Summary
El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.
Abstract
La progresión meiótica en los hombres es un proceso que requiere la acción concertada de una serie de eventos celulares altamente reguladas. Errores que ocurren durante la meiosis pueden conducir a la infertilidad, la pérdida del embarazo o defectos genéticos. Comenzando en el inicio de la pubertad y continúa a lo largo de la edad adulta, ondas continuas semisincrónico de espermatocitos sufren espermatogénesis y en última instancia forman espermatozoides haploides. La primera ola de espermatocitos de ratón en iniciación meiótica aparecen en día 10 post parto (dpp 10) y se liberan en el lumen de los túbulos seminíferos como espermatozoides maduros en dpp 35. Por lo tanto, es ventajoso utilizar ratones dentro de esta ventana de tiempo del desarrollo con el fin de obtener poblaciones altamente enriquecidas de interés. Análisis de etapas rara de la célula es más difícil en los ratones más viejos debido al aporte de las ondas espermatogénica sucesivas, que incrementan la diversidad de las poblaciones celulares dentro de los túbulos. El método descrito aquí es una técnica fácilmente implementada para la evaluación citológica de las células que se encuentran dentro de los túbulos seminíferos de ratones, incluyendo espermatogonios, espermatocitos y espermátides. La técnica de squash túbulo mantiene la integridad de las células germinales masculinas aisladas y permite la examinación de estructuras celulares que no se visualizan fácilmente con otras técnicas. Para demostrar las posibles aplicaciones de esta técnica de squash del túbulo, montaje del huso fue supervisada en espermatocitos progresar a través de la profase metafase de la transición (la transición G2/MI). Además, duplicación del centrosoma, inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) y formación del cromosoma ramo fueron evaluados como ejemplos de las estructuras citológicas que pueden ser observadas con este método de squash del túbulo. Esta técnica puede utilizarse para localizar defectos específicos durante la espermatogénesis que son causados por mutación o perturbación exógena, y por lo tanto, contribuye a la comprensión molecular de la espermatogénesis.
Introduction
La meiosis es un evento celular complejo en el que una sola ronda de replicación del ADN es seguida por dos sucesivas rondas de división celular. Varios eventos de meiosis específicos deben coordinarse durante las etapas iniciales de la meiosis para la segregación cromosómica precisa. Estos eventos incluyen la terminación de la recombinación homóloga, la orientación de la hermana cinetocoros durante la primera división meiótica y la pérdida gradual de los complejos de cohesina para resolver quiasmas entre homólogos. Regulación precisa de estos procesos es necesario para mantener la fertilidad y prevenir eventos de protooncogenes del cromosoma que pueden llevar a trastornos del desarrollo genéticos y aborto espontáneo1.
Mientras que los eventos clave de la meiosis ocurren en hombres y mujeres, existen diferencias significativas temporales y mecanicistas entre espermatogénesis y ovogénesis2. Por ejemplo, durante la meiosis femenina, profase I se produce durante el desarrollo embrionario y las detenciones en la etapa de dictyate hasta pubertad. Por el contrario, espermatogénesis comienza en la pubertad y progresa en oleadas a lo largo de la vida adulta sin detención. Las diferencias entre la meiosis masculina y femenina destaca la necesidad de desarrollar métodos que son atendidos específicamente hacia la evaluación de estos procesos en espermatocitos y ovocitos. En la actualidad, evaluar la progresión meiótica en gran parte se basa en el uso de la cromatina se separa3,4,5. Mientras que se separa de la cromatina es útil para estudiar los cromosomas meiotic, logran preservar la integridad celular, impidiendo la evaluación de estructuras celulares como los microtúbulos del huso, centrosomas, la envoltura nuclear y los accesorios de telómeros. Imágenes en vivo y técnicas de cultivo a largo plazo han avanzado grandemente nuestra comprensión de la meiosis femenina; enfoques similares para visualizar toda la célula intacta, sin embargo, se ejecutan con menos frecuencia para el estudio de la espermatogénesis6,7. Para poder visualizar eventos dinámicos a lo largo de la meiosis masculina, nos hemos adaptado técnicas de squash túbulo establecidos para evaluar rápidamente las características citológicas de desarrollo ratón espermatocitos8,9. El método descrito aquí mantiene la integridad de la célula, lo que permite el estudio de múltiples estructuras celulares durante las diferentes etapas de la espermatogénesis.
