Summary
والهدف من هذا الأسلوب الاسكواش أنبوب سرعة تقييم ميزات الخلوية النامية spermatocytes الماوس مع الحفاظ على سلامة الخلوية. هذا الأسلوب يسمح للدراسة لجميع المراحل من الحيوانات المنوية، ويمكن تنفيذها بسهولة جنبا إلى جنب مع النهج البيولوجية الجزيئية والكيمياء الحيوية الأخرى لدراسة الانقسام الاختزالي الماوس.
Abstract
التدرج هو لدى الذكور هو عملية تتطلب العمل المتضافر لعدد من الأحداث الخلوية عالية التنظيم. يمكن أن تؤدي الأخطاء التي تحدث أثناء الانقسام الاختزالي للعقم، وفقدان الحمل أو العيوب الوراثية. تبدأ بداية البلوغ والمستمرة طوال مرحلة البلوغ، موجات شبه متزامن المستمر من spermatocytes الخضوع للحيوانات المنوية والحيوانات المنوية فرداني تشكل في نهاية المطاف. الموجه الأولى من سبيرماتوسيتيس الماوس يمر هو بدء يظهر في اليوم العاشر بعد الولادة (10 مدير النيابة العامة) وهي التي تطلق في التجويف الخصي كالحيوانات المنوية الناضجة في النيابة العامة 35. ولذلك، من المفيد استخدام الفئران داخل هذا الإطار الزمني الإنمائية بغية الحصول على السكان المخصب بدرجة عالية من الاهتمام. تحليل لمراحل الخلية نادرة أكثر صعوبة في الفئران الأكبر سنا نظراً لمساهمة المتعاقبة spermatogenic، التي تزيد من تنوع السكان الخلوية داخل الأنابيب. الأسلوب الموصوفة هنا أسلوب سهل تنفيذ للتقييم الخلوية للخلايا الموجودة داخل الخصي في الفئران، بما في ذلك سبيرماتوجونيا، سبيرماتوسيتيس، ولوحظت. تقنية الاسكواش يحافظ على سلامة الخلايا الجرثومية الذكور المعزولة ويسمح فحص الهياكل الخلوية التي لا يتم تصور بسهولة مع التقنيات الأخرى. إظهار التطبيقات الممكنة لهذه التقنية الاسكواش أنبوب، رصد الجمعية المغزل في spermatocytes تتقدم من خلال الطور الأول الطورية وأنا تمر بمرحلة انتقالية (G2/مي الانتقال). وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييم centrosome الازدواجية، وهو الجنس كروموسوم المنظمة (مورجان ستانلي)، وتشكيل باقة كروموسوم كأمثلة على الهياكل الخلوية التي يمكن ملاحظتها باستخدام هذا الأسلوب للاسكواش أنبوب. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتحديد العيوب المحددة خلال الحيوانات المنوية التي تنتج عن الطفرات أو اضطراب خارجية، وهكذا، يساهم في فهمنا الجزيئية للحيوانات المنوية.
Introduction
الانقسام هو حدث خلوية معقدة التي تبعتها جولة واحدة من تكرار الحمض النووي هما جولات متعاقبة من انقسام الخلية. يجب أن يكون العديد من الأحداث الخاصة بالانقسام الاختزالي منسقة خلال المراحل الأولية من الانقسام الاختزالي ضمان الفصل بين كروموسوم دقيقة. تتضمن هذه الأحداث إنجاز مثلى جزئ، التوجه المشترك للأخت كينيتوتشوريس خلال شعبة هو الأول، وفقدان تدريجي لمجمعات كوهيسين لحل تشياسماتا بين هومولوجس. التنظيم الدقيق لهذه العمليات ضروري للحفاظ على الخصوبة ومنع كروموسوم ميسيجريجيشن الأحداث التي يمكن أن تؤدي إلى اضطرابات النمو الوراثية والإجهاض العفوي1.
بينما الأحداث الرئيسية للانقسام الاختزالي تحدث في الذكور والإناث على السواء، وتوجد فوارق هامة الزمانية والميكانيكية بين الحيوانات المنوية وتكون البويضات2. على سبيل المثال، أثناء الانقسام الاختزالي الإناث، الطور الأول يحدث خلال التطور الجنيني، والاعتقالات في مرحلة ديكتياتي حتى سن البلوغ. وفي المقابل، تبدأ الحيوانات المنوية في سن البلوغ وتقدم في موجات طوال حياة البالغين دون القبض عليه. الفروق بين الذكور والإناث في الانقسام الاختزالي تشدد على الحاجة إلى تطوير أساليب تلبي على وجه التحديد إلى تقييم هذه العمليات في كل من سبيرماتوسيتيس وبويضات. في الوقت الراهن، تقييم التقدم هو إلى حد كبير يعتمد على استخدام لونين ينتشر3،،من45. في حين ينتشر الكروماتين مفيدة لدراسة الكروموسومات هو، فشلوا في الحفاظ على سلامة الخلوية، منع تقييم الهياكل الخلوية مثل المغزل microtubules، سينتروسوميس، والمغلف النووية، والمرفقات telomere. يعيش التصوير وتقنيات تثقيف طويلة الأجل قد متقدمة إلى حد كبير فهمنا للانقسام الاختزالي الإناث؛ نهج مماثل لتصور الخلية سليمة بأكملها، ومع ذلك، تنفذ أقل كثيرا لدراسة الحيوانات المنوية6،7. من أجل تصور الأحداث الحيوية في جميع أنحاء الانقسام الذكور، نحن قد تكيفت أنبوب المنشأة الاسكواش تقنيات لتقييم سرعة الخلوية ميزات وضع الماوس سبيرماتوسيتيس8،9. الأسلوب الموصوفة هنا يحافظ على وحدة الخلية، مما يتيح دراسة الهياكل الخلوية متعددة خلال المراحل المختلفة للحيوانات المنوية.
