Summary
この尿細管スカッシュ手法の目的は、急速に細胞の完全性を維持しながらマウス精母細胞の開発の細胞機能を評価するためです。このメソッドにより、精子形成のすべての段階の調査のため、マウスの減数分裂の研究のため他の生化学的な分子の生物学的アプローチと一緒に簡単に実装することができます。
Abstract
雄の減数分裂の進行は、規制の厳しい携帯電話イベント数の協調的な行動を必要とするプロセスです。減数分裂の間に発生したエラーは不妊、妊娠の損失または遺伝的欠陥につながることができます。思春期と成人期にわたって継続の発症時、精母細胞の連続準同期波まで精子を受ける、最終的に半数体精子を形成します。マウスの精母細胞の減数分裂の開始を受けての最初の波は産後 10 日目 (10 dpp) で表示され、35 dpp で成熟した精子と精細管の内腔に放出されます。したがって、関心の高濃縮の人口を得るためにこの発達の時間ウィンドウ内でマウスを利用するため有利です。珍しいセル段階の分析は、細管内細胞集団の多様性を高める連続の精波の貢献のための古いマウスのより困難です。ここで説明する方法は、マウス精原細胞、精母細胞、細胞などの精細管内で見つかった細胞の細胞学的評価のため簡単に実装されている手法です。尿細管スカッシュ技術分離の雄性生殖細胞の整合性を維持でき、他の手法とは表現しにくいセル構造の検討。この尿細管スカッシュ手法の応用可能性を示すためには、紡錘アセンブリは精母細胞転移中期に前期を進める (G2/MI 転移) で監視されました。さらに、染色体花束形成、減数分裂の性染色体の不活性化 (MSCI)、中心体の複製は、この尿細管スカッシュ メソッドを使用して観察することができます細胞構造の例として評価されました。突然変異または外因性の摂動によって引き起こされる精子の中に特定の欠陥を特定するこの手法を使用でき、精子形成の分子理解に貢献。
Introduction
減数分裂は、細胞分裂の 2 つの連続したラウンドを DNA 複製の 1 つのラウンドの後、複雑な携帯電話イベントです。正確な染色体分離を確保するための減数分裂の初期の段階で減数分裂固有のいくつかのイベントを調整しなければなりません。これらのイベントは、相同組み換え、姉妹の共同向きの完了を含んで第一減数分裂と同族体の chiasmata を解決するコヒーシン複合体の段階的な損失の間に体。これらのプロセスの精密な規則は、豊饒を維持するために、発達障害の遺伝的および自然流産1をもたらす染色体紡錘イベントを防ぐために必要です。
減数分裂のキー イベントが行われる男性と女性の両方で、重要な時間および作用機構の違い精子と卵形成2間存在します。たとえば、減数分裂女性、前期私は萌芽期の開発中に発生した、思春期まで dictyate 段階で逮捕。対照的に、精子形成は思春期で逮捕なしの大人の生活の中での波の進行開始します。男性と女性の減数分裂の違いが具体的に精母細胞や卵母細胞でこれらのプロセスを評価するに向かって仕出し料理方法を開発する必要性を強調しています。現在、主として減数分裂の進行を評価するクロマチン スプレッド3,4、5の使用に依存します。クロマチン スプレッドは減数分裂期の染色体を調べる場合に役立ちますが、彼らは紡錘体微小管、中心、核膜、テロメアの添付ファイルなどの細胞構造の評価を防止する、細胞の完全性を維持するために失敗します。ライブ イメージングと長期培養技術が大きく進歩した女性減数分裂; の私達の理解ただし、そのままセル全体を視覚化する同様のアプローチについては、精子6、7の研究のため実装頻度。男性減数分裂中の動的イベントを視覚化するために急速にマウス精母細胞8,9の開発の細胞の機能を評価するために確立された尿細管スカッシュ技術を適応しています。ここで説明する方法は、精子形成サイクルのさまざまな段階で複数の細胞構造の研究を有効にするセルの整合性を維持します。