Esta técnica de squash del túbulo es un acercamiento entero de la célula, que permite la evaluación de las estructuras celulares mediante microscopia de la inmunofluorescencia. Métodos histológicos comunes para visualizar la progresión meiótica en ratones machos como haematoxylin y eosina de testículos de embebido de parafina y etiquetado inmunofluorescente de cryosections permiten una amplia visión de la progresión meiótica. Sin embargo, estas técnicas no logran resolver las células en la medida necesaria para el análisis detallado de los eventos que ocurren durante la meiosis10,11. Técnicas alternativas para visualizar procesos de meiosis dependen quimioautótrofos significativa interrupción el espermatocito a aislar y fijar materiales nucleares3,4,5. Estos tratamientos químicos impiden la observación de tipos celulares distintos de espermatocitos primarios. Un método recientemente descrito por Namekawa ha permitido a la comunidad de investigación para preservar la arquitectura nuclear de espermatocitos aislados, pero requiere el uso de un cytospin y accesorios que no pueden ser fácilmente disponibles en algunos laboratorios4. En cambio, la técnica de squash del túbulo sólo requiere de equipo que es generalmente estándar en la mayoría de los laboratorios biología celular.
El método de squash túbulo descrito aquí puede utilizarse para visualizar los tipos de células diversas dentro del túbulo seminífero, incluyendo células de sertoli, espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios y espermátidas. Por esta técnica de acoplamiento con la primera ola cerca-síncrono de la espermatogénesis de ratones jóvenes, es posible obtener poblaciones enriquecidas de células espermatogénica a medida que avancen a través de meiosis12. Este proceso permite el análisis detallado de los procesos a lo largo de la espermatogénesis, como eventos tempranos de la profase y la metafase a anafase transiciones y espermiogénesis y G2/MI. Además, preparados de calabaza del túbulo pueden utilizarse para visualizar las características citológicas de los cromosomas (por ejemplo dominios interchromatid (ICDs) y cinetocoros) y centrosomas (centriolos y el material pericentriolar/matrices). El método de la calabaza se puede realizar fácilmente en paralelo con otras aproximaciones experimentales, tales como extensiones de la cromatina y extracción de proteínas. Además, esta técnica se ha modificado con éxito para depositar espermatogénica células vivas en las diapositivas para la visualización directa de13.
El método aquí descrito requiere una técnica de squash de túbulos seminíferos células enteras para analizar la transición G2/MI en ratones C57BL/6J de tipo salvaje. Las características citológicas de espermatocitos primarios entrando en la primera división meiótica se visualizaron con microscopia de la inmunofluorescencia para observar el huso meiótico. Esta versátil técnica puede modificarse fácilmente para visualizar otras etapas meióticas y diferentes tipos de células. La técnica también es susceptible a las estrategias de visualización alternativa, tales como ADN y ARN pescado enfoques.
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Protocol
El uso de ratones fue aprobado por el cuidado institucional de Animal y Use Comité de la Universidad Johns Hopkins. Los experimentos fueron realizados en juveniles (20-26 días post parto, dpp) ratones C57BL/6J, tomando ventaja de la primera onda semi sincrónica de la espermatogénesis. Sin embargo, esta técnica puede realizarse también utilizando ratones adultos.
1. disección y aislamiento de los túbulos seminíferos ratón
- Preparar el fix/solución y anticuerpo dilución tampón de lisis (Bad) se describe en la tabla 1 y tabla 2.
