Summary
Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.
Abstract
Meiotische progressie bij mannen is een proces dat de gezamenlijke actie van een aantal sterk gereguleerde cellulaire gebeurtenissen vereist. Fouten die zich voordoen tijdens de meiose kunnen leiden tot onvruchtbaarheid, zwangerschap verlies of genetische afwijkingen. Te beginnen bij het begin van de puberteit en blijft tijdens volwassenheid, continu halfsynchrone golven van spermatocyten spermatogenese ondergaan en uiteindelijk vormen haploïde sperma. De eerste golf van muis spermatocyten ondergaan Meiotische initiatie verschijnen op dag 10 post-partum (10 dpp) en worden uitgebracht in het lumen van seminiferous buisjes als volwassen sperma op 35 dpp. Daarom is het voordeligste muizen binnen dit ontwikkelings tijd-venster gebruiken om het verkrijgen van hoogverrijkt populaties van belang. Analyse van zeldzame cel stadia is moeilijker in oudere muizen als gevolg van de bijdrage van opeenvolgende in golven, die de diversiteit van de cellulaire bevolking binnen de tubuli te verhogen. De hier beschreven methode is een gemakkelijk uitgevoerde techniek voor de cytologische beoordeling van de cellen binnen de seminiferous buisjes van muizen, waaronder testis, spermatocyten en spermatids gevonden. De zaadvormende squash techniek handhaaft de integriteit van geïsoleerde mannelijke geslachtscellen en laat onderzoek van cellulaire structuren die niet gemakkelijk met andere technieken worden gevisualiseerd. Om aan te tonen van de mogelijke toepassingen van deze zaadvormende squash techniek, werd spindel vergadering gecontroleerd in de profase aan metafase die ik overgang modeltraject spermatocyten (overgang van G2/MI). Daarnaast, werden centrosoom duplicatie, Meiotische sex chromosoom inactivering (MSCI) en chromosoom boeket vorming beoordeeld als voorbeelden van de cytologische structuren die kunnen worden waargenomen met behulp van deze methode zaadvormende squash. Deze techniek kan worden gebruikt voor het lokaliseren van specifieke gebreken tijdens spermatogenese die worden veroorzaakt door mutatie of exogene perturbation, en dus, draagt bij aan onze moleculaire begrip van de spermatogenese.
Introduction
Meiose is een complexe cellulaire evenement waarin een ronde van DNA-replicatie wordt gevolgd door twee opeenvolgende ronden van de celdeling. Verschillende meiose-specifieke gebeurtenissen moet tijdens de eerste stadia van meiose om ervoor te zorgen nauwkeurige chromosoom segregatie gecoördineerd zijn. Deze gebeurtenissen omvatten de voltooiing van homologe recombinatie, mede richting van zuster kinetochoren tijdens de eerste Meiotische klasse, en de stapsgewijze verlies van cohesin complexen op te lossen chiasmata tussen homologen. Precieze regulatie van deze processen is noodzakelijk om vruchtbaarheid en ter voorkoming van chromosoom missegregation gebeurtenissen die tot genetische ontwikkelingsstoornissen en spontane miskraam1 leiden kunnen.
Terwijl de belangrijkste gebeurtenissen van meiose in zowel mannen als vrouwen plaatsvindt, bestaan temporele en mechanistische verschillen tussen spermatogenese en ooegenese2. Bijvoorbeeld, tijdens de vrouwelijke meiose, profase I optreedt tijdens de embryonale ontwikkeling en arrestaties in het stadium van de dictyate tot de puberteit. Daarentegen begint spermatogenese bij puberteit en vordert in golven hele volwassen leven zonder arrestatie. De verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke meiose benadrukt de noodzaak tot het ontwikkelen van methoden die specifiek naar de beoordeling van deze processen in oöcyten en spermatocyten worden verzorgd. Op dit moment afhankelijk beoordelen Meiotische progressie grotendeels van het gebruik van chromatine spreads3,4,5. Terwijl chromatine spreads nuttig zijn voor het bestuderen van Meiotische chromosomen, verzuimen om cellulaire integriteit, voorkomen van evaluatie van cellulaire structuren zoals spindel microtubuli, centrosomes, de nucleaire envelop en telomeer bijlagen te behouden. Wonen beeldvorming en op lange termijn kweken technieken hebben zeer geavanceerde ons begrip van vrouwelijke meiose; soortgelijke benaderingen te visualiseren de hele intact cel, zijn echter minder vaak geïmplementeerd voor de studie van de spermatogenese6,7. Om te visualiseren dynamische gebeurtenissen in de gehele mannelijke meiose, hebben we aangepast gevestigde zaadvormende squash technieken om te snel beoordelen de cytologische functies muis spermatocyten8,9te ontwikkelen. De hier beschreven methode onderhoudt de integriteit van de cel, de studie van meerdere cellulaire structuren inschakelen tijdens verschillende stadia van de spermatogenese.