この尿細管スカッシュ技術は、蛍光顕微鏡による細胞構造の評価を可能にするセル全体アプローチです。ヘマトキシリン ・ エオシン染色パラフィン埋め込まれた精巣の凍結切片の免疫蛍光ラベリングなど男性マウスの減数分裂の進行を視覚化する一般的な組織学的アプローチは、減数分裂の進行の広範な概要。ただし、これらのテクニックは、単一細胞を減数分裂10,11全体で発生するイベントの詳細な分析に必要な範囲に解決する失敗します。減数分裂のプロセスを視覚化するための代替技術は、特定し、核物質の3,4,5を解決する状態の中断を重要な chemiosmotic に依存します。これらの化学治療は、一次精母細胞以外の細胞型の観測を妨げます。最近説明滑川による分離精母細胞の核の構造を維持する研究コミュニティが有効になって、cytospin およびいくつかの研究所の4にすぐに利用できない場合があります付属品の使用が必要です。対照的に、尿細管スカッシュ テクニックだけはほとんどの細胞生物学研究所で一般的に標準的な装置が必要です。
圏内には精細管、セルトリ細胞、精原細胞、第一次および二次精母細胞など多様な細胞型を表示するは、ここで説明した尿細管スカッシュ メソッドを使用できます。若年マウス精子形成の近く同期の最初の波でこの手法を結合することにより減数分裂12を操作するときに、精子細胞の豊かな人口を得ることが可能です。このプロセスは、精子形成、初期前期イベントなどを通してプロセスの詳細な分析、G2/MI と後期遷移、および精子形成に中期に許可されます。さらに、尿細管スカッシュ準備は染色体 (interchromatid ドメイン (Icd) や体) と (由来と一分素材/行列) 中心の細胞像を可視化する使用できます。スカッシュ メソッドは、クロマチン スプレッドと蛋白質の抽出など、他の実験的アプローチと並行で容易に実行できます。さらに、この手法は、直接可視化13スライドに精子細胞を入金する正常に変更されています。
ここで説明したメソッドには、野生型 c57bl/6 j マウスにおける G2/MI 転移を分析するセル全体精細管スカッシュ テクニックが含まれます。第一減数分裂に入る一次精母細胞の細胞学的特徴は、減数分裂のスピンドルを観察する蛍光顕微鏡で視覚化しました。この汎用性の高い手法は、他の減数分裂の段階と異なる種類の細胞を可視化する簡単に変更できます。技術はまた、DNA と RNA の魚のアプローチなど、代替の可視化戦略に従うです。
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Protocol
マウスの使用は、機関動物ケアとジョンズ ・ ホプキンス大学の使用・委員会によって承認されました。少年 (20-26 日産後、dpp) について実験を行った c57bl/6 j マウス、精子形成の準同期の最初の波の活用します。しかし、この手法も実行できますアダルト マウスを用いたします。
1. 解離とマウス精細管の分離
- 修正/溶解ソリューションと抗体希釈バッファー (ADB)の表 1と表 2に記載されているを準備します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (1 x PBS、pH 7.4) x 1 の 3 ml 1 つ 35 mm シャーレとマウスあたり修正/溶解溶液 2 mL と別の 35 mm 皿を準備します。
- 頚部転位または CO2窒息を介してマウスを犠牲に、70% エタノールで腹側腹部をスプレーします。V 字形の開口部を作る生殖不能のはさみを使って腹部骨盤腔を開きます。精巣、鉗子による副睾丸脂肪パッドを取り外し、逃げずを妨害しません。1x PBS を含む 35 mm のペトリ皿に精巣を配置します。
注:精子形成の最初の波を利用すると、金利14の富ませたセル人口を観察するために。精子形成サイクルの特定の段階は、年齢別のマウス (表 3) で濃縮されています。 - 鋭い先端の鉗子で組織を穿刺によって精巣逃げずを削除し、緩やかな精細管を収集します。細管を修正/溶解液 2 mL を含む新しい 35 mm のペトリ皿に転送します。
- 室温で 5 分間修正/溶解液尿細管を孵化させなさい。
2. 精細管の準備
- 液体ブロッカー ペンでスライドのエッジのアウトラインによるポリ-L-リジン コーティング ガラス スライドを準備します。
- スライド ガラスの中央に修正/溶解溶液 100 μ L を適用します。
- 滅菌の鉗子を用いたはさみはそっと離れて毛尾をいじめる。長い個々 の細管を切削セグメントの長さ約 20 mm。
注:中心などの長期固定露出に敏感な構造を視覚化する、1 × PBS の細管をまず分離し、直接表面に細管をミンチにポリ リジン スライドは修正溶解溶液 100 μ L でコーティング。 - 5 つの 20 mm 長い精細管セグメントを含む修正/溶解液準備ポリ L リジン コーティング ガラス スライドに転送します。