هذا الأسلوب للاسكواش أنبوب هو نهج خلية كاملة، مما يسمح لتقييم الهياكل الخلوية عن طريق الفحص المجهري الفلورة. تسمح نهج النسيجي مشتركة لتصور التقدم هو في الفئران الذكور مثل هايماتوكسيلين وتلطيخ ويوزين الخصيتين البارافين المضمنة، ووسم إيمونوفلوريسسينت من كريوسيكشنز لمحة عامة عن التقدم هو. ومع ذلك، تفشل هذه التقنيات لحل الخلايا المفردة بالقدر اللازم لتحليل مفصل للأحداث التي وقعت في جميع أنحاء الانقسام الاختزالي10،11. تقنيات بديلة لتصور العمليات هو الاعتماد على انقطاع تشيميوسموتيك كبيرة سبيرماتوسيتي عزل وإصلاح المواد النووية3،،من45. هذه العلاجات الكيميائية تعوق مراقبة أنواع الخلايا عدا spermatocytes الأولية. وصف مؤخرا أسلوباً ناميكاوا مكن مجتمع البحوث للحفاظ على بنية النووية spermatocytes معزولة، ولكن يتطلب استخدام سيتوسبين والملحقات التي قد لا تكون متاحة لبعض المختبرات4. وفي المقابل، يتطلب تقنية الاسكواش أنبوب فقط المعدات القياسية عموما في معظم مختبرات البيولوجيا الخلية.
يمكن استخدام أنبوب الاسكواش الطريقة الموضحة هنا لتصور أنواع الخلايا المتنوعة الموجودة داخل أنبوب سيمينيفيروس، بما في ذلك خلايا سيرتولي، سبيرماتوجونيا، سبيرماتوسيتيس الأولية والثانوية، ولوحظت. باقتران هذا الأسلوب مع الموجه الأولى قرب متزامن للحيوانات المنوية في الفئران الأحداث، من الممكن الحصول على السكان المخصب spermatogenic الخلايا كما أنها تقدم من خلال الانقسام الاختزالي12. تسمح هذه العملية تحليل مفصل للعمليات في جميع أنحاء الحيوانات المنوية، مثل أوائل الطور الأول الأحداث G2/مي والطوريه للتحولات طور الصعود، وسبيرميوجينيسيس. علاوة على ذلك، يمكن استخدام أنبوب الاسكواش الاستعدادات لتصور الخلوية ميزات الكروموسومات (مثل مجالات إينتيرتشروماتيد (مستودعات التخليص الداخلي) وكينيتوتشوريس) وسينتروسوميس (centrioles والمواد بيريسينتريولار/المصفوفات). يمكن تنفيذ أسلوب الاسكواش سهولة بالتوازي مع نهج تجريبية أخرى، مثل حيزات الكروماتين واستخراج البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب تم تعديل بنجاح لإيداع spermatogenic الخلايا الحية على الشرائح للتصور المباشرة13.
الأسلوب الموصوفة هنا ينطوي على تقنية إسكواش أنبوب seminiferous خلية كاملة لتحليل الانتقال G2/مي في البرية من نوع C57BL/6J الفئران. كانت تصور ملامح الخلوية الأولية spermatocytes دخول شعبة هو أول مع مجهر الفلورة لمراقبة محور الدوران هو. يمكن تعديل هذه التقنية متعددة بسهولة لتصور هو مراحل وأنواع مختلفة من الخلايا الأخرى. هذه التقنية أيضا قابلة لاستراتيجيات التصور البديلة، مثل النهج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأقر استخدام الفئران برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جونز على هوبكنز. وأجريت تجارب على الأحداث (20-26 يوما بعد الولادة، والحزب الديمقراطي التقدمي) C57BL/6J الفئران، مع استفادة الموجه الأولى شبه متزامن للحيوانات المنوية. ومع ذلك، هذا الأسلوب يمكن أيضا إجراء باستخدام الفئران الكبار.
