Summary
Målet med denne tubulus squash teknik er til hurtigt at vurdere cytologiske funktioner for at udvikle mus spermatocytes samtidig bevare cellulære integritet. Denne metode giver mulighed for undersøgelse af alle faser af spermatogenesen, og nemt kan gennemføres sammen med andre biokemiske og molekylær biologiske metoder til undersøgelse af mus meiose.
Abstract
Meiotiske progression i hanner er en proces, der kræver en samordnet indsats af en række stærkt regulerede cellulære begivenheder. Fejl, der opstår under meiose kan føre til barnløshed, graviditet tab eller genetiske defekter. Begyndende ved indtræden af puberteten og fortsætter gennem voksenalderen, kontinuerlig semisynkron bølger af spermatocytes gennemgå spermatogenesen og i sidste ende udgør haploide sædceller. Den første bølge af mus spermatocytes gennemgår meiotiske indledning vises på dag 10 post-partum (10 dpp) og er udgivet i lumen af seminiferous tubules som modne sæd på 35 dpp. Derfor er det fordelagtigt at bruge mus i dette udviklingsmæssige tidsvindue for at få højt beriget populationer af interesse. Analyse af sjældne celle faser er vanskeligere i ældre mus af successive spermatogenic bølger, der øger mangfoldigheden af de cellulære befolkninger i tubuli bidrag. Metoden beskrevet her er en let gennemføres teknik for cytologiske evaluering af de celler, der findes inden for mus, herunder spermatogonia, spermatocytes og spermatider seminiferous tubules. Tubulus squash teknik opretholder integriteten af isolerede mandlige kønsceller og giver mulighed for undersøgelse af cellulære strukturer, der ikke er let visualiseres med andre teknikker. For at vise de mulige anvendelser af denne tubulus squash teknik, blev spindel forsamling overvåget i spermatocytes forløber gennem prophase til metafase jeg overgang (G2/MI overgang). Derudover blev centrosome dobbeltarbejde, meiotiske sex kromosom Inaktiveringen (MSCI) og kromosom buket dannelse vurderet som eksempler på de cytologiske strukturer, som kan observeres ved hjælp af denne tubulus squash metode. Denne teknik kan bruges til at indkredse specifikke defekter under spermatogenesen, der er forårsaget af mutation eller eksogen undertrykkelse af netbårne, og således bidrager til vores Molekylær forståelse af spermatogenesen.
Introduction
Meiose er en kompleks cellulære begivenhed hvor en enkelt runde af DNA-replikation er efterfulgt af to successive runder af celledeling. Flere meiose-specifikke begivenheder skal koordineres i de indledende faser af meiose at sikre nøjagtig kromosom adskillelse. Disse arrangementer omfatter gennemførelsen af homologe rekombination, co orientering af søster kinetochores under den første meiotiske deling og trinvis tabet af cohesin komplekser til at løse chiasmata mellem homologs. Præcis regulering af disse processer er nødvendige for at opretholde frugtbarhed og forebygge kromosom missegregation begivenheder, der kan føre til genetiske udviklingsforstyrrelser og spontan abort1.
Mens de vigtigste begivenheder af meiose finder sted i både hanner og hunner, findes væsentlige timeligt og mekanistiske forskelle mellem spermatogenesen og oogenesen2. For eksempel, under kvindelige meiose, prophase jeg opstår under fosterudviklingen og anholdelser i dictyate fase indtil puberteten. Derimod begynder spermatogenesen ved puberteten og skrider frem i bølger i hele voksenlivet uden anholdelse. Forskelle mellem mandlige og kvindelige meiose understreger behovet for at udvikle metoder, der er specifikt dækket mod vurdering af disse processer i både spermatocytes og oocyter. I øjeblikket bygger vurderer meiotiske progression i vid udstrækning på anvendelse af kromatin opslag3,4,5. Mens kromatin spreads er nyttigt for at studere meiotiske kromosomer, undlader de at bevare cellulære integritet, forhindrer evaluering af cellulære strukturer som spindel mikrotubuli, centrosomes, nuklear kuvert og telomere vedhæftede filer. Live imaging og langsigtede dyrkningsbaserede teknikker er meget avancerede vores forståelse af kvindelige meiose; lignende metoder til at visualisere hele intakt cellen, dog gennemføres mindre hyppigt for studiet af spermatogenesen6,7. For at visualisere dynamiske begivenheder i hele mandlige meiose, har vi tilpasset etablerede tubulus squash teknikker til hurtigt at vurdere de cytologiske funktioner for at udvikle mus spermatocytes8,9. Metoden beskrevet her opretholder integriteten af cellen, giver studiet af flere cellulære strukturer i forskellige faser af spermatogenesen.