- 1.5 から 3.0 mm のセグメントに滅菌はさみミンチ精細管を使用しています。
- 使用して滅菌鉗子がスライド ガラス上の尿細管のセグメントを配置組織が重なっていないと細管が均等に分散されます。
注:スライド ガラス上の尿細管のセグメントの最適数は 20 と 40 の間です。
3. 退治精細
- ベンチトップに分散した精細管セグメントを含むガラス スライドを転送します。スカッシュ ステップ中に組織を失うことを避けるために研究室のワイプを使用して余分な液体を削除します。
- スライド ガラスの上に観察 (22 × 60 1.5 mm) を適用し、10-20 秒の手のひらのかかとで圧力を適用します。精細管から精母細胞を分散させるのに十分な力を適用することが重要です。
注:尿細管のすべてのセグメントが中断されるので、退治の手順を最適化するために解剖顕微鏡を用いた尿細管を観察します。 - スライド鉗子を使用すると、すぐにフラッシュ凍結液 N2の小型のデュワーのガラス スライドを 15 秒間、または液体が泡を停止するまで。反応は、すぐにストレート エッジかみそりの刃で coverslip を削除する場合、は、先端の鉗子または 21 g 針を罰金します。
注:最適な結果を得る、immunolabel スライドをすぐに (手順 4 を参照)。ただし、この時点でスライドできる-80 ° C で 2 週間。タンパク質と細胞構造の寿命を最大にするには、すぐにドライアイスまたは-80 ° C の冷凍庫に転送でスライドを格納し、スライドに、coverslip を保管します。反応は、スライドを保存する場合は、手順 3.3 で説明した、15 秒間液体 N2のスライドを浸すことによって、coverslip を削除します。
4. マウントした精細管の反応
- 1 × PBS と 3 回 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar で 5 分間洗浄のスライドを浸します。
注:スライドを許可しない反応の間に完全に乾燥。 - 1 mL の加湿チャンバー内で 1-2 時間のブロックをスライド ガラス上に抗体希釈バッファーを適用します。
- 抗体希釈バッファーを削除し、加湿チャンバー内抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体 100 μ。
注:最良の結果は、4 ° C で一晩一次抗体を孵化させなさい。Coverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。検証し、一次抗体15を最適化します。 - 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar に 3 回 5 分用のスライドをすすぐ。
注:洗浄を高めるためには、小さな電磁攪拌棒を使用して Coplin jar を扇動し低速で電磁攪拌プレート上に配置または卓上ミキサー低速での Coplin jar を配置します。 - 室温で加湿チャンバーで 1 から 1.5 時間抗体希釈バッファーで希釈した二次抗体の 100 μ L を適用します。写真は共役分子蛍光抗体の漂白を避けるために暗いボックスにスライドを孵化させなさい。
注:Coverslip やパラフィルムでスライドを覆うことによって抗体 (例えば50 μ L) のより小さいボリュームを使用します。 - 1x PBS を含む 50 mL Coplin jar に 2 回 5 分用のスライドをすすぐ。
- メディアを含んでいる 4', 6-diamidino-2-phenylindole マウント (DAPI、1.5 μ g/mL) のスライドをマウントし、coverslips (22 × 60 1.5 mm) を適用します。
- スライドを保持し、coverslips の移動を防ぐ明確なマニキュアでスライドに coverslips をシールします。
5. 分析やイメージングの尿細管スカッシュ準備
- 正確な z 軸の動きと画像をキャプチャするための高解像度カメラにより自動ステージと落射蛍光顕微鏡を使用します。また、レーザー共焦点顕微鏡を使用します。