Deze zaadvormende squash techniek is een benadering van de hele cel, die het mogelijk voor de beoordeling van cellulaire structuren via immunofluorescentie microscopie maakt. Gemeenschappelijke histologische benaderingen te visualiseren Meiotische progressie in mannelijke muizen zoals haematoxylin en eosine kleuring van paraffine ingesloten testes en immunefluorescentie labeling van cryosecties is voorzien van een breed overzicht van Meiotische progressie. Echter deze technieken niet om te zetten in afzonderlijke cellen voorzover nodig voor de gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens de meiose10,11. Alternatieve technieken om te visualiseren Meiotische processen is afhankelijk van de verstoring van de belangrijke chemiosmotic om de spermatocyte te isoleren en oplossen van kernmateriaal3,4,5. Deze chemische behandelingen een belemmering vormen voor de waarneming van celtypes dan primaire spermatocyten. Een recent beschreven methode door Namekawa de onderzoekgemeenschap voor het behoud van de nucleaire architectuur van geïsoleerde spermatocyten heeft ingeschakeld, maar vereist het gebruik van een cytospin en accessoires die niet mag beschikken sommige laboratoria4. In tegenstelling, vereist de zaadvormende squash techniek alleen apparatuur die over het algemeen standaard is in de meeste cel biologie laboratoria.
De zaadvormende squash hier beschreven methode kan worden gebruikt om de verschillende celtypen gevonden binnen de seminiferous zaadvormende, met inbegrip van de sertoli-cellen, spermatogonia, primaire en secundaire spermatocyten en spermatids te visualiseren. Door deze techniek te koppelen met de in de buurt van de synchrone eerste golf van de spermatogenese bij jonge muizen, is het mogelijk te krijgen verrijkt populaties in cellen als zij vooruitgang door middel van meiose12. Dit proces staat een gedetailleerde analyse van processen in de gehele spermatogenese, zoals vroege profase gebeurtenissen, de G2/MI en de metafase, anafase overgangen en spermiogenesis. Bovendien kunnen zaadvormende squash preparaten worden gebruikt om te visualiseren cytologische kenmerken van de chromosomen (b.v. interchromatid domeinen (ICDs) en kinetochoren) en centrosomes (centrioles en pericentriolar materiaal/matrices). De squash-methode kan gemakkelijk worden uitgevoerd in parallel met andere experimentele benaderingen, zoals chromatine spreads en eiwit extractie. Bovendien is deze techniek met succes gewijzigd om te storten van levende in cellen op dia's voor directe visualisatie13.
De hier beschreven methode omvat een hele cel seminiferous zaadvormende squash techniek voor het analyseren van de overgang van G2/MI in wild-type C57BL/6J muizen. De cytologische kenmerken van primaire spermatocyten invoeren de eerste Meiotische klasse werden gevisualiseerd met immunofluorescentie microscopie te observeren de Meiotische spindel. Deze veelzijdige techniek kan eenvoudig worden aangepast om te visualiseren andere Meiotische etappes en de verschillende soorten cellen. De techniek is ook vatbaar voor alternatieve visualisatie strategieën, zoals DNA en RNA vis benaderingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van muizen werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruiken Comité van Johns Hopkins University. Experimenten werden uitgevoerd op juveniele (20-26 dagen post-partum, dpp) C57BL/6J muizen, profiteren van de halfsynchrone eerste golf van de spermatogenese. Echter, deze techniek kan ook worden uitgevoerd met behulp van volwassen muizen.
1. dissectie en isolatie van muis seminiferous buisjes
- Bereiden de fix/oplossing en antilichaam verdunning lysisbuffermengsel (ADB) beschreven in tabel 1 en tabel 2.
