Summary
L’objectif de cette technique de courge tubule est d’évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de mettre au point les spermatocytes de souris tout en préservant l’intégrité cellulaire. Cette méthode permet l’étude de toutes les étapes de la spermatogenèse et peut être facilement mis en œuvre aux côtés d’autres approches biologiques biochimiques et moléculaires pour l’étude de la méiose de souris.
Abstract
La progression méiotique chez les mâles est un processus qui exige l’action concertée d’un certain nombre d’événements cellulaires très réglementés. Erreurs qui se produisent au cours de la méiose peuvent mener à l’infertilité, perte de grossesse ou des anomalies génétiques. Commençant au début de la puberté et tout au long de l’âge adulte, des ondes continues semi-synchrone des spermatocytes subissent la spermatogenèse et finalement forment les spermatozoïdes haploïdes. La première vague des spermatocytes de souris en cours de méiose initiation apparaissent au jour 10 après l’accouchement (10 dpp) et sont libérés dans la lumière des tubules séminifères comme les spermatozoïdes matures à 35 dpp. Par conséquent, il est avantageux d’utiliser des souris dans cette fenêtre de temps du développement afin d’obtenir des populations fortement enrichies d’intérêt. Analyse des étapes de rares cellules est plus difficile chez les souris âgées grâce à l’apport de la spermatogenèse vagues successives, qui augmentent la diversité des populations cellulaires dans les tubules. La méthode décrite ici est une technique facilement mis en œuvre pour l’évaluation cytologique des cellules trouvées dans les tubules séminifères des souris, y compris les spermatogonies, les spermatocytes et les spermatides. La technique de courge tubule maintient l’intégrité des cellules germinales des mâles isolés et permet l’examen des structures cellulaires qui ne sont pas facilement visualisés avec d’autres techniques. Pour illustrer les applications possibles de cette technique de courge tubule, l’axe a été suivie dans les spermatocytes progresse par le biais de la prophase à la métaphase qu'i de transition (transition G2/MI). En outre, duplication du centrosome, inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) et formation de bouquet de chromosomes ont été évalués comme exemples des structures cytologiques que l'on peut observer à l’aide de cette méthode de squash du tubule. Cette technique peut servir à repérer les défauts spécifiques au cours de la spermatogenèse qui résultent de la mutation ou perturbations exogènes, et contribue ainsi à notre compréhension moléculaire de la spermatogenèse.
Introduction
La méiose est un événement cellulaire complexe dans lequel un rond simple de réplication de l’ADN est suivi de deux cycles successifs de la division cellulaire. Plusieurs événements spécifiques à la méiose doivent être coordonnés au cours des stades de la méiose pour assurer la ségrégation des chromosomes précis. Ces événements comprennent l’achèvement de la recombinaison, orientation Co de sœur kinétochores au cours de la première division méiotique et la perte progressive des cohesin complexes pour résoudre les chiasmes entre homologues. Régulation précise de ces processus est nécessaire pour maintenir la fertilité et d’empêcher les événements de missegregation de chromosomes qui peuvent conduire à des troubles du développement génétiques et une fausse couche1.
Tandis que les principaux événements de la méiose ont lieu chez les mâles et les femelles, des différences temporelles et mécanistes significatives existent entre la spermatogenèse et l’ovogenèse2. Par exemple, au cours de la méiose femelle, prophase I se produit durant le développement embryonnaire et arrête au stade de la dictyate jusqu'à la puberté. En revanche, la spermatogenèse débute à la puberté et progresse dans les vagues tout au long de la vie d’adulte sans arrêt. Les différences entre mâle et femelle de la méiose met l’accent sur la nécessité de développer des méthodes qui sont spécifiquement pris en charge vers l’évaluation de ces processus dans les spermatocytes et les ovocytes. Actuellement, évaluer la progression méiotique en grande partie repose sur l’utilisation de la chromatine se propage3,4,5. Alors que les écarts de la chromatine sont utiles pour étudier les chromosomes méiotiques, ils ne parviennent pas à préserver l’intégrité cellulaire, empêchant l’évaluation des structures cellulaires tels que les microtubules du fuseau, centrosomes, l’enveloppe nucléaire et pièces jointes télomère. Imagerie en direct et des techniques de culture à long terme ont grandement contribué à améliorer notre compréhension de la méiose femelle ; des approches similaires pour visualiser toute la cellule intacte, cependant, sont moins fréquemment mis en oeuvre pour l’étude de la spermatogenèse6,7. Afin de visualiser les événements dynamiques tout au long de la méiose mâle, nous avons adapté des techniques de courge tubule établies pour évaluer rapidement les caractéristiques cytologiques de développer souris spermatocytes8,9. La méthode décrite ici préserve l’intégrité de la cellule, permettant l’étude des multiples structures cellulaires au cours de différentes étapes de la spermatogenèse.