Denne tubulus squash teknik er en hele cellen tilgang, som giver mulighed for vurdering af cellulære strukturer via immunofluorescens mikroskopi. Fælles histologiske tilgange til at visualisere meiotiske progression i mandlige mus, såsom haematoxylin og eosin pletter af paraffin indlejret testiklerne, og immunfluorescent mærkning af snit frosset organmateriale giver mulighed for et bredt overblik over meiotiske progression. Men disse teknikker ikke løse enkelt celler i det omfang, der er nødvendige for detaljeret analyse af hændelser i hele meiose10,11. Alternative teknikker til at visualisere meiotiske processer er afhængige af betydelig kemiosmotisk afbrydelse af spermatocyte til at isolere og løse nukleare materialer3,4,5. Disse kemiske behandlinger hindre observation af celletyper end primære spermatocytes. En nylig beskrevne metode af Namekawa har aktiveret forskersamfundet til at bevare den nukleare arkitektur af isolerede spermatocytes, men kræver brug af en cytospin og tilbehør, der ikke kan være let tilgængelige for nogle laboratorier4. Tubulus squash teknik kræver derimod kun udstyr, der er generelt standard i de fleste celle biologi laboratorier.
Tubulus squash metode beskrevet her kan bruges til at visualisere de forskellige celletyper findes inden for den seminiferous tubulus, herunder sertoli celler, spermatogonia, primære og sekundære spermatocytes og spermatider. Ved at koble denne teknik med den nær-synkron første bølge af spermatogenesen i juvenile mus, er det muligt at opnå beriget populationer af spermatogenic celler, som de fremskridt gennem meiose12. Denne proces tillader den detaljerede analyse af processer i hele spermatogenesen, som tidlig prophase begivenheder, G2/MI og metafase anaphase overgange og spermiogenesis. Tubulus squash præparater kan desuden bruges til at visualisere cytologiske funktioner af kromosomer (f.eks. interchromatid domæner (ICDs) og kinetochores) og centrosomes (centrioler og pericentriolar materiale/matricer). Metoden squash kan udføres let parallelt med andre eksperimenterende tilgange, såsom kromatin spreads og protein udvinding. Desuden, er denne teknik ændret med held til at deponere levende spermatogenic celler på dias for direkte visualisering13.
Den metode beskrevet her indebærer en hel celle seminiferous tubulus squash teknik til at analysere G2/MI overgangen i wild-type C57BL/6J mus. De cytologiske træk ved primær spermatocytes ind i den første meiotiske deling blev visualiseret med immunofluorescens mikroskopi til at observere meiotiske spindlen. Denne alsidige teknik kan let modificeret til at visualisere anden meiotiske faser og forskellige celletyper. Teknikken er også åbne over for alternative visualisering strategier, såsom DNA og RNA fisk tilgange.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brugen af mus blev godkendt af institutionelle Animal Care og bruge Udvalget af Johns Hopkins University. Forsøgene blev udført på ungdomskriminalitet (20-26 dage post-partum, dpp) C57BL/6J mus, at drage fordel af den semisynkron første bølge af spermatogenesen. Dog, denne teknik kan også udføres ved hjælp af voksen mus.
1. dissektion og isolation af musen seminiferous tubules
- Forberede den rettelse/løsning og antistof fortynding lysisbuffer (ADB) er beskrevet i tabel 1 og tabel 2.
- Forbered en 35-mm petriskål med 3 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (1 x PBS, pH 7,4) og en anden 35-mm parabol med 2 mL af fix/lysis løsning pr. mus.
- Ofre musen via cervikal dislokation eller CO2 kvælning og spray den ventrale maven med 70% ethanol. Åbn abdominopelvic hulrum ved hjælp af steril saks, gør en V-formet åbning. Derefter fjerne testiklerne ved at trække på den epididymis fedt pad med pincet, og undgå at forstyrre tunica albuginea. Placer testiklerne i et 35-mm petriskål indeholdende 1 x PBS.