注:このステップのすべての利用可能なハードウェアとソフトウェアを使用します。たとえば、図 1および図 2で表示される画像は、ツァイス セル オブザーバー Z1 シャチ フラッシュ 4.0 CMOS カメラにリンクし、ツァイス禅 2012 青版画像ソフトウェアで解析を使用して捕獲されました。 - スカッシュの準備の質を決定する 20 × 対物を使用してスライドを評価します。良質のスライドが等間隔に核の分子があります。
注:スライドのいくつかのセクションは他の人より、さらなる高倍率を使用して分析のためのスライドの最高の領域を見つけることができますの座標をメモすると便利です。 - 高い倍率目的 (例: 63 X または 100 X)、核の一貫した単分子膜を持つスライドのキャプチャ領域を使用しています。地域を選択すると、上限を設定、確実にすべてのフォーカスの光をキャプチャ Z スタックを下ろします。
注:Z スタックの上限と下限の制限の間に捕捉の最適数画像集録ソフトウェアが一般に指定し、は、それぞれの目的によって異なります。 - 画像処理ソフトウェアを使用して、奥行きを拡張焦点画像をコンパイルします。ソフトウェアは各 Z スタックからフォーカスの光を組み合わせた、尿細管スカッシュ製剤の最適な画像のために不可欠です。
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Representative Results
ここでは、中期に前期を受けて一時的な細胞集団を視覚化する尿細管スカッシュ メソッドを使いましたが (G2/mi)、精子形成 (24 の最初の波を受けている少年の野生型マウスの精巣を収穫して濃縮した移行dpp)。図 1は、尿細管のスカッシュ メソッドを使用して視覚化することができますさまざまな細胞段階の代表的なイメージを示しています。中期の個体群を濃縮私精母細胞は α-チューブリン (図 1 a) に対する抗体を用いて可視化しました。初期と後期の減数分裂のマーカー利用段階減数分裂進行します。尿細管スカッシュ準備された前期 i. Leptotene/zygotene の段階を視覚化する SYCP3 減数分裂蛋白質への抗体とカルビンディン抗体と pachytene/diplotene 精母細胞は図 1 bに示します。精母細胞が第一減数分裂を受けては α-チューブリン抗体を使用して明確に識別することができます(図 1 aと1 C)。後半の減数分裂のイベントを研究するには、尿細管南瓜だったカルビンディン抗体に細胞周期キナーゼ オーロラ B (AURKB)、中期の間に内側のセントロメアにローカライズすると、これに対する抗体を用いて、中にスピンドル midzone と切断溝に relocalizes後期と分裂、それぞれ(図 1)。染色体の細胞学的特徴は、減数分裂の最初の間に, 可視化されました。Icd を観察する尿細管スカッシュ準備カルビンディン抗体に REC8 コヒーシンの減数分裂固有アルファ kleisin サブユニットに対する抗体を用いていた (図 1)。後期の間に染色体のダイナミクスは、α-チューブリン immunolabelling と DNA 染色 DAPI を使用して評価されました。第一減数分裂が正常に完了状態は図 1E、表示され、図 1 fに後期橋を含む状態を示します。尿細管スカッシュ テクニック、減数分裂紡錘長さを使用して、染色体の整列と分離測定および比較が可能変異体とコントロール マウス。
ユーティリティ追加細胞周期移行と前期に関連する細胞レベル下の構造の可視化法は図 2で紹介しました。前期の leptotene サブステージの中に私は、相同染色体対の開始は核膜 (NE)16,の 1 つのポールに直面して染色体クラスター形成を誘導するテロメア添付ファイルのダイナミックな変化によって媒介されます。17,18,19,20します。 この構造は、尤度と(図 2 a)間の相同物相互作用の頻度を増加すると考えられる染色体"花束"として知られています。相同染色体の間のシナプスの開始・完了時と発生します、zygotene (図 2 b) pachytene サブステージ(図 2)、それぞれの進歩的な散布で対応する、染色体の花束。同時に我々 カルビンディン抗体尿細管スカッシュ調剤 SYCP3 し、セントロメア抗体と少年のマウスでシナプスと染色体の花束ダイナミクスを評価するために DAPI を使用して DNA の染色。マウス染色体が二本、セントロメア反応だったため、テロメア NE 添付ファイルの変更を検出します。