Cette technique de courge tubule est une approche de cellules entières, ce qui permet pour l’évaluation des structures cellulaires par l’intermédiaire de la microscopie par immunofluorescence. Les approches histologiques communes de visualiser la progression méiotique chez les souris mâles comme hématoxyline et éosine coloration des testicules de paraffine incorporé, en les étiquetant par immunofluorescence des cryosections permettent une vue d’ensemble de la progression de la méiose. Toutefois, ces techniques ne parviennent pas à résoudre les cellules individuelles dans la mesure nécessaire pour une analyse détaillée des événements qui se produisent tout au long de la méiose10,11. Des techniques alternatives de visualiser les processus méiotiques dépendent de perturbation significative chimiosmotique le spermatocyte pour isoler et fixer les matières nucléaires3,4,5. Ces traitements chimiques empêchent l’observation des types de cellules autres que les spermatocytes primaires. Une méthode décrite récemment par Namekawa a permis à la communauté des chercheurs afin de préserver l’architecture nucléaire des spermatocytes isolés, mais nécessite l’utilisation d’un cytospin et accessoires qui ne sont peut-être pas facilement disponibles pour certains laboratoires4. En revanche, la technique de courge tubule requiert seulement l’équipement qui est généralement standard dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire.
La méthode de courge tubule décrite ici permet de visualiser les types de cellules diverses trouvées dans le tube séminifère, y compris les cellules de sertoli, spermatogonies, spermatocytes primaires et secondaires et les spermatides. En couplant cette technique avec la première vague près-synchrone de la spermatogenèse chez les jeunes souris, il est possible d’obtenir des populations enrichies de cellules spermatogéniques mesure qu’ils progressent à travers la méiose12. Ce processus permet l’analyse détaillée des processus tout au long de la spermatogenèse, tels que les événements précoces de la prophase, le G2/MI et métaphase aux transitions de l’anaphase et la spermiogenèse. En outre, les préparations tubule peuvent être utilisées pour visualiser les caractéristiques cytologiques des chromosomes (par exemple les domaines proposition (DCI) et les kinétochores) et les centrosomes (centrioles et péricentriolaire matériel/matrices). La méthode de courge peut être facilement effectuée en parallèle avec d’autres approches expérimentales, telles que la chromatine se propage et extraction de protéine. En outre, cette technique a été correctement modifiée pour déposer les cellules spermatogéniques vivantes sur les diapositives pour visualisation directe13.
La méthode décrite ici implique une technique de squash de tube séminifère germes entiers afin d’analyser la transition G2/MI chez les souris C57BL/6J de type sauvage. Les caractéristiques cytologiques de spermatocytes primaires entrant dans la première division méiotique ont été visualisés à l’aide de la microscopie par immunofluorescence pour observer le fuseau méiotique. Cette technique polyvalente peut être facilement modifiée pour visualiser les autres stades de la méiose et les différents types de cellules. La technique est également susceptible de stratégies alternatives de visualisation, comme les approches d’ADN et ARN poisson.
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Protocol
L’utilisation de la souris a été approuvée par le Comité utiliser de Johns Hopkins University et d’institutionnels animalier. Expériences ont été effectuées sur le jeune (20-26 jours après l’accouchement, dpp) souris C57BL/6J, profitant de la première vague semi-synchrone de la spermatogenèse. Cependant, cette technique peut également être réalisée utilisant des souris adultes.
1. la dissection et l’isolement des tubules séminifères souris
- Préparer le fix/solution et anticorps dilution tampon de lyse (ADB) décrit dans le tableau 1 et tableau 2.