- Een 35-mm petrischaal met 3 mL 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1 x PBS, pH 7.4), en een andere 35-mm schotel met 2 mL lysis van de fix/oplossing per muis voorbereiden.
- De muis via cervicale dislocatie of CO2 verstikking offeren en spray de ventrale buik met 70% ethanol. Open de holte van de abdominopelvic met behulp van steriele schaar, een V-vormige opening maken. Dan verwijderen van de teelballen door te trekken op de epididymaire vet pad met behulp van Tang, en dat niet wordt verstoord de tunica albuginea. Plaats de teelballen in een 35-mm petrischaal met 1 x PBS.
Opmerking: De eerste golf van de spermatogenese gebruiken om een verrijkte celpopulatie van belang14observeren. Specifieke stadia van de spermatogenese zijn verrijkt op verschillende muis leeftijd (tabel 3). - De testiculaire tunica albuginea verwijderen door het weefsel te prikken met een scherpe omver te werpen Tang en het verzamelen van de losse seminiferous buisjes. De tubuli overbrengen in een petrischaal voor nieuwe 35-mm, met 2 mL lysis van de fix/oplossing.
- Incubeer de tubuli in de fix/lysis van de oplossing gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
2. voorbereiding van seminiferous buisjes
- Bereid een poly-L-lysine gecoate glasplaatje door het schetsen van de randen van de dia met een vloeibare blocker pen.
- Breng 100 µL van fix/lysis van de oplossing naar het midden van het glasplaatje.
- Met behulp van steriele Tang en schaar plagen voorzichtig uit elkaar de seminiferous buisjes. Snijden van lang individuele zaadvormende segmenten ongeveer 20 mm in lengte.
Opmerking: Visualiseren van structuren die gevoelig voor langdurige kleefpoeders blootstelling, zoals de centrosomes zijn, de tubuli in de 1 x PBS eerst scheiden, dan direct mince de tubuli op het oppervlak van de poly-lysine dia's bekleed in 100 µL van lysis van de fix oplossing. - Vijf 20 mm lang seminiferous zaadvormende segmenten overbrengen in de bereid poly-L-lysine gecoate glasplaatje met fix/lysis van de oplossing.
- Met behulp van steriele schaar gehakt seminiferous buisjes in segmenten van 1,5 tot 3,0 mm.
- Met behulp van steriele pincet regelen de zaadvormende segmenten op het glasplaatje, zodat geen weefsel overlapt, en de tubuli gelijkmatig zijn verdeeld.
Opmerking: Het optimale aantal zaadvormende segmenten op een glasplaatje ligt tussen 20 en 40.
3. het pletten van de seminiferous buisjes
- Het glasplaatje met verspreide seminiferous zaadvormende segmenten op een benchtop overbrengen. Verwijder overtollige vloeistof met behulp van het wissen van een laboratorium om te voorkomen dat het verlies van weefsel tijdens de squash-stap.
- Breng een dekglaasje aan (22 x 60-1,5 mm) op de top van het glasplaatje en druk met de hiel van de palm uitoefenen gedurende 10-20 seconden. Het is belangrijk om voldoende kracht te verspreiden spermatocyten uit de seminiferous buisjes.
Opmerking: Observeer de tubuli met behulp van een Microscoop dissectie oog op het optimaliseren van de vervorming stap zodat alle zaadvormende segmenten worden verstoord. - Met behulp van dia pincet, onmiddellijk flitser bevriezen de glasplaatje in een kleine dewar van vloeistof N2 gedurende 15 seconden of totdat de vloeistof niet langer bubble. Als immunolabeling verwijderen onmiddellijk het dekglaasje aan met een scheermesje richtliniaal, prima tip pincet of naald 21-gauge.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat immunolabel de dia's onmiddellijk (zie stap 4). Echter, op dit punt dia's kunnen worden bewaard bij-80 ° C voor maximaal twee weken. Maximaliseren van de levensduur van eiwitten en cellulaire structuren, onmiddellijk de dia's opslaan op droog ijs of overdracht naar een vriezer-80 ° C, en het dekglaasje aan op de dia te houden. Wanneer immunolabeling dia's opgeslagen, verwijder het dekglaasje aan door de dia's in vloeibare N2 onder te dompelen gedurende 15 seconden, zoals beschreven in stap 3.3.