- Preparar un plato de Petri de 35 mm con 3 mL de 1 x de tampón fosfato salino (1 x PBS, pH 7,4) y otro plato de 35 mm con 2 mL de solución de lisis/fix por ratón.
- Sacrificar el ratón mediante dislocación cervical o CO2 asfixia y rociar el abdomen ventral con etanol al 70%. Abrir la cavidad de abdominopelvic con tijeras estériles, haciendo una abertura en forma de V. A continuación Quite los testículos en la almohadilla grasa Epididimal con unas pinzas y evitar molestar a la túnica albugínea. Coloque los testículos en un plato de Petri de 35 mm que contiene 1 x PBS.
Nota: Utilizar la primera onda de la espermatogénesis para observar una población de celulares enriquecidos de interés14. Etapas específicas de la espermatogénesis se enriquecen en edades de ratón diferente (tabla 3). - Retire la testicular túnica albugínea pinchando el tejido con pinzas con punta afiladas y recoger los túbulos seminíferos sueltos. Transferencia de los túbulos para un nuevo plato de Petri de 35 mm que contiene 2 mL de solución de lisis/fix.
- Incubar los tubos en la solución de fix/lisis durante 5 min a temperatura ambiente.
2. preparación de los túbulos seminíferos
- Preparar un portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina delineando los bordes de la diapositiva con un lápiz líquido bloqueador.
- Aplicar 100 μl de solución de lisis/fix para el centro de la diapositiva de cristal.
- Utilizando pinzas estériles y tijeras tease suavemente aparte los túbulos seminíferos. Corte de túbulo largo individual segmentos aproximadamente 20 mm de longitud.
Nota: Para visualizar estructuras que son sensibles a la exposición prolongada de fijadores, como los centrosomas, los túbulos se separan primero en PBS 1 x, luego picar directamente los túbulos en la superficie de los portaobjetos de poli-lisina revestido en 100 μl de solución de lisis fix. - Transferencia cinco segmentos del túbulo seminífero larga de 20 mm a la diapositiva preparado vidrio revestido poly-L-lisina que contiene solución de lisis/fix.
- Utilizando tijeras estériles picada túbulos seminíferos en segmentos de 1.5 a 3.0 mm.
- Utilizando pinzas estériles organizar los segmentos del túbulo en el portaobjetos de cristal para que se superponga con ningún tejido, y los túbulos se distribuyen uniformemente.
Nota: El número óptimo de segmentos del túbulo en un portaobjetos de vidrio es entre 20 y 40.
3. aplastamiento de los túbulos seminíferos
- Transferencia de lo portaobjetos de vidrio que contiene segmentos del túbulo seminífero dispersos sobre una mesa. Retire el exceso de líquido con un laboratorio para limpiar para evitar la pérdida de tejido durante el paso de la calabaza.
- Aplica un cubreobjetos (22 x 60-1.5 mm) sobre el portaobjetos de cristal y aplicar presión con el talón de la Palma por 10-20 segundos. Es importante aplicar suficiente fuerza para dispersar a los espermatocitos de los túbulos seminíferos.
Nota: Observar los túbulos usando un microscopio de disección con el fin de optimizar el paso squashing para que todos los segmentos del túbulo se interrumpen. - Con unas pinzas de la diapositiva, inmediatamente flash congele el portaobjetos de cristal en un dewar pequeño de líquido N2 durante 15 segundos o hasta que el líquido deja de burbuja. Si inmunomarcación inmediatamente, quitar el cubreobjetos con una cuchilla de filo recto, finas pinzas de punta o aguja de calibre 21.
Nota: Para obtener resultados óptimos, immunolabel las diapositivas inmediatamente (ver paso 4). Sin embargo, en este punto diapositivas pueden conservarse a-80 ° C hasta por dos semanas. Para maximizar la vida útil de las proteínas y estructuras celulares, guardar las diapositivas en hielo seco o transferencia a un congelador de-80 ° C y mantener el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Cuando inmunomarcación almacena diapositivas, quitar el cubreobjetos sumergiendo los portaobjetos en líquido N2 durante 15 segundos, como se describe en el paso 3.3.