Bemærk: Udnytte den første bølge af spermatogenesen for at observere en beriget celle population af interesse14. Konkrete etaper af spermatogenesen er beriget på forskellige mus aldre (tabel 3). - Fjerner den testikel tunica albuginea ved punktering vævet med skarpe tippes pincet og indsamle de løs seminiferous tubules. Overføre tubuli til en ny 35 mm petriskål indeholdende 2 mL af fix/lysis løsning.
- Inkuber tubuli i rettelse/lysis løsning for 5 min ved stuetemperatur.
2. forberedelse af seminiferous tubules
- Forberede en poly-L-lysin coatede glas dias ved kanterne af diaset med en flydende blocker pen.
- Anvende 100 µL af fix/lysis løsning til midten af glas dias.
- Ved hjælp af steril pincet og saks forsigtigt drille hinanden seminiferous tubules. Skære ud længe individuelle tubulus segmenter ca 20 mm i længden.
Bemærk: At visualisere strukturer, der er følsomme over for langvarig Fikseringsvæske eksponering, som centrosomes, adskille tubuli først i 1 x PBS, så direkte hakkekød tubuli på overfladen af poly-lysin dias belagt i 100 µL af fix-lysis løsning. - Overføre fem 20 mm lange seminiferous tubulus segmenter til rede poly-L-lysin coatede glas dias indeholder rettelse/lysis løsning.
- Ved hjælp af steril saks hakkekød seminiferous tubules i 1,5 til 3,0 mm segmenter.
- Ved hjælp af steril pincet Arranger tubulus segmenter på glas dias, så ingen væv overlapper, og tubuli fordeles jævnt.
Bemærk: Det optimale antal tubulus segmenter på et glas dias er mellem 20 og 40.
3. kvaser af seminiferous tubules
- Overføre diasset glas indeholdende spredte seminiferous tubulus segmenter på en benchtop. Fjern overskydende væske ved hjælp af et laboratorium, der tør for at undgå at miste væv under trinnet squash.
- Dækglas (22 x 60-1,5 mm) oven på glas dias og anvende pres med hælen af håndfladen for 10-20 sekunder. Det er vigtigt at anvende nok kraft til at sprede spermatocytes fra de seminiferous tubules.
Bemærk: Observere tubuli ved hjælp af en dissektion mikroskop for at optimere den sammenpresning trin, så alle tubulus segmenter er forstyrret. - Ved hjælp af slide pincet, straks flash fryse glas dias i en lille dewar af flydende N2 i 15 sekunder, eller indtil væsken ophører med at boble. Hvis immunolabeling straks, at fjerne coverslip med en lige kant barberblad, fine spids pincet eller 21-gauge kanyle.
Bemærk: For optimale resultater, immunolabel dias straks (Se trin 4). Men på dette tidspunkt slides kan bevares ved-80 ° C i op til to uger. For at maksimere levetid af proteiner og cellulære strukturer, straks gemme diasene på tøris eller overførsel til en-80 ° C fryser, og holde coverslip på diaset. Når immunolabeling gemt dias, fjerne coverslip ved at nedsænke dias i flydende N2 i 15 sekunder, som beskrevet i trin 3.3.
4. Immunolabeling af vægmonteret seminiferous tubules
- Fordyb dias i 1 x PBS, og vaskes tre gange i 5 min i en 50 mL Coplin krukke indeholdende 1 x PBS.
Bemærk: Aldrig tillade dias til helt tørt under immunolabeling. - Anvende 1 mL af antistof fortynding buffer på glas dias til at blokere for 1-2 h i en fugtig kammer.
- Fjern antistof fortynding buffer og anvende 100 µL af primære antistof fortyndet i antistof fortynding buffer i en fugtig kammer.
Bemærk: For de bedste resultater, inkuberes primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Bruge mindre mængder af antistof (f.eks. 50 µL) ved at dække dias med en coverslip eller parafilm. Valider og Optimer primære antistoffer15. - Skyl dias tre gange i 5 min i en 50 mL Coplin krukke indeholdende 1 x PBS.
Bemærk: At forbedre vasker, agitere Coplin krukker ved hjælp af en lille magnetiske rør bar og placere på en magnetisk røre pladen på lav hastighed, eller placere Coplin krukken på en bordplade mixer på lav hastighed. - Anvende 100 µL af sekundær antistof fortyndet i antistof fortynding buffer for 1 til 1,5 h i en fugtig kammer ved rumtemperatur. Glassene inkuberes i en mørk kasse at undgå foto blegning af fluorophore konjugerede antistoffer.
