: использовать генома из истории и построить индекс
        Выберите ссылку генома: выберите Лептоспире genome.txt файл загружен в шаге 4.2.2.
        Набор групп сведения?: не установлен
        Режим выбора анализа: 1: только настройки по умолчанию
        Вы хотите использовать Пресеты?: нет, просто используйте значения по умолчанию
        Сохранить bowtie2 сопоставления статистики в истории: нет
        Работа параметров ресурсов: используйте параметры ресурсов работу по умолчанию
      3. Нажмите кнопку «Выполнить» для выравнивания читает генома.
    9. Преобразование файлов
      1. Выберите «NGS: SAMtools > BAM BAM-Сэм преобразовать Сэм».
      2. Выберите следующее:
        BAM файла для преобразования: Выберите сопоставленные библиотеки из шага 4.2.8.
        Варианты заголовка: включать заголовок в выходных данных SAM (-h)
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    10. Преобразование файлов
      1. Выберите «NGS: SAMtools > преобразовать Сэм интервала».
      2. Выберите следующее:
        Выберите набор данных для преобразования: выберите файл SAM сопоставленных библиотеки, созданные на шаге 4.2.9.
        Печатать все?: Да
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    11. Сортировка считывает
      1. Выберите «фильтр и сортировка > Сортировка данных по возрастанию или по убыванию».
      2. Выберите следующее:
        Сортировка набора данных: выберите интервал файл, созданный на шаге 4.2.10.
        на столбец: 2
        с ароматом: порядку
        все в: возрастанию
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    12. Выберите читает соответствующий хромосома я
      1. Выберите «фильтр и сортировка > выберите строки, которые соответствуют выражение».
      2. Выберите следующее:
        Выберите линии от: выберите файл с отсортированных читает, созданного на шаге 4.2.11.
        что: согласование
        шаблон: введите имя хромосомы, как определено в шаге 4.2.1.3 (например, «ХПН»).
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    13. Выберите читает соответствующий хромосома II
      Продолжайте следовать шаг 4.2.12.
    14. Группа читает согласно вставки сайты в хромосоме I
      1. Выберите «Join, вычесть и Группа > Группа данных по столбцу и выполнять статистическую операцию по другим столбцам».
      2. Выберите следующее:
        Выберите данные: выберите результирующий файл из шага 4.2.12.
        Группа по столбцу: 2
        Игнорировать регистр при группировке?: нет
        Игнорировать строки, начинающиеся с этих знаков: Ø
        Операция > + операции вставки
        Тип: Фото
        На столбец: 2
        Раунд результат до ближайшего целого числа: нет
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    15. Группа читает согласно вставки сайты в хромосоме II
      Продолжайте следовать шаг 4.2.14.
    16. Сортировка вставки сайты на хромосоме I
      1. Выберите «фильтр и сортировка > Сортировка данных по возрастанию или по убыванию».
      2. Выберите следующее:
        Сортировка набора данных: Выберите файл из шага 4.2.14.
        на столбец: 1
        с ароматом: порядку
        все в: возрастанию
      3. Нажмите кнопку «Выполнить».
    17. Сортировать места вставки на хромосоме II
      Продолжайте следовать шаг 4.2.16.
  3. Статистический анализ
    1. Передача данных Галактика в файлы электронных таблиц, копируя и вставляя два столбца из шагов 4.2.16. и 4.2.17. в файл Excel.
      Примечание: Первый столбец имеет координату нуклеотидов вставки сайт transposon, и второй столбец — это количество операций чтения на каждом сайте вставки.
    2. Идентифицировать ген, укрывательство transposon, используя координату нуклеотидов, приводятся в таблице.
      Примечание: К примеру, transposon, вставляются в нуклеотидной #30718 хромосомы I-расположен в LIC10024 гена, который охватывает нуклеотидов в хромосоме 29263-31539 я.
    3. Вычислите относительные частоты (F) для каждого мутант в каждой ткани и в бассейне ввода после уравнения ниже:
      Equation 4
    4. Рассчитайте коэффициенты входной/выходной (R) для каждого мутант и ткани, используя уравнения ниже:
      Equation 5
    5. Вилкоксон подписали ранг тест
      1. Нормализовать все коэффициенты входной/выходной, установив средний коэффициент для каждой ткани в каждое животное 1.0. В соотношении 1,0 является нейтральным, > 1.0 невыгодно, и < 1.0 является выгодным33.
      2. Сравнение входной/выходной соотношения 1.0 (нейтральный фитнес) с использованием Вилкоксон ранга тест с P значений < 0,05 считается статистически значимым.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Создание библиотеки transposon мутантов в л interrogans путем конъюгации требует фильтрующего блока, как показано на рисунке 1. 100-200 трансконъюгантов мы оправились от каждого спаривания.