4. Immunolabeling van gekoppelde seminiferous buisjes
- Dompel de dia in 1 x PBS en wassen drie keer, gedurende 5 minuten in een 50 mL Coplin pot met 1 x PBS.
Opmerking: Nooit toestaan dat de dia's volledig droog tijdens immunolabeling. - 1 mL van antilichaam verdunning buffer op het glasplaatje te blokkeren voor 1-2 h in een bevochtigde kamer van toepassing.
- Verwijder de antilichaam verdunning buffer en breng 100 µL van primair antilichaam verdund in antilichaam verdunning buffer in een bevochtigde kamer.
Opmerking: Voor de beste resultaten, incubeer primaire antilichamen 's nachts bij 4 ° C. Gebruik kleinere volumes van antilichaam (bijvoorbeeld 50 µL) door die betrekking hebben op de dia met een dekglaasje aan of parafilm. Valideren en optimaliseren van primaire antilichamen15. - Spoel de dia's drie keer, gedurende 5 min in een 50 mL Coplin pot met 1 x PBS.
Opmerking: Verbeteren wast, Coplin potten met behulp van een kleine magnetische roer bar doorroeren en plaats op een plaat van de magnetische roer bij lage snelheid, of naar de Coplin pot op een tafelblad mixer op lage snelheid. - Breng 100 µL van secundair antilichaam verdund in antilichaam verdunning buffer gedurende 1 tot 1,5 uur in een bevochtigde ruimte bij kamertemperatuur. Incubeer de dia's in een donkere kast te vermijden foto bleken van fluorophore geconjugeerde antilichamen.
Opmerking: Gebruik kleinere volumes van antilichaam (bijvoorbeeld 50 µL) door die betrekking hebben op de dia met een dekglaasje aan of parafilm. - Spoel dia's twee keer voor 5 min in een 50 mL Coplin pot met 1 x PBS.
- Monteren van de dia's in de montage opslagmedium met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) en coverslips (22 x 60-1,5 mm) van toepassing.
- Het zegel van de coverslips op de dia's met duidelijke nagellak aan de dia's te behouden en te voorkomen dat de coverslips.
5. analyse en beeldvorming zaadvormende squash preparaten
- Gebruik een epifluorescence Microscoop met geautomatiseerde fase waarmee nauwkeurige beweging van de z-as en een hoge resolutie camera voor het vastleggen van het beeld. Ook gebruiken een laser confocal microscoop.
Opmerking: Gebruik alle beschikbare hardware en software voor deze stap. Bijvoorbeeld werden afbeeldingen weergegeven in Figuur 1 en Figuur 2 gevangen met behulp van een Zeiss cel waarnemer Z1 gekoppeld aan een ORCA-Flash 4.0 CMOS-camera en geanalyseerd met de Zeiss ZEN 2012 blue edition beeld-software. - Beoordelen van de dia's met behulp van een 20 X doelstelling om de kwaliteit van de voorbereiding van squash. Goede kwaliteit dia's krijgen een monolayer van kernen die gelijkmatig verdeeld zijn.
Opmerking: Sommige delen van de dia kunnen beter zijn dan anderen, is het nuttig om op te merken van de coördinaten van waar de beste regio's van de dia kunnen worden gevonden voor verdere analyse met behulp van hogere vergroting. - Met behulp van hogere vergroting doelstelling (bijvoorbeeld 63 X of 100 X), capture-regio's van de dia die een consistente enkelgelaagde van kernen hebben. Zodra een regio wordt geselecteerd, de bovenste instellen en lagere Z-stacks om ervoor te zorgen dat alle in-focus licht wordt vastgelegd.