Bemærk: Bruge mindre mængder af antistof (f.eks. 50 µL) ved at dække dias med en coverslip eller parafilm. - Skyl dias to gange for 5 min i en 50 mL Coplin krukke indeholdende 1 x PBS.
- Montere dias i montering medium indeholdende 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) og anvende coverslips (22 x 60-1,5 mm).
- Forsegle coverslips til dias med klar neglelak til at bevare diasene og forhindre coverslips i at flytte.
5. analyse og billedbehandling tubulus squash præparater
- Bruge et epifluorescensmikroskop med automatiserede fase, der muliggør præcis z-akse bevægelse og en høj opløsning kamera til billedcapture. Alternativt kan du bruge en laser Konfokal mikroskop.
Bemærk: Bruge enhver tilgængelig hardware og software til dette trin. For eksempel blev billeder, der vises i figur 1 og figur 2 fanget ved hjælp af en Zeiss celle observatør Z1 knyttet til en ORCA-Flash 4.0 CMOS kamera og analyseret med Zeiss ZEN 2012 blå edition billede software. - Vurdere dias ved hjælp af en 20 X mål til at bestemme kvaliteten af squash forberedelse. God kvalitet dias har en éncellelag af kerner, der er jævnt fordelt.
Bemærk: Nogle dele af diaset kan være bedre end andre, det er nyttigt at bemærke koordinaterne, hvor man kan finde de bedste regioner i diaset til videre analyse ved hjælp af højere forstørrelse. - Ved hjælp af højere forstørrelse mål (f.eks. 63 X eller 100 X), capture regioner af dias, der har en konsekvent éncellelag af cellekerner. Når en region er valgt, angive øvre og lavere Z-stakke for at sikre, at alle i-fokus lys er fanget.
Bemærk: Det optimale antal Z-stakke fanget mellem den øvre og nedre grænse er generelt udpeget af image erhvervelse software og er forskellig for hvert mål. - Bruge billedbehandling software til at kompilere en udvidet dybde fokus billede. Softwaren kombinerer i fokus lys fra hver Z-stak, og er afgørende for optimal billeddannelse af tubulus squash præparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her, vi har brugt metoden tubulus squash for at visualisere forbigående cellepopulationer gennemgår prophase til metafase jeg (G2/MI) overgang, som var beriget af høst testiklerne fra juvenile wild-type mus gennemgår den første bølge af spermatogenese (24 DPP). Figur 1 viser repræsentative billeder af forskellige celle faser, der kan visualiseres ved hjælp af metoden tubulus squash. Beriget populationer af metafase jeg spermatocytes blev visualiseret ved hjælp af antistoffer mod alpha-tubulin (figur 1A). Vi udnyttede markører for tidlige og sene meiose I til fase meiotiske progression. Tubulus squash præparater var immunolabeled med et antistof mod synaptonemal kompleks protein, SYCP3, til at visualisere stadier af prophase I. Leptotene/zygotene og pachytene/diplotene spermatocytes er vist i figur 1B. Spermatocytes gennemgår den første meiotiske deling klart kan identificeres ved hjælp af antistoffer mod alpha-tubulin (figur 1A og 1 C). For at studere sent meiotiske begivenheder, blev tubulus græskar immunolabeled ved hjælp af antistoffer mod cellecyklus kinase Aurora B (AURKB), som lokaliserer til indre centromer under metafase, derefter relocalizes til spindel midzone og spaltning fure under anaphase og cytokinesis, henholdsvis (figur 1 c). Cytologiske funktioner af kromosomer blev visualiseret i løbet af den første meiotiske deling. For at overholde ICDs, tubulus squash præparater blev immunolabeled ved hjælp af antistoffer mod meiose-specifikke alpha-kleisin subunit af cohesin, REC8 (fig. 1 d). Kromosom dynamics under anaphase blev vurderet ved hjælp af alpha-tubulin immunolabelling og DNA pletten, DAPI. En spermatocyte med held at gennemføre den første meiotiske deling er vist i figur 1E, mens en spermatocyte, der indeholder en anaphase bro er vist i figur 1F. Ved hjælp af tubulus squash teknik, meiotiske spindel længde, kan kromosom justering og adskillelse måles og sammenlignes mellem mutant og kontrol mus.