- Préparer un plat de Pétri de 35 mm avec 3 mL de 1 x tampon phosphate salin (1 x PBS, pH 7,4) et un autre plat de 35 mm avec 2 mL de solution de correctif/lyse par souris.
- Sacrifier la souris via la dislocation cervicale ou CO2 asphyxie et pulvériser l’abdomen ventral avec l’éthanol à 70 %. Ouvrir la cavité abdominopelvienne avec des ciseaux stériles, faire une ouverture en forme de V. Puis retirer les testicules en tirant sur les coussinets adipeux épididymaires avec une pincette et ne pas perturber l' albuginée. Placer les testicules dans un 35 mm boîte de Pétri contenant 1 x PBS.
Remarque : Utiliser la première vague de la spermatogenèse afin d’observer une population de cellules enrichies d’intérêt14. Des étapes spécifiques de la spermatogenèse sont enrichies à des âges différents de la souris (tableau 3). - Retirer testicule albuginée perforera le tissu avec une pince bout pointu et récupérer les tubules séminifères lâches. Transférer les tubules vers un nouveau 35 mm boîte de Pétri contenant 2 mL de solution fix/lyse.
- Incuber les tubes dans la solution fix/lyse pendant 5 min à température ambiante.
2. préparation des tubules séminifères
- Préparer une lame de verre revêtu de poly-L-lysine en décrivant les bords de la lame avec un stylo liquide bloqueur.
- Déposer 100 µL de solution fix/lyse au centre de la lame de verre.
- À l’aide de la pince stérile et ciseaux distinguer doucement les tubules séminifères. Découpage de tubule individuel des segments environ 20 mm de longueur.
Remarque : Pour visualiser les structures qui sont sensibles à une exposition prolongée fixateur, tels que les centrosomes, séparer les tubules d’abord dans du PBS 1 x, puis émincer directement les tubules sur la surface de la glisse poly-lysine enduite dans 100 µL de solution fix-lyse. - Transfert en cinq segments de tube séminifère long de 20 mm à la diapositive de verre poly-L-lysine préparés contenant la solution fix/lyse.
- À l’aide de ciseaux stériles viande hachée tubules séminifères en segments de 1,5 à 3,0 mm.
- À l’aide de pince stérile arrange les segments tubulaires sur la lame de verre de sorte qu’aucun tissu ne chevauche, et les tubules sont distribués uniformément.
Remarque : Le nombre optimal de segments tubulaires sur une lame de verre est entre 20 et 40.
3. l’écrasement des tubes séminifères
- Transférer la lame de verre contenant des segments de tube séminifère dispersés sur une paillasse. Retirer le liquide en excès à l’aide d’une lingette de laboratoire pour éviter de perdre des tissus au cours de l’étape de la courge.
- Appliquez un lamelle couvre-objet (22 x 60-1, 5 mm) sur le dessus de la lame de verre et appliquer une pression avec le talon de la paume pendant 10 à 20 secondes. Il est important d’appliquer suffisamment de force pour disperser les spermatocytes de tubules séminifères.
Remarque : Observer les tubules à l’aide d’un microscope à dissection afin d’optimiser l’étape squashing afin que tous les segments tubulaires sont perturbées. - À l’aide de pinces de diapositive, immédiatement flash freeze la lame de verre dans un petit dewar de la liquide N2 pendant 15 secondes, ou jusqu'à ce que le liquide cesse à bouillonner. Si immunomarquage immédiatement, retirer la lamelle avec un grattoir à lame droite, fine pince de pointe ou aiguille de calibre 21.
Remarque : Pour des résultats optimaux, marquer les diapositives immédiatement (voir étape 4). Toutefois, à ce stade diapositives peuvent être conservés à-80 ° C pendant deux semaines. Pour maximiser la durée de vie des protéines et des structures cellulaires, immédiatement stocker la glisse sur neige carbonique ou transfert à un congélateur à-80 ° C et garder la lamelle couvre-objet sur la diapositive. Immunomarquage conservé diapositives, retirer le couvre-objet en immergeant les diapositives de liquide N2 pendant 15 secondes, comme indiqué au point 3.3.