1-التشريح والعزلة للخصي الماوس
- إعداد إصلاح/تحلل الحل وجسم إضعاف المخزن المؤقت (مصرف التنمية الآسيوي) المبينة في الجدول 1 و الجدول 2.
- تحضير طبق بتري 35 ملم واحد مع 3 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (1 x PBS، درجة الحموضة 7.4), وآخر طبق 35 ملم مع 2 مل من محلول الإصلاح/تحلل كل الماوس.
- التضحية بالماوس عبر عنق الرحم التفكك أو CO2 الخنق ورذاذ البطن البطني مع الإيثانول 70%. فتح تجويف أبدومينوبيلفيك استخدام مقص عقيمة، مما يجعل من فتح على شكل V. ثم إزالة الخصيتين عن طريق سحب على لوحة الدهون البربخيه استخدام الملقط، وتجنب الإخلال albuginea الغلالة. وضع الخصيتين في طبق بتري 35 ملم يحتوي على 1 x PBS.
ملاحظة: الاستفادة من الموجه الأولى من الحيوانات المنوية من أجل مراقبة سكان خلية مخصب بفائدة14. يتم إثراء مراحل محددة من الحيوانات المنوية في الماوس مختلفة الإعمار (الجدول 3). - إزالة الخصية albuginea الغلالة بثقب الأنسجة مع الملقط مقلوب حادة وجمع الخصي فضفاضة. نقل الأنابيب إلى طبق بتري 35 ملم جديدة تحتوي على 2 مل من محلول الإصلاح/تحلل.
- احتضان الأنابيب في حل الإصلاح/تحلل لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2-إعداد الخصي
- إعداد شريحة زجاج بولي-L-يسين مغلفة بإيجاز حواف الشريحة بقلم مانع سائل.
- تطبيق 100 ميليلتر من حل الإصلاح/تفسخ وسط الشريحة الزجاجية.
- استخدام الملقط العقيمة ومقص بلطف ندف أربا الخصي. الاستغناء عن أنبوب طويل فرادى قطاعات حوالي 20 ملم في الطول.
ملاحظة: تصور الهياكل الحساسة للتعرض مثبت لفترة طويلة، مثل سينتروسوميس، منفصلة الأنابيب أول مرة في برنامج تلفزيوني 1 x، ثم مباشرة فرم الأنابيب على السطح مصقول الشرائح بولي-يسين في 100 ميليلتر من الإصلاح-تحلل الحل. - نقل خمسة قطاعات أنبوب طويل سيمينيفيروس 20 مم إلى استعداد بولي-L-يسين المغلفة الزجاج الشريحة التي تحتوي على الإصلاح/تحلل الحل.
- باستخدام مقص معقم اللحم المفروم الخصي إلى شرائح 1.5 إلى 3.0 مم.
- استخدام الملقط المعقم ترتيب أجزاء أنبوب على الشريحة الزجاجية بحيث يتداخل مع لا الأنسجة، والأنابيب وتوزع بالتساوي.
ملاحظة: العدد الأمثل لقطاعات أنبوب على شريحة زجاج بين 20 و 40 سنة.
3-السحق للخصي
- نقل الشريحة الزجاجية التي تحتوي على شرائح أنبوب سيمينيفيروس متفرقة على benchtop. إزالة السائل الزائد باستخدام مسح مختبر لتجنب فقدان الأنسجة أثناء الخطوة الاسكواش.
- تطبيق ساترة (60-1.5 مم × 22) على رأس الشريحة الزجاجية وتطبيق الضغط مع كعب كف ل 10-20 ثانية. من المهم تطبيق ما يكفي من القوة لتفريق سبيرماتوسيتيس من الخصي.
ملاحظة: مراقبة الأنابيب استخدام مجهر تشريح بغية تحسين الخطوة سحق بحيث تتعطل جميع قطاعات أنبوب. - استخدام الملقط الشريحة، فورا فلاش تجميد الشريحة الزجاجية في ديوار صغيرة من سائل ن2 لمدة 15 ثانية، أو حتى يتوقف السائل إلى فقاعة. إذا إيمونولابيلينج على الفور، إزالة ساترة مع شفرة حلاقة حافة مستقيمة، غرامة الملقط تلميح أو إبرة قياس 21.
ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، إيمونولابيل الشرائح فورا (راجع الخطوة 4). ومع ذلك، عند هذه النقطة الشرائح يمكن الحفاظ على في-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. لتعظيم عمر البروتينات والهياكل الخلوية، فورا تخزين الشرائح على الثلج الجاف أو نقل إلى ثلاجة-80 درجة مئوية، والاحتفاظ ساترة على الشريحة. عند تخزين إيمونولابيلينج الشرائح، إزالة ساترة بغمر الشرائح في السائل ن2 لمدة 15 ثانية، كما هو موضح في الخطوة 3، 3.