Opmerking: Het optimale aantal Z-stacks gevangen tussen de bovenste en onderste grenswaarden is over het algemeen aangewezen door de afbeelding acquisitie software en is verschillend voor elke doelstelling. - Gebruik de beeld processing software te compileren van een uitgebreide diepte focus afbeelding. De software combineert het licht in-focus van elke Z-stack, en is essentieel voor optimale beeldvorming van zaadvormende squash preparaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier, wij zijn gewend de zaadvormende squash methode visualiseren voorbijgaande cel populaties ondergaan de profase aan metafase ik (G2/MI) overgang, die werden verrijkt door het oogsten van de teelballen van jonge wild-type muizen ondergaan de eerste golf van de spermatogenese (24 DPP). Figuur 1 toont beelden van de vertegenwoordiger van de verschillende fasen van de cel die kunnen worden gevisualiseerd met behulp van de methode zaadvormende squash. Populaties van metafase verrijkt ik spermatocyten waren gevisualiseerd met behulp van antilichamen tegen alpha-tubuline (figuur 1A). We gebruikt markers voor vroege en late meiose I tot en met fase Meiotische progressie. Zaadvormende squash voorbereidingen waren immunolabeled met een antilichaam aan de synaptonemal complex proteïne, SYCP3, te visualiseren stadia van profase I. Leptotene/zygotene en pachytene/diplotene spermatocyten worden weergegeven in figuur 1B. Spermatocyten ondergaan de eerste Meiotische klasse kunnen duidelijk worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen alpha-tubuline (figuur 1A en 1 C). Studeren laat Meiotische gebeurtenissen, werden zaadvormende pompoenen immunolabeled met behulp van antilichamen tegen de celcyclus kinase Aurora B (AURKB), die naar de innerlijke centromeer tijdens de metafase lokaliseert, vervolgens naar de spindel midzone en decolleté furrow tijdens relocalizes Anafase en cytokinese, respectievelijk (Figuur 1 c). Cytologische kenmerken van chromosomen werden tijdens de eerste Meiotische verdeling gevisualiseerd. Om te zien hoe ICDs, squash zaadvormende voorbereidingen waren immunolabeled met behulp van antilichamen tegen de subeenheid van de meiose-specifieke alpha-kleisin van cohesin, REC8 (Figuur 1 d). Chromosoom dynamiek tijdens anafase werden beoordeeld met behulp van alpha-tubuline immunolabelling en de DNA-vlek, DAPI. Een succesvolle afronding van de eerste Meiotische klasse spermatocyte is afgebeeld in figuur 1E, terwijl een spermatocyte met een brug anafase wordt getoond in figuur 1F. Met behulp van de zaadvormende squash techniek, Meiotische spindel lengte, chromosoom uitlijning en segregatie kunnen worden gemeten en vergeleken tussen de mutant en bestrijding van muizen.
Het nut van deze methode voor visualisatie van extra celcyclus-overgangen en subcellular structuren die zijn gekoppeld aan de profase ik wordt geïllustreerd in Figuur 2. Tijdens de substage van de leptotene van de profase wordt I, inleiding van de homologe chromosomen in paren rangschikken gemedieerd door dynamische veranderingen in telomeer bijlagen voor het opwekken van de vorming van chromosoom clusters geconfronteerd met een enkelpolige van de nucleaire envelop (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. deze conformatie, bekend als het chromosoom "bouquet" wordt beschouwd als het vergroten van de kans en de frequentie van Inter homolog interacties (figuur 2A). Inleiding en de voltooiing van synapsis tussen homologe chromosomen optreedt tijdens de zygotene (figuur 2B) en pachytene substages (figuur 2C), respectievelijk, overeenkomend met progressieve versnippering van de chromosoom boeket. Synapsis en chromosoom boeket dynamiek in jonge muizen, we immunolabeled zaadvormende squash preparaten met antilichamen tegen SYCP3 en de centromeren, gelijktijdig te beoordelen en gekleurd voor DNA met behulp van de DAPI. Muis chromosomen zijn telocentrisch, dus centromeer immunolabeling werd gebruikt om de opsporing van wijzigingen in telomeer NE bijlagen.
Meiotische sex chromosoom inactivering (MSCI) is een kenmerk die uniek zijn voor mannelijke meiose, waarbij de niet-homologe X en Y chromosomen omzeilen checkpoint activering door het ondergaan van chromosoom bestrijkende fosforylatie van Histon variant H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. De X-en Y-chromosoom paar is transcriptionally het zwijgen opgelegd en gecompartimenteerd in een dichte nucleaire subdomein noemde de "seks lichaam." Spermatocyten ondergaan MSCI kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd tijdens de pachytene en diplotene substages door immunolabeling zaadvormende squash preparaten met antilichamen aan yH2AX (Ser139). Figuur 2D beeldt een spermatocyte op de pachytene substage immunolabelled met antilichamen tegen yH2AX (Ser139), de centromeren en gekleurd met DAPI te visualiseren van het DNA.