4. l’immunomarquage des tubules séminifères montés
- Plonger la lame dans 1 x PBS et laver trois fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
Remarque : Ne jamais laisser les lames à sécher pendant l’immunomarquage. - Appliquer 1 mL de tampon de dilution des anticorps sur la lame de verre pour bloquer pendant 1-2 h dans une chambre humidifiée.
- Retirer le tampon de dilution des anticorps et déposer 100 µL de l’anticorps primaire dilué dans du tampon de dilution des anticorps dans une chambre humidifiée.
Remarque : Pour de meilleurs résultats, incuber les anticorps primaires durant la nuit à 4 ° C. Utiliser les petites quantités d’anticorps (par ex. 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm. Valider et optimiser les anticorps primaires15. - Rincer les lames trois fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
Remarque : Pour améliorer les lavages, agiter Coplin jars en utilisant une barre de petite agitation magnétique et placer sur une plaque d’agitation magnétique à faible vitesse ou placer la coloration sur une table de mixage table à basse vitesse. - Déposer 100 µL de l’anticorps secondaire dilué dans du tampon de dilution des anticorps pour 1 à 1,5 h dans une chambre humide à température ambiante. Incuber les lames dans une boîte sombre pour éviter photo blanchiment du fluorophore conjugué anticorps.
Remarque : Utiliser les petites quantités d’anticorps (par ex. 50 µL) en couvrant la lame avec une lamelle ou parafilm. - Rincer les lames deux fois pendant 5 min dans une coloration de 50 mL contenant 1 x PBS.
- Monter les lames dans le milieu de montage contenant 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 1,5 µg/mL) et d’appliquer des lamelles couvre-objet (22 x 60-1, 5 mm).
- Sceller les lamelles couvre-objet pour les lames avec des vernis à ongles transparent pour préserver les diapositives et empêcher que les lamelles couvre-objet.
5. analyse et préparations d’imagerie tubule
- Utiliser un microscope à épifluorescence avec scène automatisé qui permet le mouvement d’axe z précis et une caméra à haute résolution pour la capture de l’image. Vous pouvez également utiliser un microscope confocal laser.
Remarque : Utiliser n’importe quel matériel disponible et des logiciels pour cette étape. Par exemple, les images affichées dans la Figure 1 et Figure 2 ont été capturés à l’aide d’une cellule Zeiss observateur Z1 relié à une caméra CMOS 4.0 ORCA-Flash et analysées avec le logiciel d’image edition Zeiss ZEN 2012 bleu. - Évaluer les diapositives à l’aide d’un objectif 20 X pour déterminer la qualité de la préparation de la courge. Diapositives de bonne qualité ont une monocouche de noyaux qui sont réparties uniformément.
Remarque : Certaines sections de la diapositive peuvent être mieux que d’autres, il est utile de noter les coordonnées d’où se trouvent les meilleures régions de la diapositive pour une analyse ultérieure en utilisant un grossissement supérieur. - À l’aide d’objectif grossissement plus élevé (p. ex. 63 X ou 100 X), les régions de capture de la diapositive qui ont une monocouche cohérente des noyaux. Une fois qu’une zone est sélectionnée, la valeur de la partie supérieure et abaissez Z-piles pour s’assurer que toute la lumière mise au point est capturée.
Remarque : Le nombre optimal de Z-piles capturé entre les limites supérieure et inférieure est généralement désigné par le logiciel d’acquisition image et est différent pour chaque objectif. - Utilisez le logiciel de traitement d’image pour compiler une image de focus profondeur étendue. Le logiciel combine la mise au point lumière de chaque pile-Z et est essentiel pour l’imagerie optimale des préparations du tubule.