減数分裂の性染色体の不活性化 (MSCI) は男性の減数分裂に固有の特徴という非相同の X と Y 染色体は、染色体全体のリン酸化ヒストン異型 H2AFX (yH2AX; pSer139) を受けることによってチェックポイント活発化を回避21 ,,2223。X と Y 染色体のペアは沈黙し、「セックス体」と呼ばれる高密度核サブドメインに区分される転写活性MSCI を受けて精母細胞は、反応尿細管スカッシュ準備抗体と yH2AX で pachytene と diplotene のサブステージの中に容易に識別できます (Ser139)。図 2 D yH2AX に対する抗体と pachytene サブステージ immunolabelled で状態を示しています (Ser139)、セントロメア DNA を可視化する DAPI 染色と。
中心体の複製は半保守的だと各結果の娘細胞が次の細胞分裂24,25 2 つの由来 (1 体) を継承するように修理完了すると DNA の男性減数分裂の前期中に発生しました。.中心から成っている適用範囲が広いリンカーによって接続されている 2 つの直交配置された由来と一分素材/マトリックス (PCM)26として知られていた蛋白質の非晶質マトリックスに囲まれています。Pachytene サブステージで重複後、ペアは互いから外れるし、中心体の成熟とバイポーラ スピンドルの形成を容易にする diplotene 段階で対極への移行を受ける中心小体を新設しました新たに形成された中心小体のペアの和を受けている初期の diplotene 状態だったペリセントリン (PCNT)、PCM と Centrin-3 (CETN3) をマークするためのタンパク質成分に対する抗体と反応尿細管スカッシュ製剤による可視化由来(図 2 e)。ステージングされた SYCP3、抗体を用いて、DAPI は DNA を染色に使用されました。
図 1: 尿細管スカッシュ標本による減数分裂の G2/MI 転移の代表的な解析します。C57bl/6 j マウス歳 24 dpp の精細管セグメントの尿細管スカッシュ準備を行った。(A)代表分野カルビンディン抗体開発精母細胞に α-チューブリン (赤) セントロメア (緑) に対する抗体と、DNA は染色 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole、青) です。(B)野生型尿細管南瓜 DAPI (青) (赤), α-チューブリン抗体とカルビンディン抗体だけでなくと SC、SYCP3 (緑) の外側の要素で染色。(C)野生型尿細管南瓜染色 DAPI (青) (赤), α-チューブリン抗体とカルビンディン抗体だけでなくと細胞周期キナーゼ AURKB (グリーン)。Icd や後期橋など染色体の細胞学的特徴は、尿細管スカッシュ準備を使用して視覚化できます。(D) Icd を観察する prometaphase 精母細胞が減数分裂特定コヒーシン コンポーネント、REC8 (緑)、(赤) セントロメア抗体とカルビンディン抗体染色 DAPI (青) と。(E, F)Α-チューブリン (赤) セントロメア (緑) に対する抗体を用いて後期中に染色体の形態を描出し、DAPI 染色 (青)。尿細管スカッシュ テクニック (L/Z は、leptotene/zygotene ステージ精母細胞; を使用して精母細胞の開発の完全な補完を識別できます。P/D、pachytene/diplotene ステージ精母細胞;午後、prometaphase 精母細胞;M、中期精母細胞;A, 後期精母細胞)。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: その他の形態学的変化と尿細管スカッシュ準備を使用して男性の減数分裂前期の進行に関連付けられた構造の例です。C57bl/6 j マウスのセグメント 12 18 dpp を高齢者、DAPI は DNA のラベルに (4', 6-diamidino-2-phenylindole、青) で染色した精細管の尿細管スカッシュ準備を行った。(A ~ C)相同体シナプス形成と前期の進行中に染色体「花束」の進歩的な飛散に結合されています。