4-إيمونولابيلينج للخصي المحملة
- تزج الشريحة في 1 x برنامج تلفزيوني، وتغسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين 50 مل يحتوي على 1 x PBS.
ملاحظة: تسمح ابدأ للشرائح ليجف تماما أثناء إيمونولابيلينج. - تطبيق 1 مل من جسم إضعاف المخزن المؤقت على شريحة الزجاج كتلة ح 1-2 في دائرة هوميديفيد.
- إزالة المخزن المؤقت تمييع جسم وتطبيق 100 ميليلتر من جسم الابتدائي المخفف في المخزن المؤقت لتمييع جسم في دائرة هوميديفيد.
ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، احتضان الأجسام الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. استخدام أحجام أصغر من الأجسام المضادة (مثلاً 50 ميليلتر) التي تغطي الشريحة مع ساترة أو بارافيلم. التحقق من صحة وتحسين أجسام الابتدائي15. - شطف الشرائح ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين 50 مل يحتوي على 1 x PBS.
ملاحظة: تعزيزا ليغسل، تحرض كوبلين الجرار باستخدام شريط إثارة مغناطيسية صغيرة ومكان على لوحة إثارة مغناطيسية على سرعة منخفضة، أو ضع الجرة كوبلين في خلاط سطح المنضدة بسرعة منخفضة. - تطبيق 100 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف في جسم إضعاف المخزن المؤقت لح 1 إلى 1.5 في دائرة هوميديفيد في درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح في مربع الظلام لتجنب صور تبيض fluorophore مترافق الأجسام المضادة.
ملاحظة: استخدام أحجام أصغر من الأجسام المضادة (مثلاً 50 ميليلتر) التي تغطي الشريحة مع ساترة أو بارافيلم. - شطف الشرائح مرتين لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين 50 مل يحتوي على 1 x PBS.
- تحميل الشرائح في تصاعد المتوسطة التي تحتوي على 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI، 1.5 ميكروغرام/مل) وتطبيق كوفيرسليبس (60-1.5 مم × 22).
- ختم كوفيرسليبس على الشرائح مع طلاء الأظافر واضحة للمحافظة على الشرائح والحيلولة دون الانتقال كوفيرسليبس.
5-تحليل والاستعدادات للاسكواش أنبوب التصوير
- استخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مع المرحلة الآلي الذي يتيح دقة محور ع الحركة وكاميرا ذات دقة عالية لالتقاط الصورة. بدلاً من ذلك، استخدام مجهر ليزر [كنفوكل].
ملاحظة: استخدم أي الأجهزة المتوفرة والبرامج لهذه الخطوة. على سبيل المثال، تم القبض على الصور المعروضة في الشكل 1 و الشكل 2 استخدام زايس Z1 المراقب خلية مرتبطة بكاميرا CMOS 4.0 أرك-فلاش وتحليلها مع البرنامج صورة الطبعة زايس زن 2012 الأزرق. - تقييم الشرائح باستخدام هدفا X 20 لتحديد نوعية إعداد الاسكواش. لديك الشرائح ذات نوعية جيدة من أحادي الطبقة أنوية التي توزع بالتساوي.
ملاحظة: بعض المقاطع من الشريحة قد تكون أفضل من غيرها، فمن المفيد ملاحظة إحداثيات يمكن العثور فيها على المناطق أفضل من الشريحة لمزيد من التحليل باستخدام أعلى التكبير. - استخدام الهدف التكبير أعلى (مثلاً 63 X أو 100 X)، مناطق التقاط الشريحة التي لديها من أحادي الطبقة متسقة من النوى. وبمجرد تحديد منطقة، تعيين العلوي وانخفاض Z-مداخن لضمان أن يتم التقاط كافة في تركيز الضوء.