Centrosoom duplicatie is semi-conservatieve en treedt op tijdens de profase die i van mannelijke meiose na voltooiing van DNA herstellen om ervoor te zorgen dat elke resulterende dochtercel twee centrioles (één centrosoom overneemt) na de celdeling24,25 . Centrosomes bestaan uit twee orthogonaal gearrangeerde centrioles verbonden door een flexibele linker en zijn omgeven door een amorfe matrix van eiwitten bekend als de pericentriolar materiaal/matrix (PCM)26. Na dubbele de substage van de pachytene, gevormde nieuw centriool pairs los van elkaar en centrosoom rijping en migratie naar tegenovergestelde Polen tijdens de diplotene fase om de vorming van bipolaire spindels ondergaan. Een vroege diplotene spermatocyte ondergaan disjunctie van nieuwgevormde centriool paren werd gevisualiseerd door immunolabeling zaadvormende squash preparaten met antilichamen tegen pericentrin (PCNT), een onderdeel van de eiwitten van de PCM en Centrin-3 (CETN3) te markeren centrioles (figuur 2E). Enscenering werd bepaald met behulp van antilichamen tegen SYCP3, en DAPI werd gebruikt om de vlekken van DNA.
Figuur 1 : Representatieve analyse van de Meiotische G2/MI overgang met behulp van zaadvormende squash preparaten. Zaadvormende squash voorbereidingen werden uitgevoerd op seminiferous zaadvormende segmenten van C57BL/6J muizen leeftijd 24 dpp. (A) vertegenwoordiger inzake ontwikkeling spermatocyten immunolabeled met antilichamen tegen alpha-tubuline (rood), centromeren (groen) en het DNA vlek DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blauw). (B) Wild-type zaadvormende pompoenen werden gekleurd met DAPI (blauw) en immunolabeled met antilichamen tegen alpha-tubuline (rood), en het laterale element van de SC, SYCP3 (groen). (C) Wild-type zaadvormende pompoenen werden gekleurd met DAPI (blauw) en immunolabeled met antilichamen tegen alpha-tubuline (rood), en de groene celcyclus kinase AURKB (). Cytologische kenmerken van chromosomen zoals ICDs en anafase bruggen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van zaadvormende squash preparaten. (D) om te zien hoe de ICDs, de prometaphase spermatocyten waren immunolabeled met antilichamen tegen centromeren (rood) en een component Meiotische specifieke cohesin, REC8 (groen) en gekleurd met DAPI (blauw). (E, F) Chromosoom morfologie werd gevisualiseerd tijdens anafase met antilichamen tegen alpha-tubuline (rood), centromeren (groen), en de DAPI vlek (blauw). Een volledige aanvulling van de ontwikkeling van spermatocyten kan worden geïdentificeerd met behulp van de zaadvormende squash techniek (L/Z, leptotene/zygotene stadium spermatocyten; P/D, pachytene/diplotene stadium spermatocyten; P.M., prometaphase spermatocyten; M, metafase spermatocyten; A, anafase spermatocyten). Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbeelden van extra morfologische veranderingen en structuren gekoppeld Meiotische profase progressie in mannetjes met behulp van zaadvormende squash preparaten. Zaadvormende squash voorbereidingen werden uitgevoerd op seminiferous zaadvormende segmenten van C57BL/6J muizen veroudering van 12-18 dpp en werden gekleurd met DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blauw) op het etiket van DNA. (A-C) Homolog synapsis is gekoppeld aan de vorming en de progressieve versnippering van het chromosoom "bouquet" tijdens de profase progressie. Leptotene (A), zygotene (B)en pachytene (C) fase spermatocyten waren immunolabeled met antilichamen tegen SYCP3 (rood) en de centromeren (groen). (D-E) Zaadvormende squash preparaten kan worden gebruikt om unieke cytologische wijzigingen te herkennen en datastructuren tijdens mannelijke profase I progressie waaronder Meiotische sex chromosoom inactivering (MSCI) en centrosoom duplicatie. (D) Pachytene stadium spermatocyten ondergaan MSCI werden waargenomen met behulp van antilichamen tegen yH2AX (Ser139) op het etiket van het geslacht-lichaam (groen, pijlpunt), en centromeren worden in rood weergegeven. (E) Diplotene stadium spermatocyten werden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen SYCP3 (rood) en centrosomes (pijlpunt) werden waargenomen met behulp van antilichamen tegen Centrin-3 (groen) en Pericentrin (magenta) op het etiket van de centrioles en de pericentriolar materiaal/matrix, respectievelijk. Schaal bar = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Item | Bedrag | Eindconcentratie |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 in PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabel 1: Fix/lysis oplossing. Beschrijving: Breng de pH op 9 met NaOH [50mM]. De container van oplossing wikkel in aluminiumfolie te beschermen tegen licht en bewaren bij 4 ° C. Gebruik niet de correctie/lysis oplossing indien meer dan een week oud. Solide PFA kan ook worden gebruikt om de oplossing te maken. Gebruik van een fumehood wordt aanbevolen om Vermijd PFA blootstelling.