Transposon вставки сайт обозначаются в каждом мутант секвенирования продукт PCR, порожденных полу-случайных ПЦР, предназначенного к концу transposon и соседних принимающих последовательностей15 (рис. 2A). Пример результатов полу-случайных ПЦР показано на рисунке 2B. В большинстве случаев будет соблюдаться доминирующей ампликонами, когда грунты Deg1 и Tnk1 используются для первого раунда ПЦР и тег и TnkN1 для второго раунда. Однако, из-за низкой специфичности pentameric последовательности (... N10GATAT-3') 3' концу Deg1 грунт, этот учебник будет отжига в нескольких местах по всему leptospiral геном. Если эти сайты находятся в конце transposon, могут быть получены несколько продуктов PCR. Когда создаются несколько ампликонами, они могут быть вместе очищенного от Смеси ПЦР и виртуализированных непосредственно; Очищение геля каждого ампликон не является необходимым, потому что все они будут содержать ту же последовательность по течению где anneals TnkN1 грунт. С другой стороны ПЦР может произойти сбой, если ближайший копию последовательности, мишенью в грунт Deg1 расположен на большом расстоянии от конца transposon. При обнаружении не продукты PCR, первый раунд полу-случайных ПЦР может повторяться с Deg1 грунт и Tnk2 грунт, которая ориентирована на противоположном конце transposon. В этом случае TnkN2 и тег будет использоваться для второго раунда; Ампликон будет виртуализации с TnkN2 грунт (рис. 2B). Кроме того первый раунд PCR может быть сделано с Deg2 грунтом, чьи 3' конца (... N10TCTT-3') целей-4 - вместо пяти нуклеотидной последовательности. Может использоваться четыре различных набора праймеров для первого раунда ПЦР (ПЦР #1): Tnk1 + Deg1, Tnk1 + Deg2, Tnk2 + Deg1 Tnk2 + Deg2. Когда один набор праймеры не работает, используйте другой набор. Если этот второй набор также завершается неудачей, используйте еще один и так далее. Спонтанное канамицин устойчивостью мутантов очень редки и возникают с частотой < 10-10 - 34.

В ходе подготовки геномной библиотек (рис. 4) может быть проверена пару шагов. Стрижка животных ДНК, sonication должны быть подтверждены электрофорез Алиготе в агарозном геле (рис. 5). Когда ДНК стриженый правильно, фрагменты ДНК, начиная от 200 до 600 ВР будет образуют мазок в 2% агарозном геле. Перед отправкой библиотек для высокопроизводительного секвенирования, поколение продуктов ПЦР на вложенные ПЦР-реакции должны быть подтверждены геля агарозы (рис. 6).

После обработки последовательности читает протоколом, описанные здесь (раздел 4.2.), частота каждого мутант в бассейне ввода и во всех тканях определяется с помощью уравнения в разделе 4.3.3. Входной/выходной коэффициент для каждого мутант в каждой ткани рассчитывается с помощью уравнения в раздел 4.3.4. На рисунке 7 показан пример результатов, полученных с Tn-Seq подходом. Кроме того пурпурный инструмент может использоваться для обработки и анализа данных последовательности 31. Мутанты с статистически значимое уменьшение и увеличение фитнес были определены. Мутации в генах вирулентности известных leptospiral вызвало снижение фитнес, проверка Tn-Seq подход.