4. inmunomarcación de túbulos seminíferos montados
- Sumerja el portaobjetos en 1 x PBS y lavado tres veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS.
Nota: Nunca deje que los portaobjetos a completamente seco durante la inmunomarcación. - Aplicar 1 mL de tampón de dilución del anticuerpo sobre el portaobjetos de cristal bloquea durante 1-2 h en una cámara humidificada.
- Retirar el tampón de dilución de anticuerpo y aplicar 100 μl de anticuerpo primario diluido en tampón de dilución de anticuerpo en una cámara humidificada.
Nota: Para mejores resultados, incuban anticuerpos primarios durante la noche a 4 ° C. Utilizar volúmenes más pequeños del anticuerpo (por ejemplo 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm. Validar y optimizar anticuerpos primarios15. - Enjuagar el portaobjetos tres veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS.
Nota: Para mejorar el lavado, agitar frascos Coplin utilizando una barra de agitación magnética pequeña y colocar en una placa de agitación magnética a baja velocidad o coloque la jarra de Coplin sobre una mesa mezcladora a baja velocidad. - Aplicar 100 μl del anticuerpo secundario diluido en tampón de dilución de anticuerpos de 1 a 1.5 h en una cámara de vapor a temperatura ambiente. Incubar los portaobjetos en una caja oscura para evitar foto blanqueo de anticuerpos conjugado fluoróforo.
Nota: Utilizar volúmenes más pequeños del anticuerpo (por ejemplo 50 μL) al cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos o parafilm. - Enjuague las diapositivas dos veces durante 5 min en una jarra de Coplin de 50 mL que contiene 1 x PBS.
- Montar las diapositivas de medio de montaje que contiene 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1.5 μg/mL) y aplicar el cubreobjetos (22 x 60-1.5 mm).
- Sellar el cubreobjetos a las diapositivas con el pulimento de clavo claro preservar las diapositivas y evitar que el cubreobjetos se mueva.
5. Análisis y proyección de imagen del túbulo squash preparados
- Usar un microscopio de epifluorescencia con etapa automatizada que permite un movimiento preciso del eje z y una cámara de alta resolución de captura de imagen. Como alternativa, utilizar un microscopio confocal de láser.
Nota: Utilice cualquier software y hardware disponible para este paso. Por ejemplo, las imágenes mostradas en la figura 1 y figura 2 fueron capturadas usando una célula Zeiss observador Z1 vinculado a una ORCA-Flash 4.0 CMOS de la cámara y analizados con el software de imagen edición de Zeiss ZEN 2012 azul. - Evaluar las diapositivas con objetivo 20 X para determinar la calidad de la preparación de calabaza. Diapositivas de buena calidad tienen una monocapa de núcleos que se distribuyen uniformemente.
Nota: Algunas secciones de la diapositiva pueden ser mejores que otros, es útil tener en cuenta las coordenadas de donde se pueden encontrar las mejores zonas de la diapositiva para su posterior análisis con aumento mayor. - Usando el más alto objetivo de ampliación (por ejemplo, 63 X o 100 X), captura de regiones de la diapositiva que tiene una monocapa coherente de núcleos. Una vez que se selecciona una región, fijar la parte superior e inferior Z-pilas para asegurarse de que toda la luz en foco es capturada.
Nota: El número óptimo de Z-pilas capturado entre el límite superior e inferior es señalado generalmente por el software de adquisición de imagen y es diferente para cada objetivo. - Utilice el software de procesamiento de imágenes para compilar una imagen enfocada de profundidad extendida. El software combina la luz del foco de cada pila de Z y es esencial para la proyección de imagen óptima de preparados de calabaza del túbulo.