| Item | Bedrag | Eindconcentratie |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (m/v) |
| Paard Serum | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 in PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabel 2: antilichaam verdunning de recept van de buffer (ADB). Beschrijving: Winkel ADB bij 4 ° C of bevriezing bij-20 ° C als het maken van grotere hoeveelheden voorraden. ADB besmet kunt raken, zorg ervoor dat goede aseptische technieken worden gebruikt en de oplossing voor besmetting vóór elk gebruik beoordelen. Bereiden van kleinere hoeveelheden van ADB om te minimaliseren van verontreiniging.
| Celtype | Cellulaire proces | Muis leeftijd (dpp) |
| Leptotene | DNA DSB vorming | 10 - 12 |
| Vergadering van axiale elementen | ||
| Zygotene | Inleiding van homologe DSB reparatie en synapsis | 12 - 16 |
| Pachytene | Voltooiing van autosomaal DSB reparatie | 16 - 20 |
| Rijping van de crossover recombinatie evenementen | ||
| Volledige synapsis tussen homologen | ||
| Meiotische Sex chromosoom inactivering (MSCI) | ||
| Centriool duplicatie/centrosoom rijping | ||
| Diplotene en diakinese | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Centrosoom scheiding | ||
| Metafase ik | Spindel Checkpoint | 22 - 26 |
| Ronde Spermatid | Tijdje vervanging | > 24 |
| Acrosoom vorming |
Tabel 3: in de buurt van de synchrone eerste golf van de spermatogenese bij jonge muizen. Beschrijving: Specifieke stadia van de spermatogenese zijn in verschillende stadia van ontwikkeling van de jonge muis verrijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Muizen hebben bewezen als een nuttig model-organisme voor het bestuderen van de cellulaire gebeurtenissen waaraan Meiotische progressie tijdens de spermatogenese. Verder is het noodzakelijk om instrumenten catered aan de studie van de spermatogenese omdat vele evenementen, zoals afmonsteren Meiotische profase I te ontwikkelen, zijn seksueel dimorphic. Dit protocol beschrijft een methode squash seminiferous zaadvormende voor visualisatie en studie van de verschillende stadia van muis spermatogenese. Deze methode behoudt cellulaire integriteit en daardoor kunt gedetailleerde analyses van nucleaire en cytoplasmatische structuren. De representatieve resultaten afgebeeld in deze studie tonen het nut van dit protocol bij het beoordelen van primaire spermatocyten ondergaan Meiotische progressie. Dit protocol kan bovendien ook worden gebruikt om te bestuderen van andere cellulaire processen tijdens spermatogenese, met inbegrip van de proliferatie en differentiatie van de testis en stadia van spermiogenesis27,28. De beschreven methoden zijn binnen zijn aangepast van eerder beschreven zaadvormende squash technieken8,9. Dit protocol is echter de eerste gedetailleerde gids, die betrekking hebben op alle reagentia en stappen die nodig zijn, in het bezit van de tubuli te visualiseren van afzonderlijke cellen via fluorescentie microscopie. Bovendien hebben we beelden gepresenteerd op extra cellulaire functies, waaronder de centriolen en het boeket telomeer, die met de techniek kan worden gevisualiseerd.