Figure 1
Рисунок 1: Фильтрация единица, используемая для сопряжения. Блок фильтрации собран, вставив пробку фильтра поддержки в сторону руку колбу Эрленмейера, позиционирование ацетат целлюлозы фильтр на основание с стерильный пинцет, а затем размещения воронку на базу и обеспечение системы с зажимом . Блок фильтрации затем подключен к вакуумной системе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: определение участков вставки transposon. (A) схемы показаны отжига сайты полу-случайных праймеров PCR. Tnk1 и Tnk2 праймеры обжигают почти противоположных концах transposon (Tn). Deg1 является 35-нуклеотида, содержащий стрейч 10 вырожденный нуклеотидов, последовательность GATAT в конце 3'. Первый раунд ПЦР (ПЦР #1) проводится с Deg1 и Tnk1 или с Deg1 и Tnk2. TnkN1 и TnkN2 грунты, используемые для ПЦР #2, отжиг между концами transposon и Tnk1 и Tnk2, соответственно. Последовательность в тег грунт идентична ' конец 5 праймера Deg1. (B) пример геля агарозы получены после второго раунда ПЦР с 14 transposon мутантов (полос 1-14). Первый раунд ПЦР была выполнена с Deg1 и Tnk1; Второй раунд было сделано с тегом и представлена TnkN1. позитивные ПЦР «+» и отрицательные ПЦР по «-». «КмR» представляет канамицин сопротивления кассеты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема для получения вывода пула. В день вызова (день 0) каждый leptospiral мутант ЦИКом darkfield микроскопии, разбавляют до же плотность и объединены ввода бассейн (подробности в разделе 2.1). Хомяков ставятся внутрибрюшинно ввода бассейна. Кроме того три культуры были начаты с ввода бассейна. В день прививки (день 0) и когда культур достигают плотность ≈ 108/мл, ввода бассейн и культур собираются путем центрифугирования и хранятся в виде гранул-80 ° c до использования (см. раздел 2.3). На конечной точки (день заранее прекратить животных, например, 4 день после вызов) умерщвлены животных; крови, функции почек и печени накапливаются и хранятся при температуре-80 ° C до использования (см. раздел 2.4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: блок-схема подготовки геномная библиотека. (A) ДНК, извлеченные из крови, тканей или культур после протокол, описанные в разделе 3.1. Красное поле представляет transposon (Tn). (B) ДНК стриженый, sonication на фрагменты между 200 и 600 ВР. Дополнительная информация представлена в разделе 3.2. (C) C-хвосты (желтые прямоугольники) добавляются для всех фрагментов ДНК с трансферазы deoxynucleotidyl терминала (TdT) как описано в разделе 3.3 и таблица 4. Геномная библиотека готовится для последовательности вложенных ПЦР (D-E). Первый раунд ПЦР проводится с TnkN3 и olj376 грунты, специфичные для transposon и C-хвост, соответственно. Смотрите таблицу 3 и 5. Размножаются только фрагменты, содержащие transposon концы (красный прямоугольник). Примечание: Используйте 3 раза больше olj376 грунт, чем TnkN3, потому что все фрагменты ДНК у C-хвосты. Второй раунд ПЦР проводится с pMargent2, для transposon конца и один индексации грунт, содержащий шесть base пара штрих последовательности (в розовом) что позволяет всех образцов мультиплексируются в одной последовательности Лейн. Смотрите таблицу 3 и 6. Обе грунтовки содержат последовательности, необходимые для привязки потока клеток во время Illumina виртуализации (зеленый и фиолетовый box). (F) результате ПЦР продукты очищаются, а затем измеряется концентрация их, как описано в разделе 3.6. (G) объединены все геномные библиотеки; Каждая библиотека имеет различные штрих-кодов и (H) бассейн отправляется на платформу виртуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Sonication ДНК. ДНК был очищен от печень восьми зараженных Хомяк (полос 1-8), sonicated и изучены методом электрофореза в геле агарозы 2%. Стриженый ДНК характеризуется мазка, в котором размер большинство фрагментов находится между 200 и 600 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6: геномные библиотеки для высокопроизводительного секвенирования. Геномные библиотеки были подготовлены заинтересованных ПЦР с ДНК из крови восьми зараженных хомяков (полос 1-8) и изучил электрофорезом геля агарозы 2%. Размер большинства продуктов ПЦР находится между 200 и 600bp. отрицательный контроль (праймер не TnkN3 в смеси ПЦР #1, см. таблицу 5) показывает не амплификации (не показан). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7: фитнес мутантов из Tn-Seq эксперимент. Фитнес пул мутантов в хомячка в почки через 4 дня после вызов (взято из Lourdault в исследовании17). Входной/выходной коэффициент всех 42 мутантов был определен для каждого животного. Каждый мутант назван гена (lic) или в intergenic регионе (Интер) transposon вставляется или название широко используется в литературе. Каждый коэффициент представляет черный алмаз. Средний показатель соотношения (красная линия) был определен для каждого мутант и по сравнению с 1.0, используя Вилкоксон ранга теста. Пунктирная линия представляет Фитнес 1.0, которая соответствует нейтральных фитнес. Мутантов, которых фитнес значительно затронуты помечены звездочками: * P < 0,05; ** P < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Реактивы Объем на один реакции
Главный микс 2 X 12.5 МКЛ
Грунтовка 1, 10 мм (TnK1 или TnK2) * 1.2 МКЛ
Грунтовка 2, 10 мм (Deg1 или Deg2) * 1.2 МКЛ
Воды 8.8 МКЛ
Шаблон (lysate клетки или ДНК) 1.3 МКЛ
Окончательный объем 25 мкл
* Грунтовка последовательности в таблице 3.