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Representative Results
Aquí, hemos utilizado el método de squash del túbulo para visualizar las poblaciones de la célula transitoria en la profase metafase I (G2/MI) transición, que se enriquecieron con la cosecha de los testículos de los ratones de tipo salvaje menores sometidos a la primera onda de la espermatogénesis (24 DPP). La figura 1 muestra imágenes representativas de las diferentes etapas de la célula que pueden visualizarse mediante el método de squash del túbulo. Enriquecido las poblaciones de metafase I espermatocitos fueron visualizados usando los anticuerpos contra alfa-tubulina (figura 1A). Utilizamos marcadores temprana y tardía de la meiosis I de la progresión meiótica de la etapa. Preparaciones de squash túbulo immunolabeled con un anticuerpo a la proteína del Complejo Sinaptonémico, SYCP3, para visualizar las etapas de la profase i de leptoteno/anfiteno y paquiteno/diploteno espermatocitos se muestran en la figura 1B. Espermatocitos que experimentan la primera división meiótica pueden identificarse claramente usando los anticuerpos contra alfa-tubulina (figura 1A y C 1). Para estudiar los últimos acontecimientos meiotic, túbulo calabazas fueron immunolabeled usando los anticuerpos contra el ciclo celular quinasa Aurora B (AURKB), que se localiza en el interior del centrómero durante la metafase, entonces relocalizes al surco del huso midzone y escote durante anafase y citocinesis, respectivamente (figura 1). Características citológicas de los cromosomas se visualizan durante la primera división meiótica. Para observar el ICDs, túbulo squash preparaciones immunolabeled usando los anticuerpos contra la subunidad alfa específica de meiosis-kleisin de cohesinas, REC8 (figura 1). Dinámica del cromosoma durante la anafase se evaluaron usando immunolabelling alfa-tubulina y la tinción de ADN, DAPI. Un espermatocito completar la primera división meiótica se muestra en la Figura 1E, mientras que un espermatocito que contiene un puente de anafase se muestra en la Figura 1F. Utilizando la técnica de squash del túbulo, longitud del huso meiótico, segregación y la alineación del cromosoma pueden ser medidos y comparados entre ratones mutantes y control.
La utilidad de este método para la visualización de transiciones adicionales de ciclo celular y estructuras subcelulares asociadas con la profase se demostró en la figura 2. En el subestadio de leptoteno de la profase I, iniciación de apareamiento de cromosomas homólogos es mediada por cambios dinámicos en accesorios de telómero para inducir la formación de clusters de cromosoma frente a un solo poste de la envoltura nuclear (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. esta conformación, conocida como el cromosoma "bouquet" se piensa para aumentar la probabilidad y la frecuencia de las interacciones entre homólogo (figura 2A). Iniciación y terminación de sinapsis entre cromosomas homólogos ocurre durante la anfiteno (figura 2B) y subetapas de paquiteno (figura 2), respectivamente, correspondiente con la progresiva dispersión de las ramo de cromosoma. Al mismo tiempo evaluar dinámica de ramo synapsis y cromosoma en ratones jóvenes, que immunolabeled túbulo squash las preparaciones con anticuerpos SYCP3 y los centrómeros y teñidos para DNA usando DAPI. Cromosomas de ratón son telocéntricos, por lo tanto centrómero inmunomarcación fue utilizada para detectar cambios en los accesorios NE telómero.
Inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) es un sello único a la meiosis masculina, por el que la X no homóloga y cromosomas Y eluden la activación del checkpoint por sufrir fosforilación de todo el cromosoma de la variante de la histona H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. El par de cromosomas X-Y es transcripcionalmente silenciado y compartimentado en un subdominio nuclear densa llamado el "cuerpo de sexo". Espermatocitos que MSCI se pueden identificar fácilmente durante el paquiteno y diploteno subestadios por preparaciones de squash túbulo immunolabeling con los anticuerpos a yH2AX (Ser139). Figura 2D representa un espermatocito en el paquiteno substage immunolabelled con anticuerpos contra yH2AX (Ser139), los centrómeros y teñidas con DAPI para visualizar el ADN.
Duplicación del centrosoma es semi conservadora y ocurre durante la profase que i de meiosis masculina sobre la terminación de ADN reparación para asegurar que cada célula hija resultante hereda dos centriolos (un centrosoma) tras la división celular24,25 . Centrosomas consisten de dos centriolos dispuestos ortogonalmente por un linker flexible y están rodeadas por una matriz amorfa de proteínas conocidas como la pericentriolar material y matrix (PCM)26. Después de la duplicación en la platina de paquiteno, recién formado centriolo pares desconectar uno del otro y se someten a maduración del centrosoma y la migración hacia polos opuestos durante la etapa de diploteno para facilitar la formación de ejes bipolares. Un espermatocito diploteno temprano sometidos a disyunción del par de centriolos recién formado fue visualizado por los preparativos de squash de túbulo immunolabeling con los anticuerpos contra pericentrin (PCNT), un componente de proteína de la PCM y Centrin-3 (CETN3) para marcar centriolos (Figura 2E). Puesta en escena se determinó utilizando anticuerpos contra SYCP3, y DAPI se utilizó para teñir ADN.
Figura 1 : Análisis representativo de la transición G2/MI meiotic usando preparaciones de squash túbulo. Preparaciones de squash del túbulo se realizaron en los segmentos del túbulo seminífero de C57BL/6J ratones envejecidos 24 dpp. (A) representante de campo de desarrollo espermatocitos immunolabeled con anticuerpos contra los centrómeros (rojos), alfa-tubulina (verde) y el ADN tinción DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, azul). (B) calabazas de tipo túbulo fueron teñidos con DAPI (azul) así como immunolabeled con anticuerpos contra alfa-tubulina (rojo) y el elemento lateral de la SC, SYCP3 (verde). (C) calabazas de tipo túbulo fueron teñidos con DAPI (azul) así como immunolabeled con anticuerpos contra alfa-tubulina (rojo) y el ciclo celular quinasa AURKB (verde). Características citológicas de los cromosomas como desfibriladores cardioversores implantables y anafase puentes se pueden visualizar usando preparaciones de squash del túbulo. (D) para observar el ICDs, espermatocitos Prometafase immunolabeled con anticuerpos contra los centrómeros (rojo) así como un componente de la cohesina específicos meiótica, REC8 (verde) y teñidas con DAPI (azul). (E, F) Morfología del cromosoma fue visualizada durante anafase usando los anticuerpos contra los centrómeros (rojos), alfa-tubulina (verde), y el DAPI (azul) de la mancha. Un complemento completo de desarrollo de espermatocitos puede ser identificado usando la técnica del squash del túbulo (L/Z, espermatocitos de la etapa del leptoteno/anfiteno; P/D, espermatocitos de la fase de paquitena/diploteno; P.M., Prometafase espermatocitos; M, espermatocitos de metafase; A, espermatocitos anafase). Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Ejemplos de otros cambios morfológicos y estructuras asociadas con la progresión de la profase meiótica en varones usando preparaciones de squash túbulo. Preparaciones de squash del túbulo se realizaron en túbulos seminíferos segmentos de ratones C57BL/6J de edad 12-18 dpp y fueron teñidos con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, azul) al ADN de la etiqueta. (A-C) Synapsis homólogo está acoplado a la formación y la progresiva dispersión del cromosoma "bouquet" durante la progresión de la profase. Leptoteno (A), anfiteno (B)y espermatocitos de paquiteno (C) etapa fueron immunolabeled con anticuerpos contra SYCP3 (rojo) y los centrómeros (verde). (D-E) Preparaciones de squash del túbulo puede utilizarse para detectar cambios citológicos únicas y estructuras durante la profase masculino y progresión como la inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) y duplicación del centrosoma. (D) espermatocitos de fase paquiteno en MSCI fueron detectadas usando anticuerpos contra yH2AX (Ser139) para etiquetar el cuerpo sexo (flecha verde), y los centrómeros se muestran en rojo. (E) diploteno espermatocitos etapa fueron identificados usando los anticuerpos contra SYCP3 (rojo) y centrosomas (flecha) fueron detectadas usando anticuerpos contra Centrin-3 (verde) y Pericentrin (magenta) para etiquetar los centriolos y la pericentriolar matriz de material, respectivamente. Barra de escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Artículo | Cantidad | Concentración final |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| PFA 16% | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 en PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabla 1: solución de Fix/lisis. Descripción: Ajustar el pH a 9 con NaOH [50-mM]. Envuelva el envase de la solución en papel de aluminio para proteger de la luz y almacenar a 4 ° C. No use la solución de fix/lisis si más de una semana de edad. PFA sólido puede utilizarse también para hacer la solución. Se recomienda utilizar un fumehood para evitar la exposición de la PFA.
| Artículo | Cantidad | Concentración final |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5 g | 3% (w/v) |
| Suero de caballo | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 en PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabla 2: receta del anticuerpo dilución buffer (ADB). Descripción: Tienda ADB a 4 ° C o las acciones de congelación a-20 ° C si hacer cantidades más grandes. Bad puede contaminarse, asegúrese de buenas técnicas asépticas se utilizan y evaluación la solución para la contaminación antes de cada uso. Preparar pequeñas alícuotas de ADB para minimizar la contaminación.
| Tipo de la célula | Proceso celular | Edad de ratón (dpp) |
| Leptoteno | Formación de DNA OSD | 10 - 12 |
| Conjunto de elementos axiales | ||
| Anfiteno | Iniciación de homólogo reparación DSB y synapsis | 12 - 16 |
| Paquiteno | Terminación de un autosoma reparación DSB | 16 - 20 |
| Maduración de los eventos de recombinación de crossover | ||
| Sinapsis completa entre homólogos | ||
| Inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) | ||
| Maduración de duplicación y el centrosoma del centriolo | ||
| Diploteno y diacinesis | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Separación centrosoma | ||
| Metafase I | Puesto de control del huso | 22 - 26 |
| Spermatid redondo | Reemplazo de protamina | > 24 |
| Formación del acrosoma |
Tabla 3: cerca de sincrónico primera onda de la espermatogénesis de ratones jóvenes. Descripción: Etapas específicas de la espermatogénesis son enriquecidas en diferentes etapas de desarrollo del ratón juvenil.
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Discussion
Ratones han demostrado para ser un organismo modelo útil para estudiar los eventos celulares que gobiernan la progresión meiótica durante la espermatogénesis. Además, es necesario desarrollar herramientas independientes para el estudio de la espermatogénesis debido a muchos eventos, tales como salir de la profase meiótica I, presentan dimorfismo sexual. Este protocolo describe un método de squash del túbulo seminífero de visualización y estudio de las diferentes etapas de la espermatogénesis del ratón. Este método conserva la integridad celular y así permite análisis detallados de las estructuras citoplasmáticas y nucleares. Los resultados representativos en este estudio demuestran la utilidad de este protocolo en la evaluación de los espermatocitos primarios que experimentan progresión meiótica. Por otra parte, este protocolo también puede utilizarse para el estudio de otros procesos celulares durante la espermatogénesis, como proliferación y diferenciación de las espermatogonias y fases de la espermiogénesis27,28. Los métodos descritos están adaptadas del túbulo descrita squash técnicas8,9. Sin embargo, este protocolo es la primera guía detallada, cubriendo todos los reactivos y pasos necesarios, desde la obtención de los túbulos para visualizar las células mediante microscopía de fluorescencia. Además, hemos presentado imágenes adicionales características celulares, incluyendo el centriolo y el ramo de telómeros, que puede ser visualizado con la técnica.
Existen algunos elementos técnicos que son clave para optimizar la preparación de calabaza del túbulo. En primer lugar, uno debe aplicar la cantidad adecuada de fuerza para el cubreobjetos de vidrio. Si no se aplican suficiente fuerza producirá diapositivas con pocas células adherentes, como la mayoría de las células se mantendrá dentro de los túbulos seminíferos. En segundo lugar, se debe incubar el material del testículo en la solución de fix/lisis para la longitud adecuada de tiempo. Generalmente, la fijación debe limitarse a 5 min, pero es aceptable un rango de entre 5 y 15 min. Túbulos que se hayan fijado durante un tiempo prolongado será difíciles de manipular y pobres resultados. Sin embargo, es posible, prolongar el tiempo de incubación, reduciendo la concentración de PFA. Por ejemplo bajar la PFA por ciento al 0,5% permitiría tiempos de incubación mayor en la solución de fix/lisis. En el método que hemos presentado, los pasos de permeabilización y la fijación producen simultáneamente, sin embargo se pueden realizar estos pasos uno tras otro, respectivamente. Separa los pasos de permeabilización y fijación puede ayudar a reducir los niveles de señal de fondo citoplasmático. Variación de estrategias de fijación y permeabilización puede probarse también para optimizar las condiciones para la evaluación de una estructura subcelular específico o anticuerpos. Por ejemplo, visualización de se y las proteínas del huso pueden mejorarse mediante el uso de metanol en lugar de PFA29,30,31. Además, es beneficioso utilizar ratones juveniles que están progresando a través de la primera onda de la espermatogénesis (aproximadamente 26 10 dpp) a fin de específicamente y robusta visualizar eventos celular meiótica infrecuente12. Alternativamente, es posible aislar células meióticas etapa específica de ratones adultos, observando el patrón de absorción de la luz dentro de los túbulos seminíferos32. Dado el ciclo asincrónico de la espermatogénesis de ratones adultos, sin embargo, analizar acontecimientos meiotic raros en detalle puede ser difícil. Esta limitación puede ser superada mediante la inyección a ratones con bisdichloroacetyldiamine, ganar 18.446, que metabolismo de vitamina A de bloques y detiene la diferenciación de las espermatogonias33. Después del tratamiento con ganar 18.466, reanudación de la espermatogénesis se producen sincrónicamente, produciendo grandes cantidades de poblaciones de la célula de germen enriquecido de un animal maduro34. Esta estrategia de sincronización puede utilizarse antes de la técnica de squash del túbulo para investigar las diferencias entre las primeras oleadas semi sincrónicas de la espermatogénesis, a los que ocurren en el adulto35,36, 37. Además, correlación entre envejecimiento paternal y aneuploidía puede también evaluarse usando 18.466 ganar sincronización y evaluar la segregación cromosómica con el método de squash del túbulo.
En Resumen, este método puede utilizarse en conjunción con la microscopia de la inmunofluorescencia para observar células en diferentes etapas de la espermatogénesis. Aplicado en términos más generales, esta técnica puede utilizarse también para evaluar las subpoblaciones de espermatogonios, espermatocitos y espermátidas y puede ser adaptada para una amplia variedad de procesos de estudio durante la espermatogénesis. Este enfoque se ha utilizado para celular directo imágenes de espermatocitos y modificado para llevar a cabo una variedad de estudios celulares y bioquímicos38,39,40. La técnica de squash del túbulo se ha utilizado para rata y ratón los túbulos seminíferos, lo que sugiere que se debe aplicar fácilmente a otros sistemas de mamíferos, incluyendo humanos40. Esta técnica puede ayudar a definir las perturbaciones celulares que dan lugar a la aneuploidía de esperma e infertilidad.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. y por una beca de beca de capacitación desde el Instituto Nacional de cáncer (NIH) (CA009110) S.R.W. y J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