ملاحظة: عموما تم تعيينه بواسطة برنامج اقتناء الصور العدد الأمثل من Z-مداخن التقاطها بين الحد العلوي والسفلي وهي مختلفة بالنسبة لكل هدف من الأهداف. - استخدام برامج معالجة الصور لتجميع صورة تركيز مدد عمق. البرنامج يجمع بين الضوء في التركيز من كل Z-المكدس، وضروري للتصوير الأمثل لأنبوب الاسكواش الاستعدادات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هنا، وقد استخدمنا طريقة الاسكواش أنبوب لتصور السكان خلية عابرة تمر في الطور الأول الطورية أنا (G2/مي) مرحلة انتقالية، والتي تم اثراؤه بحصاد الخصيتين من الفئران البرية من نوع الأحداث التي تمر الموجه الأولى من الحيوانات المنوية (24 الحزب الديمقراطي التقدمي). ويصور الشكل 1 الصور التمثيلية لمختلف مراحل الخلية التي يمكن تصور استخدام الأسلوب الاسكواش أنبوب. أثري سكان الطورية وأنا سبيرماتوسيتيس كانت تصور استخدام الأجسام المضادة ضد ألفا-tubulin (الشكل 1A). نحن تستخدم علامات للانقسام المبكر والمتأخر الأول للتقدم هو مرحلة. كانت الاستعدادات للاسكواش أنبوب إيمونولابيليد مع جسم مضاد للبروتين مجمع سينابتونيمال، SYCP3، تصور مراحل أولاً الطور الأول Leptotene/زيجوتيني وسبيرماتوسيتيس باتشيتيني/طور مبينة في الشكل 1 باء. سبيرماتوسيتيس تمر بشعبة هو أول يمكن أن تحدد بوضوح استخدام الأجسام المضادة ضد ألفا-tubulin (الشكل 1A و ج 1). لدراسة الأحداث هو الراحل، كانت القرعية أنبوب ريلوكاليزيس إيمونولابيليد باستخدام الأجسام المضادة ضد دورة الخلية كيناز أورورا ب (أوركب)، الذي يموضع إلى السنترومير الداخلية خلال الطورية، ثم إلى ثلم ميدزوني والانقسام المغزل أثناء طور الصعود وسيتوكينيسيس، على التوالي (الشكل 1). وقد تصور ميزات الخلوية من الكروموسومات خلال شعبة هو أول. لمراقبة مستودعات التخليص الداخلي، الاسكواش أنبوب الاستعدادات تم استخدام الأجسام المضادة ضد وحدة فرعية خاصة بالانقسام الاختزالي ألفا-كلايسين من كوسين، REC8 إيمونولابيليد (الشكل 1). تم تقييم ديناميات كروموسوم خلال طور الصعود استخدام إيمونولابيلينج ألفا-tubulin ووصمة عار الحمض النووي، DAPI. سبيرماتوسيتي بنجاح إكمال شعبة هو أول يرد في الشكل 1E، بينما يبين الشكل 1Fspermatocyte التي تحتوي على همزة وصل طور الصعود. باستخدام تقنية الاسكواش أنبوب، محور الدوران هو طول، محاذاة كروموسوم والعزل يمكن قياسها ومقارنة بين الفئران المسخ والتحكم.
الفائدة هذا الأسلوب للتصور دورة الخلية إضافية التحولات وهياكل سوبسيلولار المرتبطة بالطور الأول وأنا يتجلى في الشكل 2. خلال leptotene [سوبستج] من الطور الأول الأول، بدء من الأقران كروموسوم مثلى توسط التغيرات الدينامية في المرفقات telomere للحث على تشكيل التكتلات كروموسوم يواجه قطب واحد من المغلف النووية (شمال شرق)16، 17 , 18 , 19 , 20-هذه المطابقة، المعروفة باسم كروموسوم "باقة" يعتقد أن زيادة احتمال وتواتر التفاعلات بين هومولوج (الشكل 2A). البدء والانتهاء من تشابك بين الكروموزومات المتماثلة يحدث أثناء زيجوتيني (الشكل 2B) والمراحل الفرعية باتشيتيني (الشكل 2)، على التوالي، تقابل مع تشتت التدريجي باقة كروموسوم. في نفس الوقت تقييم ديناميات باقة تشابك وكروموسوم في الفئران الأحداث، نحن إيمونولابيليد أنبوب الاسكواش الاستعدادات مع الأجسام المضادة SYCP3 و centromeres، والملون للحمض النووي باستخدام DAPI. الكروموسومات الماوس تيلوسينتريك، ولذلك استخدمت السنترومير إيمونولابيلينج للكشف عن التغييرات في المرفقات NE telomere.
المنظمة هو الجنس الصبغي (مورجان ستانلي) هو السمة مميزة فريدة أن الانقسام الاختزالي الذكور، حيث X غير المتجانسة والتحايل الكروموسومات Y التنشيط نقطة تفتيش بتمر الفسفرة كروموسوم على نطاق المنظومة للبديل هيستون H2AFX (yH2AX، pSer139)21 ،،من2223. زوج الكروموسوم X-Y ترانسكريبتيونالي اسكتت ومجزأة إلى فرعي نووية كثيفة تسمى "الهيئة الجنس". يمكن تحديد سبيرماتوسيتيس تمر مورجان ستانلي سهولة خلال المراحل الفرعية باتشيتيني وطور بأنبوب إيمونولابيلينج الاسكواش الاستعدادات مع الأجسام المضادة إلى yH2AX (Ser139). يصور الشكل 2D سبيرماتوسيتي في إيمونولابيليد [سوبستج] باتشيتيني مع الأجسام المضادة ضد yH2AX (Ser139)، centromeres والملون مع DAPI لتصور الحمض النووي.
الازدواجية centrosome شبه المحافظ ويحدث خلال الطور الأول إصلاح الأول من الانقسام الاختزالي الذكور عند الانتهاء من الحمض النووي التأكد من أن كل خلية ابنه الناتجة يرث centrioles اثنين (واحد سينتروسومي) بعد انقسام الخلية24،25 . سينتروسوميس تتكون من اثنين centrioles أورثوجونالي مرتبة متصلة بواسطة رابط مرنة ومحاطة بمصفوفة غير متبلور من البروتينات تعرف باسم المواد/مصفوفة (PCM) بيريسينتريولار26. بعد الازدواجية في [سوبستج pachytene]، شكلت حديثا مريكز أزواج فك الارتباط ببعضها البعض، والخضوع نضج سينتروسومي والهجرة إلى أقطاب المعاكس خلال مرحلة طور لتسهيل تشكيل مغزل القطبين. كان تصور spermatocyte طور مبكر تمر الانفصام أزواج مريكز شكلت حديثا بالاستعدادات للاسكواش أنبوب إيمونولابيلينج مع الأجسام المضادة ضد بيريسينترين (PCNT)، أحد مكونات بروتين PCM وسينترين-3 (CETN3) لوضع علامة على centrioles (الشكل 2E). التدريج مصممة باستخدام أجسام مضادة ضد SYCP3، وتم استخدام DAPI وصمة عار الحمض النووي.
الشكل 1 : تحليل الممثل للانتقال G2/مي هو استخدام أنبوب الاسكواش الاستعدادات. وأجريت التحضيرات الاسكواش أنبوب على قطاعات أنبوب سيمينيفيروس من الحزب الديمقراطي التقدمي C57BL/6J الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 24. (أ) مجال الممثل إيمونولابيليد سبيرماتوسيتيس النامية مع الأجسام المضادة ضد ألفا-tubulin centromeres (أحمر)، (الأخضر) والحمض النووي وصمة عار DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، الأزرق). (ب) كانت ملطخة البرية من نوع أنبوب القرعية في DAPI (الأزرق) فضلا عن إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد ألفا-توبولين (أحمر)، والعنصر الأفقي الخاص باتفاقية استكهولم، SYCP3 (الأخضر). (ج) البرية من نوع أنبوب القرعية كانت ملطخة ب DAPI (الأزرق) فضلا عن إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد ألفا-توبولين (أحمر)، ودورة الخلية كيناز الأخضر أوركب (). يمكن تصور ملامح الخلوية من الكروموسومات مثل مستودعات التخليص الداخلي والجسور طور الصعود باستخدام أنبوب الاسكواش الاستعدادات. (د) مراقبة مستودعات التخليص الداخلي، سبيرماتوسيتيس بروميتافاسي كانت إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد centromeres (أحمر) كذلك مكون هو كوسين محددة، REC8 (الأخضر) والملون مع DAPI (أزرق). (ه، و) كان تصور مورفولوجيا كروموسوم خلال طور الصعود باستخدام الأجسام المضادة ضد ألفا-tubulin centromeres (أحمر)، (الأخضر)، و DAPI وصمة عار (أزرق). يمكن تحديد مجموعة كاملة من تطوير سبيرماتوسيتيس باستخدام تقنية الاسكواش أنبوب (L/Z، سبيرماتوسيتيس المرحلة leptotene/زيجوتيني؛ ف/د، باتشيتيني/طور المرحلة سبيرماتوسيتيس؛ بعد الظهر، سبيرماتوسيتيس بروميتافاسي؛ م، سبيرماتوسيتيس الطورية؛ أ، سبيرماتوسيتيس طور الصعود). شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : أمثلة للتغييرات الشكلية إضافية والهياكل المرتبطة بتطور الطور الأول هو في الذكور باستخدام أنبوب الاسكواش الاستعدادات. وأجريت التحضيرات للاسكواش أنبوب على أنبوب seminiferous شرائح C57BL/6J الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين 12-18 مدير النيابة العامة وكانت ملطخة DAPI (4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي، أزرق) لتسمية الحمض النووي. (أ-ج) ويقترن تشابك homolog على تشكيل وتشتت التدريجي من الكروموسوم "باقة" أثناء تطور الطور الأول. وكانت Leptotene (A)وزيجوتيني (ب)باتشيتيني (ج) المرحلة سبيرماتوسيتيس إيمونولابيليد مع الأجسام المضادة ضد SYCP3 (أحمر) و centromeres (الأخضر). (د-ه) أنبوب الاسكواش الاستعدادات يمكن استخدامها للكشف عن التغيرات الخلوية فريدة من نوعها وهياكل أثناء الطور الأول الذكور التقدم بما في ذلك المنظمة هو الجنس الصبغي (مورجان ستانلي) والازدواجية في سينتروسومي. (د) Pachytene spermatocytes مرحلة تمر مورجان ستانلي تم الكشف عن استخدام الأجسام المضادة إلى yH2AX (Ser139) لتسمية الجنس-الجسم (السهم الأخضر)، وتظهر centromeres باللون الأحمر. (ﻫ) طور spermatocytes المرحلة حددت استخدام أجسام مضادة ضد SYCP3 (أحمر)، وسينتروسوميس (رأس السهم) تم الكشف عن استخدام أجسام مضادة ضد سينترين-3 (أخضر) وبيريسينترين (أرجواني) لتسمية centrioles وبيريسينتريولار المواد/مصفوفة، على التوالي. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| البند | المبلغ | التركيز النهائي |
| 1 x برنامج تلفزيوني | 10 مل | س 1 |
| منهاج العمل 16 ٪ | 500 ميكروليتر | 0.8% (v/v) |
| 10% تريتونكس-100 في برنامج تلفزيوني | 100 ميكروليتر | 0.1% (v/v) |
الجدول 1: حل الإصلاح/تحلل. الوصف: ضبط الأس الهيدروجيني إلى 9 مع هيدروكسيد الصوديوم [50 مم]. التفاف الحاوية للحل في رقائق الألومنيوم لحماية من الضوء وتخزينها في 4 درجات مئوية. عدم استخدام حل الإصلاح/تحلل إذا القديمة أكثر من أسبوع. يمكن أيضا استخدام الصلبة منهاج عمل بيجين لجعل الحل. يوصي باستخدام فوميهود تجنب التعرض لمنهاج عمل بيجين.
| البند | المبلغ | التركيز النهائي |
| 1 x برنامج تلفزيوني | 50 مل | س 1 |
| جيش صرب البوسنة | ز 1.5 | 3% (w/v) |
| مصل الحصان | 5 مل | 10% (v/v) |
| 10% تريتونكس-100 في برنامج تلفزيوني | 250 ميكروليتر | 0.05% (v/v) |
الجدول 2: جسم إضعاف المخزن المؤقت (مصرف التنمية الآسيوي) الوصفة. الوصف: مخزن بنك التنمية الآسيوي في 4 درجات مئوية أو تجميد الأرصدة في-20 درجة مئوية إذا صنع كميات أكبر. بنك التنمية الآسيوي يمكن أن تصبح ملوثة، تأكد من تقنيات العقيم الجيدة المستخدمة وتقييم الحل للتلوث قبل كل استعمال. تحضير مختبرين أصغر من بنك التنمية الآسيوي للحد من التلوث.
| نوع الخلية | العملية الخلوية | العمر الماوس (الحزب الديمقراطي التقدمي) |
| Leptotene | تشكيل "هيئة تسوية المنازعات الحمض النووي" | 10-12 |
| الجمعية العامة عناصر المحورية | ||
| زيجوتيني | الشروع في إصلاح جهاز تسوية المنازعات وتشابك مثلى | 12-16 |
| باتشيتيني | انتهاء إصلاح جهاز تسوية المنازعات جسمية | 16-20 |
| النضج كروس جزئ الأحداث | ||
| تشابك كاملة بين هومولوجس | ||
| المنظمة هو الجنس الصبغي (مورجان ستانلي) | ||
| مريكز نضوج الازدواجية/سينتروسومي | ||
| طور ودياكينيسيس | ديسينابسيس SC | 18-22 |
| الفصل سينتروسومي | ||
| الطورية أنا | حاجز المغزل | 22-26 |
| جولة النطف | استبدال البروتامين | > 24 |
| تشكيل أكروسومي |
الجدول 3: قرب متزامن مع الموجه الأولى من الحيوانات المنوية في الفئران الأحداث. الوصف: يتم إثراء مراحل محددة من الحيوانات المنوية في مراحل مختلفة من التنمية الماوس الأحداث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الفئران أثبتت أن يكون كائن نموذج مفيد لدراسة الأحداث الخلوية التي تحكم تطور هو خلال الحيوانات المنوية. علاوة على ذلك، فإنه من الضروري تطوير الأدوات التي تهتم بدراسة الحيوانات المنوية لأن العديد من الأحداث، مثل الخروج من الطور الأول هو أنا، ديمبرافيك جنسياً. هذا البروتوكول وصف أسلوب إسكواش أنبوب سيمينيفيروس للتصور والدراسة للمراحل المختلفة للحيوانات المنوية الماوس. هذا الأسلوب يحافظ على سلامة الخلوية، ومما يسمح تحليلات مفصلة للهياكل النووية وحشوية. وتبين النتائج الممثل صورت في هذه الدراسة فائدة هذا البروتوكول في تقييم spermatocytes الأولية يخضع التقدم هو. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لدراسة العمليات الخلوية الأخرى خلال الحيوانات المنوية، بما في ذلك انتشار والتفريق بين سبيرماتوجونيا ومراحل سبيرميوجينيسيس27،28. داخله في الأساليب المذكورة هي مقتبسة من أنبوب هو موضح سابقا الاسكواش تقنيات8،9. بيد أن هذا البروتوكول هو أول دليل تفصيلي، تغطي جميع الكواشف والخطوات المطلوبة، من الحصول على الأنابيب لتصور الخلايا المفردة عبر الفحص المجهري الأسفار. وعلاوة على ذلك، وقد قدمنا الصور على ميزات الخلوية إضافية، بما في ذلك مريكز وباقة telomere، التي يمكن تصور مع التقنية.
وهناك عدد قليل من العناصر التقنية التي هي المفتاح لتحسين الاستعدادات للاسكواش أنبوب. واحد أولاً، يجب تطبيق كمية مناسبة من قوة ساترة زجاجية. عدم تطبيق القوة الكافية سوف تنتج الشرائح مع بعض الخلايا ملتصقة، كما سيبقى معظم الخلايا داخل الخصي. ثانيا، يجب احتضان أحد المواد الخصية في حل الإصلاح/تحلل للطول المناسب للوقت. عموما، ينبغي أن يكون التثبيت المحدودة لمدة 5 دقائق، ولكن مقبول تتراوح ما بين 5 و 15 دقيقة. الأنابيب التي تم إصلاحها لفترة طويلة سيكون من الصعب التلاعب ويؤدي إلى نتائج سيئة. ومع ذلك، من الممكن لتمديد فترة الحضانة بتقليل تركيز منهاج عمل بيجين. على سبيل المثال خفض منهاج عمل بيجين في المائة إلى 0.5 في المائة سيسمح بزيادة الاحتضان مرات في حل الإصلاح/تحلل. في الأسلوب وقد قدمنا، أن الخطوات permeabilization والتثبيت تحدث في وقت واحد، ولكن يمكن تنفيذ هذه الخطوات واحدة بعد أخرى، على التوالي. تفصل الخطوات بيرميبيليزيشن والتثبيت يمكن أن تساعد على تقليل مستويات الإشارات الخلفية هيولى. يمكن أيضا اختبار تباين استراتيجيات التثبيت و/أو بيرميبيليزيشن لتحسين الظروف لتقييم هيكل سوبسيلولار محددة أو الأجسام المضادة. على سبيل المثال، تصور سينتروسومال والمغزل البروتينات يمكن أن تتعزز باستخدام الميثانول بدلاً من منهاج عمل بيجين29،،من3031. بالإضافة إلى ذلك، يكون من المفيد استخدام الفئران الأحداث التي تتقدم من خلال الموجه الأولى من الحيوانات المنوية (حوالي 10-26 النيابة العامة) من أجل التحديد ووضع تصور لقوة نادرة الأحداث الخلوية هو12. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لعزل الخلايا الخاصة بالمرحلة هو من الفئران الكبار بمراقبة نمط امتصاص الضوء داخل أنبوب سيمينيفيروس32. نظراً للدورة غير متزامن للحيوانات المنوية في الفئران الكبار، إلا أن تحليل الأحداث هو نادر بالتفصيل يمكن أن يكون تحديا. هذا القيد يمكن التغلب عليها عن طريق حقن الفئران مع بيسديتشلورواسيتيلدياميني، 18,446 ين، التي الأيض فيتامين (أ) كتل وتوقف التمايز سبيرماتوجونيال33. بعد العلاج مع وين 18,466، استئناف للحيوانات المنوية سوف تحدث بشكل متزامن، تدر كميات كبيرة من السكان المخصب الخلية الجرثومية من حيوان النضج34. يمكن استخدام هذه الاستراتيجية المزامنة قبل تقنية الاسكواش أنبوب للتحقيق في أوجه الاختلاف بين الموجات الأولى شبه متزامن للحيوانات المنوية لتلك التي تحدث في البالغين35،36، 37-وعلاوة على ذلك، العلاقة بين الشيخوخة الأب وانيوبلويدي يمكن أيضا تقييم استخدام العزل الصبغي المزامنة وتقييم 18,466 وين مع أسلوب الاسكواش أنبوب.
وباختصار، يمكن استخدام هذا الأسلوب بالاقتران مع مجهر الفلورة لمراقبة الخلايا في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية. تطبق على نطاق أوسع، هذا الأسلوب يمكن استخدامها لتقييم السكان الفرعية سبيرماتوجونيا، سبيرماتوسيتيس، ولوحظت أيضا، ويمكن أن تكون مصممة لدراسة طائفة واسعة من العمليات خلال الحيوانات المنوية. هذا النهج قد استخدمت للخلية الحية التصوير من سبيرماتوسيتيس، وتعديل القيام بمجموعة متنوعة من الدراسات الخلوية والبيوكيميائية38،،من3940. وقد استخدمت تقنية الاسكواش أنبوب للماوس وفار الخصي، مما يوحي بأن ذلك ينبغي أن تطبق سهولة نظم الثدييات الأخرى، بما في ذلك الإنسان40. هذه التقنية يمكن أن تساعد على تحديد الاضطرابات الخلوية التي تؤدي إلى العقم وانيوبلويدي الحيوانات المنوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
نيجمس (R01GM11755) إلى P.W.J. وزمالة منحة تدريبية من الوطنية سرطان معهد (NIH) (CA009110) إلى S.R.W. و J.H. تم تأييد هذا العمل
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