Leptotene (A)、 (B)、zygotene、pachytene (C)ステージ精母細胞 SYCP3 (赤) に対する抗体とカルビンディン抗体とセントロメア (緑) をしました。(D ・ E)尿細管スカッシュ準備は、ユニークな細胞の変化を検出する使用ことができ、男性前期中に構造 I 進行減数分裂の性染色体の不活性化 (MSCI) と中心体の複製を含みます。(D) Pachytene ステージ精母細胞 MSCI を受けている yH2AX に対する抗体を使用して検出されたセックスのボディ (緑の矢印) のラベルに (Ser139) とセントロメアが赤で示されます。(E) Diplotene ステージ精母細胞は SYCP3 (赤)、および中心 (矢印) に対する抗体を用いて識別された中心体と、一分のラベルに Centrin-3 (緑) およびペリセントリン (マゼンタ) に対する抗体を使用して検出されました。素材/マトリックス、それぞれ。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 項目 | 量 | 最終濃度 |
| 1x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 Μ L | 0.8% (v/v) |
| PBS で 10% TritonX 100 | 100 Μ L | 0.1% (v/v) |
表 1: 修正/溶解ソリューションです。説明/コントロール: 水酸化ナトリウム [50] 9 pH を調整します。光から保護し、4 ° C で保存するアルミ箔でソリューションのコンテナーをラップします。場合は 1 週間以上古い修正プログラム/溶解ソリューションを使用しないでください。ソリューションを作成する固体 PFA を使用もできます。PFA の露出を避けるために、ドラフトの使用お勧めします。
| 項目 | 量 | 最終濃度 |
| 1x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1.5 g | 3% (w/v) |
| ウマ血清 | 5 mL | 10% (v/v) |
| PBS で 10% TritonX 100 | 250 Μ L | 0.05% (v/v) |
表 2: 抗体希釈バッファー (ADB) レシピ。説明: ストア ADB 4 ° c または-20 ° C より多くの数量を作る場合で冷凍ストック。ADB は、汚染になることができる、良い無菌技術が使用され、各使用前に汚染のためのソリューションを評価するかどうかを確認します。ADB の汚染を最小限に抑えるための小さい因数を準備します。
| セルの種類 | 細胞プロセス | マウス時代 (dpp) |
| Leptotene | DNA 損傷の形成 | 10-12 |
| 軸方向の要素のアセンブリ | ||
| Zygotene | 相同の DSB の修復とシナプスの開始 | 12-16 |
| Pachytene | 常染色体優性の DSB の修復の完了 | 16-20 |
| クロス オーバー組換えイベントの成熟 | ||
| 同族体間の完全なシナプス | ||
| 減数分裂の性染色体の不活性化 (MSCI) | ||
| 中心小体の複製/体の成熟 | ||
| Diplotene と移動 | SC Desynapsis します。 | 18-22 |
| 中心体の分離 | ||
| 中期私 | 紡錘体チェックポイント | 22-26 |
| ラウンド Spermatid | プロタミン交換 | > 24 |
| 精子先体形成 |
テーブル 3: 少年マウス精子形成の最初の波を近く同期します。説明/コントロール: 若年マウス開発のさまざまな段階で精子形成サイクルの特定の段階が濃縮されています。
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Discussion