Nytten af denne metode til visualisering af yderligere cellecyklus overgange og subcellulært strukturer forbundet med prophase jeg er vist i figur 2. Under leptotene underniveau i prophase er jeg, indledning af homologe kromosom parring medieret af dynamiske ændringer i telomere vedhæftede filer til at fremkalde dannelse af kromosom klynger står over for en enkelt stang af nukleare kuvert (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. denne kropsbygning, kendt som kromosom "bouquet" menes at øge sandsynligheden for og hyppigheden af Inter homolog interaktioner (figur 2A). Indledning og afslutning af synapsis mellem homologe kromosomer opstår under zygotene (figur 2B) og pachytene substages (figur 2 c), henholdsvis, svarer med progressive spredning af den kromosom buket. Samtidig vurdere synapsis og kromosom buket dynamik i juvenile mus, vi immunolabeled tubulus squash præparater med antistoffer mod SYCP3 og centromeres, og farvet for DNA ved hjælp af DAPI. Musen kromosomer er telocentric, derfor centromer immunolabeling blev brugt til at registrere ændringer i telomere NE vedhæftede filer.
Meiotiske sex kromosom Inaktiveringen (MSCI) er kendetegnende unikke for mandlige meiose, hvorved de ikke-homologe X og Y kromosomer omgå checkpoint aktivering af gennemgår kromosom-wide fosforylering af Histon variant H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. X-Y-kromosom pair er transcriptionally til tavshed og opdelte i en tætte nukleare underdomæne kaldet "sex krop." Spermatocytes gennemgår MSCI nemt kan identificeres under pachytene og diplotene substages af immunolabeling tubulus squash præparater med antistoffer til yH2AX (Ser139). Figur 2D skildrer en spermatocyte på pachytene underniveau immunolabelled med antistoffer mod yH2AX (Ser139), centromeres og farves med DAPI at visualisere DNA.
Centrosome dobbeltarbejde er semi-konservative og opstår under prophase af mandlige meiose efter afslutningen af DNA reparation for at sikre, at hver resulterende datter celle arver to centrioler (en centrosome) efter celledeling24,25 . Centrosomes består af to retvinklet arrangeret centrioler forbundet med en fleksibel linker og er omgivet af en amorf matrix af proteiner kaldet pericentriolar materiale/matrix (PCM)26. Efter kopiering i pachytene underniveau, nydannede centriole par frigøre fra hinanden og gennemgå centrosome modning og migration til modsatte poler i diplotene fase at lette dannelsen af bipolar spindler. En tidlig diplotene spermatocyte gennemgår disjunktion af nydannede centriole-par blev visualiseret ved immunolabeling tubulus squash præparater med antistoffer mod pericentrin (PCNT), et protein komponent af PCM og Centrin-3 (CETN3) til at markere centrioler (figur 2E). Iscenesættelse var bestemmes ved hjælp af antistoffer mod SYCP3, og DAPI blev brugt til at plette DNA.
Figur 1 : Repræsentant analyse af meiotiske G2/MI overgangen ved hjælp af tubulus squash præparater. Tubulus squash forberedelser var udført på seminiferous tubulus segmenter af C57BL/6J mus i alderen 24 dpp. (A) repræsentant inden for udvikling spermatocytes immunolabeled med antistoffer mod alpha-tubulin (rød), centromeres (grøn) og DNA pletten DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blå). (B) vildtype tubulus græskar blev farves med DAPI (blå) og immunolabeled med antistoffer mod alpha-tubulin (rød), og den laterale del af SC, SYCP3 (grøn). (C) vildtype tubulus græskar blev farves med DAPI (blå) og immunolabeled med antistoffer mod alpha-tubulin (rød), og den celle cyklus kinase AURKB ()grønne). Cytologiske funktioner af kromosomer ICDs og anaphase broer kan visualiseres ved hjælp af tubulus squash præparater. (D) for at overholde ICDs, prometaphase spermatocytes var immunolabeled med antistoffer mod centromeres (rød) samt en meiotiske specifikke cohesin komponent, REC8 (grøn) og farves med DAPI (blå). (E, F) Kromosom morfologi blev visualiseret under anaphase ved hjælp af antistoffer mod alpha-tubulin (rød), centromeres (grøn), og DAPI pletter (blå). En fuldtallige for at udvikle spermatocytes kan identificeres ved hjælp af tubulus squash teknik (L/Z, leptotene/zygotene fase spermatocytes; P/D, pachytene/diplotene fase spermatocytes; P.M., prometaphase spermatocytes; Møller, metafase spermatocytes; A, anaphase spermatocytes). Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Eksempler på yderligere morfologiske ændringer og strukturer forbundet med meiotiske prophase progression i hanner ved hjælp af tubulus squash præparater. Tubulus squash forberedelser var udført på seminiferous tubulus segmenter af C57BL/6J mus i alderen 12-18 dpp og var plettet med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blå) til at etikettere DNA. (A-C) Homolog synapsis er koblet til dannelse og progressive spredning af kromosom "bouquet" under prophase progression. Leptotene (A), zygotene (B)og pachytene (C) Stadium spermatocytes blev immunolabeled med antistoffer mod SYCP3 (rød) og centromeres (grøn). (D-E) Tubulus squash præparater kan bruges til at opdage unikke cytologiske ændringer og strukturer under mandlige prophase progression herunder meiotiske sex kromosom Inaktiveringen (MSCI) og centrosome dobbeltarbejde. (D) Pachytene fase spermatocytes gennemgår MSCI blev fundet ved hjælp af antistoffer mod yH2AX (Ser139) at mærke sex-organ (grøn, pilespids), og centromeres er vist med rødt. (E) Diplotene fase spermatocytes blev identificeret ved hjælp af antistoffer mod SYCP3 (rød) og centrosomes (pilespids) blev fundet ved hjælp af antistoffer mod Centrin-3 (grøn) og Pericentrin (magenta) for at mærke centrioler og pericentriolar materiale/matrix, henholdsvis. Skalalinjen = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Varen | Beløb | Endelig koncentration |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabel 1: Fix/lysis løsning. Beskrivelse/kontrol: Justere pH 9 med NaOH [50mM]. Wrap beholderen for løsning i aluminiumsfolie at beskytte mod lys og opbevares ved 4 ° C. Brug ikke fix/lysis løsning hvis mere end en uge gammel. Solid PFA kan også bruges til at lave løsningen. Brug af en fumehood anbefales at undgå PFA eksponering.
| Varen | Beløb | Endelig koncentration |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (w/v) |
| Hest Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 i PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabel 2: antistof fortynding buffer (ADB) opskrift. Beskrivelse/kontrol: Butikken ADB ved 4 ° C eller fryse bestande ved-20 ° C Hvis lave større mængder. ADB kan blive forurenet, så sørg for god aseptisk teknik anvendes og vurdere løsning for kontaminering inden hver anvendelse. Forberede mindre delprøver af ADB at minimere forurening.
| Celletype | Cellulære proces | Musen alder (Dansk Folkeparti) |
| Leptotene | DNA DSB dannelse | 10 - 12 |
| Montering af aksial elementer | ||
| Zygotene | Indledning af homologe DSB reparation og synapsis | 12 - 16 |
| Pachytene | Færdiggørelsen af autosomal DSB reparation | 16 - 20 |
| Modning af crossover rekombination begivenheder | ||
| Komplet synapsis mellem homologs | ||
| Meiotiske Sex kromosom Inaktiveringen (MSCI) | ||
| Centriole dobbeltarbejde/Centrosome modning | ||
| Diplotene og Diakinesis | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Centrosome adskillelse | ||
| Metafase jeg | Spindel Checkpoint | 22 - 26 |
| Runde Spermatid | Protamine udskiftning | > 24 |
| Acrosome dannelse |
Tabel 3: nær synkron første bølge af spermatogenesen i juvenile mus. Beskrivelse/kontrol: Konkrete etaper af spermatogenesen er beriget på forskellige stadier af juvenile mus udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mus har vist sig for at være en nyttig model organisme for at studere de cellulære begivenheder, der styrer meiotiske progression i spermatogenesen. Yderligere, det er nødvendigt at udvikle værktøjer dækket til studiet af spermatogenesen, fordi mange begivenheder, såsom exit fra meiotiske prophase jeg, er seksuelt dimorfe. Denne protokol beskriver en seminiferous tubulus squash metoden for visualisering og undersøgelse af forskellige stadier af musen spermatogenesen. Denne metode bevarer cellulære integritet og giver mulighed for dermed detaljerede analyser af nukleare og cytoplasmatisk strukturer. De repræsentative resultater afbildet i denne undersøgelse påvise nytten af denne protokol i vurderingen af primær spermatocytes gennemgår meiotiske progression. Denne protokol kan desuden også bruges til at studere andre cellulære processer under spermatogenesen, herunder spredning og differentiering af spermatogonia og stadier af spermiogenesis27,28. De beskrevne metoder er inden for er tilpasset fra tidligere beskrevet tubulus squash teknikker8,9. Denne protokol er dog den første detaljerede guide, der dækker alle reagenser og trin, der kræves, at skaffe tubuli at visualisere enkelt celler via Fluorescens mikroskopi. Derudover har vi præsenteret billeder på ekstra cellulære funktioner, herunder centriole og telomere buket, som kan visualiseres med teknikken.