Таблица 1: Идентификация transposon вставки сайте, полу-случайных смесь ПЦР #1.

Реактивы Объем на один реакции
Главный микс 2 X 12.5 МКЛ
Грунтовка 1, 100 мм (TnKN1 или TnKN2) * 0.2 МКЛ
Грунтовка 2, 100 мм (Tag) * 0.2 МКЛ
Воды 10.1 МКЛ
Продукты PCR от PCR #1 0,8 МКЛ
Окончательный объем 25 мкл
* Грунтовка последовательности в таблице 3.

Таблица 2: Идентификация transposon вставки сайте, полу-случайных смесь ПЦР #2.

Имя Последовательность (5' - 3') Ссылка
Праймеры для полу-случайных PCR
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Тег GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Праймеры для секвенирования Illumina
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina последовательности (штрихкоды выделены жирным шрифтом)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
ИС 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Таблица 3: Грунтовка последовательностей.

Реактивы Объем на один реакции
Стриженый ДНК 500 нг (см. уравнение в 3.3.2).
Воды До 14,5 мкл
5 x TdT буфера 4 МКЛ
(дЦТФ 9,5 мм + 0.5 мм ddCTP) смесь * 1 МКЛ
TdT (30 U/мкл) 0.5 МКЛ
Окончательный объем 20 мкл
* Mix 3 µLof 10 мм ddCTP, 5.7 мкл дЦТФ 100 мм и 51.3 мкл воды

Таблица 4: C-хвостохранилища реакции с трансферазы deoxynucleotidyl терминала (TdT).

Реактивы Объем на один реакции
Реакция библиотеки Реакция управления
Мастер смешать 2 x 12.5 МКЛ 12.5 МКЛ
Грунтовка 1, 30 мкм (TnkN3) * 0.5 МКЛ -
Грунтовка 2, 30 мкм (olj376) * 1.5 МКЛ 1.5
Воды 7.5 МКЛ 8 МКЛ
C-белохвост ДНК 3 МКЛ 3 МКЛ
Окончательный объем 25 мкл 25 мкл
* Грунтовка последовательности в таблице 3.

Таблица 5: Строительство геномные библиотеки, смесь ПЦР #1.

Реактивы Объем на один реакции
Реакция библиотеки Реакция управления
Мастер смешать 2 x 25 МКЛ 12.5 МКЛ
Грунтовка 1, 30 мкм (pMargent2) * 0.5 МКЛ 0,25 МКЛ
Грунтовка 2, 30 мкм (индексирования грунт) * 0.5 МКЛ 0,25 МКЛ
Воды 23 МКЛ 11.5 МКЛ
Продукты PCR от PCR #1 1 МКЛ 0.5 МКЛ
Окончательный объем 50 мкл 25 мкл
* Грунтовка последовательности в таблице 3.