マウス精子形成時の減数分裂の進行を支配する細胞の活動を研究するための有用なモデル生物であると証明します。さらに、それはツールが終了するので、多くのイベントなど減数分裂前期から私の精子形成過程の研究に仕出し料理を開発する必要がある、性的に二形であります。このプロトコルでは、精細管スカッシュ法可視化とマウス精子形成サイクルのさまざまな段階の研究について説明します。このメソッドは、細胞の完全性を保持し、核と細胞質の構造の詳細な解析により。本研究で描かれている代表的な結果は、このプロトコルを一次精母細胞減数分裂の進行中の評価の有用性を示しています。また、このプロトコルは、精子形成、増殖、精原細胞の分化と精子形成27,28の段階を含む時他の細胞プロセスの研究にも使用できます。内で説明する方法は、前述した尿細管スカッシュ テクニック8,9時から合わせられます。しかし、このプロトコルはすべての試薬や蛍光顕微鏡による単一細胞を可視化する細管を取得するから、必要な手順をカバー最初の詳細なガイドです。さらに、私たちは、小体と手法で視覚化することができますテロメアの花束などを含む追加の細胞機能に画像を発表しました。
尿細管スカッシュ準備を最適化するためのキーは、いくつかの技術的な要素があります。まず、1 つはガラス基板に力の適切な量を適用する必要があります。十分な力を適用する失敗は、精細管の内でほとんどの細胞が残ります、いくつかの付着性細胞をスライドが生成されます。第二に、時間の適切な長さの修正/溶解液精巣材料を孵化させなさい 1 つ必要があります。一般に、固定は 5 分に制限する必要がありますが、5 ~ 15 分間範囲は許容。長時間固定されて尿細管を操作し、悪い結果をもたらすことは困難になります。ただし、PFA の濃度を抑えることでインキュベーション時間を延長することが可能、です。たとえば 0.5 %%pfa を下げる修正/溶解液増加インキュベーション時間なります。提案した方法で透過と固定手順が発生、同時に 1 つの別の後、それぞれの手順を実行できます。透過と固定の手順を分けると、細胞質のバック グラウンド信号のレベルを減らすに役立ちます。固定や透過戦略の変化は、特定の細胞内構造や抗体の評価のための条件を最適化するためにもテストできます。たとえば、可視化 centrosomal のスピンドルのタンパク質は、PFA29,30,31ではなくメタノールを使用して高めることができると。また、具体的に精子形成 (約 10-26 dpp) の最初の波を学んで、確実不定期減数分裂細胞イベント12を視覚化する少年のマウスを使用すると便利です。また、精細管32内の光吸収パターンを観察することによって大人のマウスからステージ固有減数分裂細胞を分離することが可能です。成体マウスの精子の非同期サイクルを考えると、ただし、まれな減数分裂のイベントの詳細を分析することができます挑戦。この制限は、bisdichloroacetyldiamine、勝つ 18,446, どのブロック ビタミン A 代謝をマウスに注射によって克服することができ、精原分化33を停止します。勝つ 18,466、精子形成の再開処理を次が同期的に発生、成熟動物34から豊かな胚芽細胞集団の大量の降伏。大人35,36,で発生したに精子形成の最初の準同期波の違いを調査する尿細管スカッシュ テクニックの前にこの同期方法を使用できます。37します。 さらに、父方の高齢化と異数性の相関も評価できる勝つ 18,466 同期と評価する染色体の分離を用いた尿細管スカッシュ メソッド。
要約すると、このメソッドは精子形成サイクルのさまざまな段階で細胞を観察するための蛍光顕微鏡と組み合わせて使用できます。広く適用すれば、この技術は、細胞、精母細胞、精原細胞の集団を評価するためにも使用できます、精子形成過程のプロセスの様々 な研究に合わせて調整することができます。このアプローチは、さまざまな細胞生化学的研究38,39,40を実施する生細胞、精母細胞のイメージングと変更のため使用されています。尿細管スカッシュ技術は容易に人間40を含む他の哺乳類システムへ適用することを示唆、マウスおよびラット精細管の使用されています。この手法は、不妊と精子異数性を生じさせる細胞の摂動の定義を助けることができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、日の出 (R01GM11755) に P.W.J.、S.R.W.、j. h. 訓練助成フェローシップ国立がん研究所 (NIH) (CA009110) からサポートされていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
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