Der er et par tekniske elementer, der er nøglen til at optimere tubulus squash præparater. For det første skal man anvende den korrekte mængde kraft til glas coverslip. Undladelse af at anvende tilstrækkelig kraft vil producere dias med par vedhængende celler, som de fleste celler forbliver inden for de seminiferous tubules. For det andet skal en Ruger testis materiale i den lave/lysis løsning til i passende længde af tid. Generelt, fiksering bør begrænses til 5 min, men et interval mellem 5 og 15 min er acceptabel. Tubuli, der er fastsat i en længere periode vil være vanskeligt at manipulere og giver dårlige resultater. Det er dog muligt at udvide inkubationstiden ved at reducere koncentrationen af PFA. For eksempel sænke procent PFA til 0,5% ville give mulighed for øget inkuberingstider i rettelse/lysis løsning. I den metode, vi har fremlagt, sker de permeabilization og fiksering samtidigt, men disse trin kan udføres efter hinanden, henholdsvis. Adskille permeabilization og fiksering trinene kan bidrage til at reducere niveauet af cytoplasmatisk baggrund signal. Variation af fiksation og/eller permeabilization strategier kan også blive testet for at optimere betingelserne for vurdering af en specifik subcellulært struktur eller antistof. For eksempel, visualisering af centrosomal og spindel proteiner kan forbedres ved hjælp af methanol i stedet for PFA29,30,31. Desuden er det fordelagtigt at bruge juvenile mus, der går gennem den første bølge af spermatogenese (ca 10-26 dpp) til specifikt og håndfast visualisere sjældne meiotiske cellulære begivenheder12. Alternativt er det muligt at isolere fase-specifikke meiotiske celler fra voksne mus ved at observere lysabsorption mønster i seminiferous tubulus32. Givet den asynkrone cyklus af spermatogenesen i voksen mus, men kan analysere sjældne meiotiske begivenheder i detaljer være udfordrende. Denne begrænsning kan overvindes ved at indsprøjte mus med bisdichloroacetyldiamine, vinde 18,446, hvilke blokke a-vitamin stofskiftet og stopper spermatogonial differentiering33. Efter behandling med vinde 18,466, genoptagelse af spermatogenesen vil forekomme synkront, giver store mængder af beriget kønscelle befolkninger fra en ældre dyr34. Denne synkronisering strategi kan bruges før tubulus squash teknik til at undersøge forskellene mellem de første semisynkron bølger af spermatogenesen til dem, der opstår i voksen35,36, 37. Desuden korrelation mellem faderlige aldring og aneuploidi kunne også vurderes ved hjælp af WIN 18,466 synkronisering og vurdering af kromosom adskillelse med metoden tubulus squash.
I Resumé, kan denne metode bruges sammen med immunofluorescens mikroskopi for at observere celler i forskellige stadier af spermatogenesen. Anvendes mere bredt, denne teknik kan også bruges til at vurdere delpopulationer af spermatogonia, spermatocytes og spermatider, og kan være skræddersyet til at studere en bred vifte af processer i spermatogenesen. Denne tilgang har været brugt til levende celle imaging af spermatocytes, og modificeret til at gennemføre en række cellulære og biokemiske undersøgelser38,39,40. Tubulus squash teknik er blevet brugt for mus og rotter seminiferous tubules, tyder på, at det let bør anvendes på andre pattedyr systemer, herunder menneskelige40. Denne teknik kan hjælpe med at definere de cellulære forstyrrelser, der giver anledning til infertilitet og sperm aneuploidi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIGMS (R01GM11755) til P.W.J. og af en uddannelse grant stipendium fra National Cancer Institute (NIH) (CA009110) til S.R.W. og J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