Таблица 6: Строительство геномные библиотеки, смесь ПЦР #2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя результаты от нашего эксперимента для хомяка, внутрибрюшинно оспорены с 42 л interrogans мутантов представлены17, мы ожидаем, что большие бассейны мутантов может проверяться Tn-далее Потому что низкая частота трансконъюгантов (100-200 трансконъюгантов/спаривания), несколько вязки необходимо создать достаточное количество мутантов для больших Tn-Seq экспериментов. Поддержание большое количество мутантов в жидком культур представляет материально-технические проблемы, которые должны быть решены. Культуры можно инкубировали в глубоких 96-луночных пластины. Культура плотности может контролироваться оптической плотности чтений в спектрофотометр присвоено 420 Нм. Количество животных решимости использовать частично зависит от размера входного пула и должен быть определен путем анализа мощности. Для широкомасштабных экспериментов мы рекомендуем, что анализ питания производиться в консультации с биостатистик.

Узкие места могут повлиять восстановление случайных мутантов из вывода пула. Хотя серьезные узкие места не наблюдались в нашем экспериментальное исследование17 (рис. 7), широкомасштабные эксперименты могут быть затронуты случайной потери мутантов. Увеличение дозы вызов, увеличив количество ячеек на мутанта в бассейне ввода сведет к минимуму вероятность возникновения узких мест35. Недавно опубликованные «Гэлакси» пурпурный обеспечивает необходимый инструмент для оценки узких мест и фитнес31.

TN-Seq эксперименты планируется для альтернативного маршрута инфекции, другие Leptospira штаммов, или других грызунов модели требуют дополнительные соображения. Если кинетика инфекции в принимающей видов не известно или не постоянно экспоненциальной в течение инфекции в пределах каждой ткани быть расмотренным, ДНК должны быть получены от культивирования тканей, а не непосредственно из тканей. Этот дополнительный шаг позволит свести к минимуму завышению сметных расходов мутант фитнес вследствие обнаружения ДНК из мертвых спирохет. Если пул вывода получается от культивирования тканей, ввода бассейна следует культивированный смягчения последствий в пробирки роста. Мы также рекомендуем эксперимент с небольшим числом мутантов определить, будет ли узкие места озабоченность и оказанию помощи анализ питания для широкомасштабных экспериментов.

Подтверждение изменения фитнес как определяется Tn-Seq требует тестирования отдельных мутантов в животной модели. В настоящее время каждый мутант необходимо виртуализировать индивидуально до Tn-Seq для идентификации мутант, перевозящих вставки в ген интереса. Однако если замена аллеля в патогенных Leptospira становится легко, последовательность отдельных мутантов больше не будет необходимости. Кроме того транскрипции активатор как эффекторов успешно использовался для уменьшения lig выражение генов в л interrogans36. Этот метод может использоваться для вниз регулируют гены, нарушается в мутантов с измененной фитнес, выявленные Tn-Seq.

При интерпретации данных, Tn-Seq, взаимодействия между бактерии должны приниматься во внимание. Это теоретически возможно, что снижение фитнес может быть из-за конкуренции между мутантов, а не прямое действие вставки transposon. Кроме того отсутствие изменений в естественных условиях фитнес мутантов в бассейне может быть за счет сотрудничества между мутантов. Например мутант, который не в состоянии производить важным фактором может быть дополнена intercellularly производства фактора других мутантов в бассейне. Мы наблюдали увеличение в пригодности для нескольких мутантов, которые могут быть следствием снижение метаболизма бремени больше не синтезировать белки, которые не являются необходимыми для роста, как показано для Salmonella enterica37.

Этот протокол может использоваться для идентификации генов, участвующих в метаболизме или выживания в стрессовых условиях в vitro 38,39. Например растущее Leptospira в различных условиях как высокого натрия хлорида концентрацию, ограничены железо и кислой рН может определить гены, ответственные за кислой выживания или стресс сопротивления. Эти эксперименты в пробирке может также выполняться с сапрофитные штаммов например л biflexa штамм Patoc я потому, что этот Tn-Seq метод может быть применен к всех виртуализированных Leptospira штаммов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана заслуги дел ветеранов (в D.A.H.) и национального института здравоохранения предоставлять R01 Ай 034431 (D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

Иммунология выпуск 130 высокопроизводительного секвенирования случайные мутагенеза вложенные PCR спряжение Leptospira Фитнес мутанты Библиотека
Высок объём параллельного секвенирования для измерения фитнес <em>Лептоспире interrogans</em> Transposon вставки мутантов во время Золотой сирийского хомяка инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter