Summary
Diese Röhrchen-Squash-Technik soll rasch zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten unter Beibehaltung der zellulären Integrität zu beurteilen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von allen Stufen der Spermatogenese und neben anderen biochemischen und molekularen biologischen Ansätze zur Erforschung der Maus Meiose leicht umgesetzt werden kann.
Abstract
Meiotische Progression bei Männern ist ein Prozess, der die konzertierte Aktion eine Reihe von stark regulierten zelluläre Ereignisse erfordert. Während der Meiose auftretende Fehler können zu Unfruchtbarkeit, Schwangerschaftverlust oder Gendefekte führen. Beginnend mit dem Beginn der Pubertät und während der gesamten Erwachsenenalter, kontinuierliche halbsynchrone Wellen von Spermatozyten Spermatogenese zu unterziehen und letztlich bilden haploide Spermien. Die erste Welle der Maus Spermatozyten unterziehen meiotische Einleitung erscheinen am 10. Tag Post-Partum (10 Dpp) und in das Lumen der seminiferous Röhrchen als reifes Sperma auf 35 Dpp freigesetzt werden. Daher ist es vorteilhaft, Mäuse innerhalb dieser Entwicklungsstörungen Zeitfenster zu nutzen, um hoch angereicherten Populationen von Interesse zu erhalten. Analyse der seltenen Zelle Stadien ist schwieriger bei älteren Mäusen aufgrund des Beitrags von aufeinanderfolgenden spermatogenic Wellen, die die Vielfalt der zellularen Bevölkerungen innerhalb der Tubuli zu erhöhen. Die hier beschriebene Methode ist eine leicht implementierte Technik für die zytologische Auswertung der Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen von Mäusen, einschließlich Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids gefunden. Die Röhrchen Squash Technik bewahrt die Integrität der isolierten männlichen Keimzellen und ermöglicht die Untersuchung der zellulären Strukturen, die mit anderen Techniken nicht einfach visualisiert werden. Um die Anwendungsmöglichkeiten dieser Röhrchen-Squash-Technik zu demonstrieren, wurde Spindel Montage in Spermatozyten voran durch die Prophase, Metaphase, die ich Übergang (G2/MI Übergang) überwacht. Darüber hinaus wurden Centrosome Vervielfältigung, meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Chromosom Blumenstrauß Bildung als Beispiele der zytologischen Strukturen beurteilt, die mit dieser Röhrchen-Squash-Methode beobachtet werden können. Diese Technik kann verwendet werden, um bestimmte Mängel während der Spermatogenese aufzeigen, die durch Mutation oder exogene Störung verursacht werden und trägt somit zum molekularen Verständnis der Spermatogenese.
Introduction
Meiose ist ein komplexes zellulären Ereignis, in dem eine einzelne Runde der DNA-Replikation von zwei aufeinander folgenden Runden der Zellteilung gefolgt. Meiose-spezifische Veranstaltungen müssen während der Anfangsphase der Meiose zu gewährleisten genaue Chromosom Abtrennung koordiniert werden. Diese Ereignisse gehören der Abschluss der homologen Rekombination, Co Ausrichtung der Schwester Kinetochore während die erste meiotische Teilung und der schrittweise Verlust der Cohesin-komplexe, Chiasmata zwischen homologen zu lösen. Präzise Regulation dieser Prozesse ist notwendig, um die Fruchtbarkeit zu erhalten und Chromosom Missegregation Ereignisse zu verhindern, die zu genetischen Entwicklungsstörungen und spontanen Fehlschlag1führen können.
Während die wichtigsten Ereignisse der Meiose in Männchen und Weibchen stattfinden, bestehen erhebliche zeitliche und mechanistische Unterschiede zwischen Spermatogenese und Oogenese2. Zum Beispiel, während der weibliche Meiose, Prophase I tritt während der Embryonalentwicklung und Verhaftungen in der Dictyate-Phase bis zur Pubertät. Im Gegensatz dazu beginnt Spermatogenese um Pubertät und schreitet in Wellen im gesamten Erwachsenenlebens ohne Haftbefehl. Die Unterschiede zwischen männlichen und weiblichen Meiose betont die Notwendigkeit, Methoden zu entwickeln, die speziell zur Beurteilung dieser Prozesse in Spermatozyten und Eizellen gesorgt werden. Derzeit beruht weitgehend meiotic Progression Beurteilung auf der Verwendung von Chromatin breitet sich3,4,5. Während Chromatin breitet sich nützlich für das Studium meiotische Chromosomen sind, Scheitern sie Erhaltung zellulären Integrität, Bewertung von Zellstrukturen wie Spindel Mikrotubuli, Zentrosomen, die Kernhülle und Telomere Anlagen zu verhindern. Live imaging und langfristigen Kultivierung Techniken haben unser Verständnis der weibliche Meiose stark fortgeschritten; ähnliche Konzepte für die gesamte intakten Zelle zu visualisieren sind jedoch weniger häufig für die Untersuchung der Spermatogenese6,7implementiert. Um dynamische Ereignisse in der gesamten männlichen Meiose zu visualisieren, haben wir etablierte Röhrchen Squash Techniken um schnell beurteilen die zytologischen Merkmale entwickeln Maus Spermatozyten8,9angepasst. Die hier beschriebene Methode bewahrt die Integrität der Zelle ermöglicht die Untersuchung von mehreren Zellstrukturen während der verschiedenen Phasen der Spermatogenese.
Diese Röhrchen-Squash-Technik ist eine ganze Zelle Ansatz, der für die Beurteilung der Zellstrukturen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht. Gemeinsamen histologischen Ansätze zur meiotic Progression bei männlichen Mäusen wie Hämatoxylin und Eosin Färbung von Paraffin eingebettet Hoden und immunofluorescent Kennzeichnung von Cryosections visualisieren ermöglichen einen umfassenden Überblick über die meiotische fortschreiten. Aber nicht diese Techniken, Einzelzellen, soweit dies zur detaillierten Analyse der Ereignisse in der gesamten Meiose10,11zu lösen. Alternative Techniken meiotische Prozesse visualisieren beruhen auf bedeutende chemiosmotischen Unterbrechung der Spermatocyte zu isolieren und beheben von nuklearem Material3,4,5. Diese chemischen Behandlungen behindern die Beobachtung der Zelltypen als primären Spermatozyten. Eine kürzlich beschriebene Methode durch Namekawa ermöglichte die Forschungsgemeinschaft, die nukleare Architektur des isolierten Spermatozyten zu bewahren, aber erfordert den Einsatz von einem Cytospin und Accessoires, die möglicherweise nicht ohne weiteres zur Verfügung stehen einige Labors4. Im Gegensatz dazu erfordert die Röhrchen Squash Technik nur Geräte, die in der Regel standard in den meisten Zelle Biologie Labors.
Die hier beschriebene Röhrchen Squash-Methode lässt sich die unterschiedlichen Zelltypen gefunden innerhalb der seminiferous Röhrchen, einschließlich Sertoli-Zellen, Spermatogonien, primäre und sekundäre Spermatozyten und Spermatids visualisieren. Durch die Kopplung dieser Technik mit der in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei jungen Mäusen, ist es möglich, angereicherte Populationen von spermatogenic Zellen zu erhalten, wie sie durch Meiose12 Fortschritte. Dieses Verfahren ermöglicht die detaillierte Analyse der Prozesse innerhalb der gesamten Spermatogenese, wie frühe Prophase Ereignisse, die G2/MI und Metaphase Anaphase Übergänge und Spermiogenesis. Darüber hinaus können Röhrchen Squash Vorbereitungen zur zytologischen Merkmale der Chromosomen (z. B. interchromatid Domains (ICD) und Kinetochore) und Zentrosomen (Centriolen und Pericentriolar Material/Matrizen) zu visualisieren. Die Squash-Methode kann ohne weiteres parallel andere experimentelle Ansätze, wie z.B. Chromatin Spreads und Proteingewinnung durchgeführt werden. Darüber hinaus wurde diese Technik erfolgreich geändert spermatogenic Frischzellen auf Folien für direkte Visualisierung13zu hinterlegen.
Die hier beschriebene Methode beinhaltet eine ganze Zelle seminiferous Röhrchen Squash Technik um den G2/MI Übergang in Wildtyp C57BL/6J Mäuse zu analysieren. Die zytologischen Merkmale des primären Spermatozyten betreten die erste meiotische Teilung wurden mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie, beobachten die meiotische Spindel visualisiert. Dieses vielseitige Technik kann leicht geändert werden, um andere meiotische Stufen und verschiedene Zelltypen zu visualisieren. Die Technik ist auch offen für alternative Visualisierung Strategien, wie DNA und RNA Fisch Ansätze.
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Protocol
Die Verwendung von Mäusen nahm die institutionellen Animal Care und verwenden Ausschuss der Johns Hopkins University. Experimente wurden durchgeführt auf Juvenile (20-26 Tage Post-Partum, Dpp) Mäusen C57BL/6J, unter Ausnutzung der halbsynchrone erste Welle der Spermatogenese. Jedoch kann diese Technik auch mit Erwachsenen Mäusen durchgeführt werden.
1. Präparation und Isolierung von seminiferous Röhrchen Maus
- Bereiten Sie den Fix/Lyse Lösung und Antikörper Verdünnungspuffer (ADB) in Tabelle 1 und Tabelle 2beschrieben.
- Bereiten Sie eine 35-mm-Petrischale mit 3 mL 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (1 X PBS, pH 7,4) und ein weiteres 35-mm-Gericht mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung per Mausklick.
- Opfern Sie die Maus durch zervikale Dislokation oder CO2 Erstickung zu und sprühen Sie ventrale Abdomen mit 70 % Ethanol. Öffnen Sie die Abdominopelvic Hohlraum mit sterile Schere, so dass eine v-förmige Öffnung. Dann entfernen Sie die Hoden durch Ziehen an der epididymal Fettpolster mit Pinzette und nicht zu stören der Tunica Albuginea. Legen Sie die Hoden in einer 35-mm-Petrischale mit 1 X PBS.
Hinweis: Nutzen Sie die erste Welle der Spermatogenese, um ein angereichertes Zellpopulation Interesse14zu beobachten. Bestimmte Stufen der Spermatogenese sind bei verschiedenen Maus ab (Tabelle 3) angereichert. - Entfernen Sie der Hoden Tunica Albuginea durch Punktion des Gewebes mit scharfen spitzen Pinzette und sammeln Sie lose seminiferous Röhrchen. Übertragen Sie die Tubuli auf eine neue 35 mm Petrischale mit 2 mL Lösung/Lyse Lösung.
- Inkubieren Sie die Tubuli in die Verlegenheit/Lyse-Lösung für 5 min bei Raumtemperatur.
2. Vorbereitung von seminiferous Röhrchen
- Bereiten Sie einen Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger umreißen die Ränder der Folie mit einem flüssigen Blocker Stift.
- Gelten Sie 100 µL Fix/Lyse-Lösung für die Mitte der Folie Glas.
- Mit sterilen Pinzette und Schere sanft zu necken auseinander seminiferous Röhrchen. Schneiden Sie lange einzelne Röhrchen Segmente ca. 20 mm Länge.
Hinweis: Strukturen, die empfindlich auf Fixativ über längere Zeit, z. B. die Zentrosomen zu visualisieren, die Tubuli zuerst in 1 X PBS zu trennen, dann direkt Hackfleisch Tubuli auf der Oberfläche des Poly-Lysin-Folien in 100 µL Fix-Lyse Lösung beschichtet. - Übertragen Sie fünf 20 mm lange seminiferous Röhrchen Segmente auf die vorbereiteten Poly-L-Lysin beschichtetes Glas-Folie mit Fix/Lyse Lösung.
- Mit steriler Schere Hackfleisch seminiferous Röhrchen in 1,5 bis 3,0 mm Segmente.
- Verwendung von sterilen Pinzette die Röhrchen Segmente auf dem Objektträger so anordnen, dass kein Gewebe übergreift, und die Tubuli sind gleichmäßig verteilt.
Hinweis: Die optimale Anzahl von Röhrchen Segmente auf einen Glasobjektträger liegt zwischen 20 und 40.
3. Quetschen von seminiferous Röhrchen
- Die Glas-Folie mit verstreuten seminiferous Röhrchen Segmente auf einer Tischplatte zu übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem Labor abwischen zu verlieren Gewebe während der Squash-Schritt.
- Wenden Sie ein Deckglas (22 x 60-1,5 mm) auf den Objektträger und Druck mit der Ferse des Palm für 10-20 Sekunden. Es ist wichtig, genügend Kraft, Spermatozyten von seminiferous Röhrchen zu zerstreuen.
Hinweis: Beobachten Sie die Röhrchen mit einem Dissektion Mikroskop um die quetschen Schritt zu optimieren, so dass alle Röhrchen Segmente gestört werden. - Mit Folie Pinzette, sofort Blitz Einfrieren der Objektträger in einem kleinen Dewar Flüssigkeit N2 für 15 Sekunden, oder bis die Flüssigkeit aufhört zu blubbern. Wenn Immunolabeling umgehend entfernen das Deckglas mit einer geraden Kante Rasierklinge, feine Spitze Zange oder 21-Gauge-Nadel.
Hinweis: Um optimale Ergebnisse zu erzielen, Immunolabel Folien sofort (siehe Schritt 4). Jedoch können an dieser Stelle Folien bei-80 ° C bis zu zwei Wochen lang beibehalten werden. Um die Lebensdauer von Proteinen und Zellstrukturen zu maximieren, sofort lagern Sie die Folien auf Trockeneis oder Übertragung auf-80 ° C Gefrierschrank, und das Deckglas auf der Folie. Wenn Immunolabeling Folien gespeichert, entfernen Sie das Deckglas durch Eintauchen der Folien in flüssigen N2 für 15 Sekunden, wie unter Punkt 3.3 beschrieben.
4. Immunolabeling der berittenen seminiferous Röhrchen
- Tauchen Sie die Folie in 1 x PBS und drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS waschen.
Hinweis: Lassen Sie niemals die Folien zu trocken während der Immunolabeling. - Gelten Sie 1 mL der Antikörper Verdünnungspuffer auf den Objektträger für 1-2 h in eine feuchte Kammer sperren.
- Entfernen Sie die Antikörper Verdünnungspuffer und 100 µL Primärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper in eine feuchte Kammer verdünnt.
Hinweis: Inkubieren Sie für beste Ergebnisse primären Antikörper über Nacht bei 4 ° c Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. Überprüfen Sie und optimieren Sie Primärantikörper15. - Spülen Sie Folien drei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.
Hinweis: Verbessern Waschungen, agitieren Coplin Gläser mithilfe einer kleinen magnetischen Stir Bar und auf einem Teller magnetische Rühren bei niedriger Drehzahl, platzieren oder das Coplin Glas auf eine Tischplatte Mixer bei geringer Geschwindigkeit. - Wenden Sie 100 µL der Sekundärantikörper in Verdünnungspuffer Antikörper für 1 bis 1,5 h in eine feuchte Kammer bei Raumtemperatur verdünnt an. Inkubieren Sie die Folien in einer dunklen Box Foto Ausbleichen der Fluorophor konjugierten Antikörpern zu vermeiden.
Hinweis: Verwenden Sie kleinere Mengen von Antikörpern (z. B. 50 µL) durch die Folie mit einem Deckglas oder Parafilm abdecken. - Spülen Sie Dias zwei Mal für 5 min in ein 50 mL Coplin JAR-Datei mit 1 X PBS.
- Montieren Sie die Folien in Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) und wenden Sie Deckgläsern (22 x 60-1,5 mm).
- Versiegeln der Deckgläsern, die Folien mit klaren Nagellack zu bewahren die Folien und verhindern, dass die Deckgläsern bewegt.
5. Analyse und bildgebenden Röhrchen Squash Vorbereitungen
- Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit automatisierten Bühne, die präzise Bewegung der z-Achse und eine hochauflösende Kamera für Bildaufnahme ermöglicht. Alternativ können Sie einen Laser confocal Mikroskop.
Hinweis: Verwenden Sie alle verfügbaren Hardware und Software für diesen Schritt. Beispielsweise wurden in Abbildung 1 und Abbildung 2 angezeigten Bilder mit ein Zeiss Cell Observer Z1 mit einer ORCA-Flash 4.0 CMOS Kamera verknüpft und analysiert mit dem Zeiss ZEN 2012 blau Edition Image-Software erfasst. - Beurteilen Sie die Folien mit einer 20 X Objektiv zur Bestimmung der Qualität der Squash-Vorbereitung. Gute Qualität Folien haben eine Monolage von Kernen, die gleichmäßig verteilt sind.
Hinweis: Einige Bereiche der Folie können besser sein als andere, ist es sinnvoll, beachten die Koordinaten, wo die besten Regionen der Folie zur weiteren Analyse mit stärkerer Vergrößerung gefunden werden kann. - Verwendung mit höherer Vergrößerung Ziel (z.B. 63 X oder 100 X), Gefangennahme Regionen der Folie eine konsequente Monoschicht der Kerne. Sobald ein Bereich ausgewählt ist, den oberen und unteren Sie Z-Stapel um sicherzustellen, dass alle im Fokus Licht eingefangen wird.
Hinweis: Die optimale Anzahl der Z-Stapel gefangen zwischen der oberen und unteren Grenzwert bezeichnet man in der Regel durch die Bild-Datenerfassungs-Software und unterscheidet sich für jedes Ziel. - Verwenden Sie die Bildverarbeitungs-Software, um eine erweiterte Tiefenbild Fokus zu kompilieren. Die Software verbindet das Licht im Fokus von jedem Z-Stapel und ist wichtig für die optimale Darstellung von Röhrchen Squash Vorbereitungen.
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Representative Results
Hier haben wir die Röhrchen-Squash-Methode verwendet, um vergängliche Zell-Populationen in der Prophase, Metaphase visualisieren ich (G2/MI) Übergang, die angereichert wurden, durch das Ernten von Hoden von juvenile Wildtyp Mäusen durchläuft die erste Welle der Spermatogenese (24 (DPP). Abbildung 1 zeigt repräsentative Bilder von den verschiedenen Phasen der Zelle, die mit den Röhrchen Squash Methode visualisiert werden können. Populationen von Metaphase bereichert ich Spermatozyten wurden visualisiert mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (Abbildung 1A). Wir verwendeten Marker für frühe und späte Meiose I Bühne meiotische fortschreiten. Röhrchen Squash Vorbereitungen waren Immunolabeled mit einem Antikörper gegen das synaptonemalen Komplex Protein, SYCP3, Stadien der Prophase I. Leptotän/Zygotene zu visualisieren und Pachytene/Diplotene Spermatozyten sind in Abbildung 1 bdargestellt. Spermatozyten durchläuft die erste meiotische Teilung können eindeutig identifiziert werden, mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (Abbildung 1A und 1 C). Um späten meiotische Ereignisse zu untersuchen, wurden Röhrchen Kürbisse, Immunolabeled mit Antikörpern gegen die Zellzyklus-Kinase Aurora B (AURKB), die zu den inneren Zentromer während der Metaphase lokalisiert, dann an der Spindel Midzone und Dekolleté Furche während relocalizes Anaphase und Cytokinese, bzw. (Abbildung 1). Zytologischen Merkmale der Chromosomen wurden während der ersten meiotischen Teilung visualisiert. ICDs beobachten, squash Röhrchen Vorbereitungen waren Immunolabeled mit Antikörpern gegen die Meiose-spezifische Alpha-Kleisin-Untereinheit des Cohesin, REC8 (Abbildung 1). Chromosom Dynamik während Anaphase wurden mit Alpha-Tubulin Immunolabelling und DNA-Fleck, DAPI beurteilt. Eine Spermatocyte erfolgreich absolvierten die erste meiotische Teilung zeigt Abbildung 1E, während eine Spermatocyte enthält eine Anaphase-Brücke in Abbildung 1Fdargestellt ist. Mit den Röhrchen Squash Technik, meiotische Spindellänge, können Chromosom Ausrichtung und Segregation gemessen und verglichen zwischen Mutanten und Kontrolle Mäusen.
Der Nutzen dieser Methode zur Visualisierung von zusätzlichen Zellzyklus Übergängen und subzelluläre Strukturen zugeordnet Prophase ich ist in Abbildung 2gezeigt. Während der Leptotän Unterphase der Prophase ist ich, Einleitung der Paarung der Homologen Chromosomen durch dynamische Veränderungen der Telomere Anhänge induzieren Chromosom Clusterbildung mit Blick auf einen einzigen Pol der Kernhülle (NE)16, vermittelt. 17 , 18 , 19 , 20. dieser Konformation, bekannt als das Chromosom "Blumenstrauß" gedacht wird, um die Wahrscheinlichkeit und Häufigkeit der Inter Homolog Interaktionen (Abbildung 2A)zu erhöhen. Einleitung und den Abschluss der Synapsis zwischen Homologen Chromosomen tritt während der Zygotene (Abb. 2 b) und Pachytene Subverteiler (Abbildung 2), bzw. Korrespondenz mit fortschreitenden Ausbreitung von der Chromosom Bouquet. Synapsis und Chromosom Blumenstrauß Dynamik bei juvenilen Mäusen, wir Immunolabeled Röhrchen Squash Vorbereitungen mit Antikörpern gegen SYCP3 und die Zentromere gleichzeitig zu beurteilen und für DNA mit DAPI gefärbt. Maus-Chromosomen sind telocentric, daher Zentromer Immunolabeling zum Erkennen von Änderungen in Telomere NE Anlagen verwendet wurde.
Meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) ist ein Markenzeichen für männliche Meiose, wobei die nicht-homologe X und Y Chromosomen umgehen Checkpoint Aktivierung durch unterziehen Chromosom-weite Phosphorylierung von Histon-Variante H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. Die X-Y-Chromosomenpaar ist transcriptionally zum Schweigen gebracht und aufgeteilt in einer dichten nuklearen Subdomain namens "Sex Körper." Spermatozyten MSCI unterziehen können leicht während der Pachytene und Diplotene Subverteiler identifiziert werden, durch Immunolabeling Röhrchen Squash Vorbereitungen mit Antikörpern zu yH2AX (Ser139). Abb. 2D zeigt eine Spermatocyte an die Pachytene Unterphase Immunolabelled mit Antikörpern gegen yH2AX (Ser139), der Zentromere und gefärbt mit DAPI, die DNA zu visualisieren.
Centrosome Vervielfältigung ist semi-konservativ und tritt während der Prophase, die ich der männliche Meiose nach Abschluss der DNA zu reparieren, um sicherzustellen, dass jedes resultierende Tochterzelle zwei Centriolen (ein Centrosome erbt) nach Zellteilung24,25 . Zentrosomen bestehen aus zwei orthogonal angeordneten Centriolen, verbunden durch eine flexible Linker und sind umgeben von einer amorphen Matrix Proteine bekannt als das Pericentriolar Material/Matrix (PCM)26. Nach Überschneidungen in den Pachytene Unterphase neu gebildet Zentriol Paare voneinander zu lösen und Centrosome Reifung und Migration zu den entgegengesetzten Polen während der Diplotene Phase, Bildung von bipolaren Spindeln zu erleichtern. Eine frühe Diplotene Spermatocyte Disjunktion der neugeformten Zentriol Paare unterziehen wurde durch Immunolabeling Röhrchen Squash Vorbereitungen mit Antikörpern gegen Pericentrin (PCNT), ein Protein-Komponente des PCM und Centrin-3 (CETN3) markieren visualisiert. Centriolen (Abb. 2E). Inszenierung war bestimmt mit Antikörpern gegen SYCP3 und DAPI wurde verwendet, um DNA zu beflecken.
Abbildung 1 : Repräsentative Analyse des meiotischen G2/MI Übergangs mit Röhrchen Squash Vorbereitungen. Röhrchen Squash Vorbereitungen wurden am seminiferous Röhrchen Segmente der C57BL/6J Mäuse im Alter von 24 Dpp durchgeführt. (A) Vertreter Bereich der entwickelnden Spermatozyten Immunolabeled mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (rot), Zentromere (grün) und die DNA färben DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, blau). (B) Wildtyp Röhrchen Kürbisse waren befleckt mit DAPI (blau) sowie Immunolabeled mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (rot) und die seitlichen Element des SC, SYCP3 (grün). (C) wurden Wildtyp Röhrchen Kürbisse mit DAPI (blau) sowie Immunolabeled mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (rot) und dem Zellzyklus-Kinase AURKB () grün gefärbt). Zytologischen Merkmale der Chromosomen wie ICDs und Anaphase Brücken können mit Röhrchen Squash Vorbereitungen visualisiert werden. (D) um ICDs beobachten, prometaphase Spermatozyten wurden Immunolabeled mit Antikörper gegen Zentromere (rot) sowie eine meiotische spezifische Cohesin-Komponente, REC8 (grün) und gefärbt mit DAPI (blau). (E, F) Chromosom Morphologie wurde visualisiert während Anaphase mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin (rot), Zentromere (grün), und das DAPI färben (blau). Eine volle Ergänzung der Spermatozyten entwickeln kann identifiziert werden, mit Hilfe der Röhrchen-Squash-Technik (L/Z, Leptotän/Zygotene Bühne Spermatozyten; P/D, Pachytene/Diplotene Bühne Spermatozyten; Uhr, prometaphase Spermatozyten; M, Metaphase Spermatozyten; A, Anaphase Spermatozyten). Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Beispiele für zusätzliche morphologische Veränderungen und Strukturen verbunden mit meiotischen Prophase Progression bei Männern mit Röhrchen Squash Vorbereitungen. Röhrchen Squash Vorbereitungen wurden am seminiferous Röhrchen durchgeführt, Segmente von Mäusen C57BL/6J im Alter von 12-18 Dpp und waren voller Flecken mit DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, blau), DNA zu kennzeichnen. (A-C) Homolog Synapsis ist für die Bildung und die fortschreitende Ausbreitung des Chromosoms "Blumenstrauß" während der Prophase Fortbewegung gekoppelt. Leptotän (A), Zygotene (B)und Pachytene (C) Bühne Spermatozyten waren Immunolabeled mit Antikörpern gegen SYCP3 (rot) und der Zentromere (grün). (D-E) Röhrchen Squash Vorbereitungen können verwendet werden, um einzigartige zytologische Veränderungen erkennen und Strukturen bei männlichen Prophase ich Fortschreiten einschließlich meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) und Centrosome Doppelarbeit. (D) Pachytene Bühne Spermatozyten MSCI unterzogen wurden mit Antikörper gegen yH2AX nachgewiesen (Ser139) den Geschlecht-Körper (grün, Pfeilspitze), beschriften und Zentromere werden in rot angezeigt. (E) Diplotene Bühne Spermatozyten identifiziert wurden mit Antikörpern gegen SYCP3 (rot) und Zentrosomen (Pfeilspitze) wurden erkannt, mit Antikörpern gegen Centrin-3 (grün) und Pericentrin (Magenta), die Centriolen und die Pericentriolar zu kennzeichnen Material/Matrix, beziehungsweise. Maßstabsleiste = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Artikel | Betrag | Endkonzentration |
| 1 X PBS | 10 mL | 1 x |
| 16 % PFA | 500 ΜL | 0,8 % (V/V) |
| 10 % TritonX-100 mit PBS-Puffer | 100 ΜL | 0,1 % (V/V) |
Tabelle 1: Fix/Lyse Lösung. Beschreibung: Justieren Sie pH bis 9 mit NaOH [50mM]. Wickeln Sie den Container-Lösung in Alufolie vor Licht zu schützen und bei 4 ° c lagern Verwenden Sie nicht die Korrektur/Lyse-Lösung, wenn mehr als eine Woche alt. Solide PFA kann auch verwendet werden, um die Lösung zu machen. Eine Fumehood wird empfohlen, PFA Aussetzung zu vermeiden.
| Artikel | Betrag | Endkonzentration |
| 1 X PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3 % (w/V) |
| Pferd-Serum | 5 mL | 10 % (V/V) |
| 10 % TritonX-100 mit PBS-Puffer | 250 ΜL | 0,05 % (V/V) |
Tabelle 2: Antikörper Verdünnung Puffer (ADB) Rezept. Beschreibung: Store ADB bei 4 ° C oder Einfrieren Aktien bei-20 ° C, wenn größere Mengen machen. ADB kontaminiert werden können, stellen Sie sicher gute aseptische Techniken dienen und die Lösung für Kontamination vor jeder Benutzung zu beurteilen. Bereiten Sie kleinere Aliquote ADB um Kontamination zu minimieren.
| Zelltyp | Zellulärer Prozess | Maus-Alter (Dpp) |
| Leptotän | DNA-DSB-Bildung | 10 - 12 |
| Montage der axialen Elemente | ||
| Zygotene | Initiierung von homologen DSB-Reparatur und synapsis | 12 - 16 |
| Pachytene | Fertigstellung der autosomal DSB-Reparatur | 16 - 20 |
| Reifung der Crossover Rekombinationsereignisse | ||
| Komplette Synapsis zwischen homologen | ||
| Meiotische Geschlechtschromosomen Inaktivierung (MSCI) | ||
| Zentriol Vervielfältigung/Centrosome Reifung | ||
| Diplotene und Diakinesis | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Centrosome Trennung | ||
| Metaphase ich | Spindel-Checkpoint | 22 - 26 |
| Runde Spermatid | Protamin Ersatz | > 24 |
| Akrosom Bildung |
Tabelle 3: in der Nähe von synchronen erste Welle der Spermatogenese bei juvenilen Mäusen. Beschreibung: Bestimmte Stufen der Spermatogenese sind in verschiedenen Entwicklungsstadien juvenile Maus bereichert.
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Discussion
Mäuse haben sich als nützliche Modellorganismus für die zelluläre Ereignisse, die meiotische Fortschreiten in der Spermatogenese regieren zu studieren. Weiter, es ist notwendig, kümmerten sich um die Untersuchung der Spermatogenese, weil viele Veranstaltungen, wie z. B. Ausstieg aus meiotischen Prophase ich Werkzeuge zu entwickeln, sind sexuell dimorphen. Dieses Protokoll beschreibt eine seminiferous Röhrchen Squash Methode zur Visualisierung und Studium der verschiedenen Phasen der Maus Spermatogenese. Diese Methode zellulären Integrität bewahrt und dadurch ermöglicht detaillierte Analysen der nuklearen und zytoplasmatischen Strukturen. Die repräsentativen Ergebnisse in dieser Studie dargestellten demonstrieren die Nützlichkeit dieses Protokoll bei der Beurteilung der primären Spermatozyten meiotische Fortschreiten zu unterziehen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll auch verwendet werden, andere zelluläre Prozesse während der Spermatogenese, einschließlich Proliferation und Differenzierung von Spermatogonien und Phasen des Spermiogenesis27,28zu studieren. Die beschriebenen Verfahren sind im Rahmen von zuvor beschriebenen Röhrchen Squash Techniken8,9angepasst werden. Dieses Protokoll ist jedoch die erste ausführliche Anleitung, die alle Reagenzien und Schritte erforderlich sind, erhalten die Tubuli zur Visualisierung einzelner Zellen über Fluoreszenz-Mikroskopie. Darüber hinaus haben wir Bilder präsentiert, auf zusätzliche zelluläre Funktionen, darunter die Zentriol und das Telomer-Bouquet, die mit der Technik visualisiert werden kann.
Gibt es ein paar technische Elemente, die für die Optimierung von Röhrchen Squash Vorbereitungen sind. Erstens muss man die richtige Menge an Kraft für Glas-Deckglas gelten. Wenn genügend Kraft angewendet wird Folien mit paar adhärente Zellen erzeugen, wie die meisten Zellen innerhalb der seminiferous Röhrchen bleiben. Zweitens muss man die Hoden Material in die Verlegenheit/Lyse-Lösung für die entsprechende Zeitspanne inkubieren. In der Regel Fixierung auf 5 Minuten beschränkt werden sollte, aber eine Auswahl zwischen 5 und 15 min ist akzeptabel. Tubuli, die über einen längeren Zeitraum behoben werden schwer zu manipulieren und zu schlechten Ergebnissen führen. Es ist jedoch möglich, die Inkubationszeit zu erweitern, durch die Verringerung der Konzentration von PFA. Zum Beispiel Prozent PFA auf 0,5 % absenken würde erhöhte Inkubationszeiten bei der Fehlerbehebung/Lyse-Lösung ermöglichen. In der Methode, die wir vorgestellt haben, treten die Permeabilisierung und Fixierung Schritte gleichzeitig, aber diese Schritte durchgeführt werden können, einer nach dem anderen, bzw.. Trennt die Permeabilisierung und Fixierung Schritte kann helfen, Verringerung der zytoplasmatischen Hintergrundsignal. Variation der Fixierung und/oder Permeabilisierung Strategien kann auch getestet werden, um die Bedingungen für die Bewertung einer bestimmten subzelluläre Struktur oder Antikörper zu optimieren. Zum Beispiel Visualisierung von centrosomal und Spindel Proteine können verbessert werden, indem unter Verwendung von Methanol anstelle von PFA29,30,31. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, juvenile Mäuse verwenden, die sind durch die erste Welle der Spermatogenese (ca. 10-26 Dpp) um gezielt voran und selten meiotische zelluläre Ereignisse12robust zu visualisieren. Alternativ ist es möglich, Bühne-spezifische meiotische Zellen von Erwachsenen Mäusen zu isolieren, durch die Beobachtung der Lichtabsorption Muster innerhalb von seminiferous Röhrchen32. Angesichts den asynchronen Zyklus der Spermatogenese bei Erwachsenen Mäusen, kann jedoch selten meiotische Ereignisse im Detail analysieren schwierig sein. Diese Einschränkung überwunden werden durch die Injektion von Mäusen mit Bisdichloroacetyldiamine, 18.446 zu gewinnen, welche Blöcke Vitamin A-Stoffwechsel und spermatogonial Differenzierung33anhält. Nach der Behandlung mit gewinnen 18.466, Wiederaufnahme der Spermatogenese erfolgt synchron, große Mengen von angereicherten Keim Zell-Populationen von einem ausgereiften Tier34nachgeben. Diese Synchronisation Strategie kann vor der Röhrchen-Squash-Technik verwendet werden, um die Unterschiede zwischen den ersten halbsynchronen Wellen der Spermatogenese zu untersuchen, die in den Erwachsenen35,36, auftreten 37. Darüber hinaus Korrelation zwischen väterlichen Altern und Aneuploidie könnte auch bewertet werden die Röhrchen Squash Methode gewinnen 18.466 Synchronisation und Beurteilung Chromosom Segregation mit.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann diese Methode in Verbindung mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie verwendet werden, um Zellen in den verschiedenen Stadien der Spermatogenese zu beobachten. Im weiteren Sinne angewandt, diese Technik kann auch zur Sub-Populationen von Spermatogonien, Spermatozyten und Spermatids zu bewerten und kann angepasst werden, um eine Vielzahl von Prozessen während der Spermatogenese zu studieren. Dieser Ansatz wurde für live Cell imaging von Spermatozyten und geändert zur Durchführung einer Vielzahl von zellulären und biochemische Studien38,39,40. Die Röhrchen-Squash-Technik wurde verwendet für Maus und Ratte seminiferous Röhrchen, was darauf hindeutet, dass es ohne weiteres auf andere Säugetiere Systeme, einschließlich menschliche40angewendet werden soll. Diese Technik kann helfen die zellulären Störungen zu definieren, die zu Unfruchtbarkeit und Sperma Aneuploidie führen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIGMS (R01GM11755), P.W.J und ein Training Stipendium Stipendium vom National Cancer Institute (NIH) (CA009110), S.R.W. und j.h.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
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