Er zijn een paar technische elementen die zijn de sleutel voor het optimaliseren van zaadvormende squash preparaten. In de eerste plaats moet een de juiste hoeveelheid kracht toepassen op het glas dekglaasje aan. Niet-toepassing van voldoende kracht zal produceren dia's met weinig Adherente cellen, aangezien de meeste cellen binnen de seminiferous buisjes blijven zal. Ten tweede moet een Incubeer het materiaal van de testis in de fix/lysis-oplossing voor de juiste lengte van de tijd. In het algemeen, fixatie moet beperkt blijven tot 5 minuten, maar een bereik tussen 5 en 15 min is aanvaardbaar. Tubuli die gedurende een langere periode zijn opgelost zal worden moeilijk te manipuleren en slechte resultaten opleveren. Het is echter mogelijk om uit te breiden van de incubatietijd door vermindering van de concentratie van PFA. Bijvoorbeeld het percentage PFA tot 0,5% verlagen zou voor grotere incubatie tijden in de fix/lysis van de oplossing. In de methode die wij hebben ingediend, de permeabilization en fixatie stappen uitgevoerd gelijktijdig, echter deze stappen kunnen worden uitgevoerd ene na de andere, respectievelijk. Scheiden van de permeabilization en fixatie stappen kan bijdragen aan het verminderen van cytoplasmatische achtergrond signaal. Variatie van strategieën voor fixatie en/of permeabilization kan ook voor het optimaliseren van de voorwaarden voor de beoordeling van een specifieke subcellular structuur of antilichaam worden getest. Bijvoorbeeld, visualisatie van centrosomal en spindel eiwitten kunnen worden verbeterd door het gebruik van methanol in plaats van PFA29,30,31. Bovendien, is het gunstig voor het gebruiken van de jonge muizen die verlopen via de eerste golf van de spermatogenese (ongeveer 10-26 dpp) om specifiek en krachtig visualiseren zeldzaam Meiotische cellulaire gebeurtenissen12. Anderzijds is het mogelijk om te isoleren van fase-specifieke Meiotische cellen van volwassen muizen door het observeren van het patroon van de absorptie van licht binnen de seminiferous zaadvormende32. De asynchrone cyclus van de spermatogenese gezien in volwassen muizen, kan zeldzame Meiotische gebeurtenissen in detail analyseren echter uitdagend. Deze beperking kan worden overwonnen door het injecteren van muizen met bisdichloroacetyldiamine, winnen 18,446, welke blokken vitamine A metabolisme en stopt spermatogonia differentiatie33. Na behandeling met winnen 18,466, hervatting van de spermatogenese zal synchroon, opbrengst van grote hoeveelheden van verrijkte geslachtscellen populaties van een volwassen dier34. Deze synchronisatie strategie kan vóór de zaadvormende squash techniek worden gebruikt voor het onderzoeken van de verschillen tussen de eerste halfsynchrone golven van de spermatogenese aan degenen die zich in de volwassen35,36,, voordoen 37. Voorts correlatie tussen de vaderlijke veroudering en aneuploïdie kan ook worden beoordeeld winnen 18,466 synchronisatie en beoordeling van chromosoom segregatie met de zaadvormende squash methode.
Kortom, kan deze methode worden gebruikt in combinatie met immunofluorescentie microscopie te observeren van cellen in verschillende stadia van de spermatogenese. Meer in het algemeen toegepast, deze techniek kan ook worden gebruikt om te beoordelen subpopulatie testis, spermatocyten en spermatids, en een breed scala processen bestuderen tijdens spermatogenese kan worden aangepast. Deze aanpak is gebruikt voor levende cellen imaging van spermatocyten en gewijzigd om een verscheidenheid van cellulaire en biochemische studies38,39,40. De zaadvormende squash techniek is gebruikt voor de muis en rat seminiferous buisjes, suggereren dat het gemakkelijk zou moeten worden toegepast op andere zoogdieren systemen, met inbegrip van menselijke40. Deze techniek kan helpen de cellulaire verstoringen die aanleiding tot onvruchtbaarheid en sperma aneuploïdie geven definiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door NIGMS (R01GM11755) naar P.W.J. en door een opleiding subsidie fellowship van het National Cancer Institute (NIH) (CA009110) S.R.W. en J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application? Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