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Representative Results
Ici, nous avons utilisé la méthode de squash de tubule de visualiser des populations de cellules transitoires en cours de la prophase à la métaphase I (G2/MI) transition, qui ont été enrichies par la récolte des testicules de souris de type sauvage juvéniles en cours de la première vague de la spermatogenèse (24 DPP). La figure 1 illustre les images représentatives des différentes étapes de la cellule qui peuvent être visualisés en utilisant la méthode de squash du tubule. Enrichi de populations de métaphase I spermatocytes ont été visualisés à l’aide d’anticorps dirigés contre l’alpha-tubuline (Figure 1 a). Nous avons utilisé des marqueurs de début et fin de la méiose I de la méiose progression étape. Préparations du tubule ont été immunomarquées avec un anticorps dirigé contre la protéine complexe synaptonémal, SYCP3, de visualiser les étapes de la prophase I. leptotène/zygotène et pachytène/diplotène spermatocytes sont indiquées dans la Figure 1 b. Les spermatocytes en cours de la première division méiotique peuvent être clairement identifiés à l’aide d’anticorps dirigés contre l’alpha-tubuline (Figure 1 a et 1C). Pour étudier les événements méiotiques tardifs, tubule courges ont été immunomarquées en utilisant des anticorps contre la cycle cellulaire kinase Aurora B (AURKB), qui se localise au centromère intérieur au cours de la métaphase, puis relocalizes pour le sillon de clivage et de milieu de broche pendant l’anaphase et la cytocinèse, respectivement (Figure 1). Les caractéristiques cytologiques des chromosomes ont été visualisées au cours de la première division méiotique. Pour observer les DCI, tubule squash préparations ont été immunomarquées en utilisant des anticorps contre la sous-unité alpha de la méiose spécifiques-kleisin de cohesin, REC8 (Figure 1). Dynamique des chromosomes au cours de l’anaphase ont été évaluée à l’aide d’immunomarquage alpha-tubuline et la tache de l’ADN, DAPI. Un spermatocyte réussissant la première division méiotique est affiché dans la Figure 1E, alors qu’un spermatocyte contenant un pont de l’anaphase est illustré à la Figure 1F. En utilisant la technique de courge tubule, longueur du fuseau méiotique, ségrégation et alignement de chromosomes peuvent être mesurés et comparés entre souris mutante et contrôle.
L’utilité de cette méthode pour la visualisation des transitions supplémentaires cycle cellulaire et subcellulaires structures associées à la prophase j’ai est illustré à la Figure 2. Pendant le sous-étage leptotène de la prophase I, initiation de l’appariement des chromosomes homologues est médiée par des changements dynamiques dans les pièces jointes de télomère pour induire la formation d’amas de chromosome face à un seul pôle de l’enveloppe nucléaire (en)16, 17 , 18 , 19 , 20. cette conformation, connue comme le chromosome « bouquet » est censé augmenter la probabilité et la fréquence des interactions inter homologues (Figure 2 a). Initiation et l’achèvement de la synapsis entre chromosomes homologues survient durant le zygotène (Figure 2 b) et sous-stades pachytène (Figure 2), respectivement, correspondant avec la dispersion progressive de la bouquet de chromosome. À évaluer simultanément dynamique de bouquet synapsis et chromosome chez les souris juvéniles, nous immunomarquées préparations tubule avec anticorps anti-SYCP3 et les centromères et colorés pour l’ADN à l’aide de DAPI. Chromosomes de souris sont télocentriques, donc le centromère immunomarquage a été utilisée pour détecter des changements dans les pièces jointes NE télomère.
Inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) est une caractéristique unique à la méiose mâle, auquel cas le X non homologue et de chromosomes Y contourner activation de checkpoint en subissant la phosphorylation du chromosome à l’échelle de la variante de l’histone H2AFX (yH2AX ; pSer139)21 ,22,23. La paire de chromosomes XY est transcriptionnellement réduits au silence et compartimentée en un sous-domaine nucléaire dense, appelé le « corps de sexe ». Spermatocytes subissant MSCI puissent être aisément identifiés durant les stade pachytène et le diplotène sous-stades par immunomarquage tubule préparations avec des anticorps à yH2AX (Ser139). Figure 2D dépeint un spermatocyte à l’immunomarquées de sous-stade pachytène avec anticorps contre yH2AX (Ser139), les centromères et colorées au DAPI pour visualiser l’ADN.
Duplication du centrosome est semi conservatrice et se produit au cours de la prophase qu'i de méiose mâle à la fin de l’ADN de réparation pour s’assurer que chaque cellule fille résultante hérite de deux centrioles (un centrosome) suite à la division cellulaire24,25 . Les centrosomes se composent de deux centrioles disposés orthogonalement, reliées par un flexible linker et sont entourés par une matrice amorphe de protéines appelées les péricentriolaire matériel/matrice (PCM)26. Après la duplication dans le sous-étage pachytène, nouvellement formé centriole paires se désengager d’un de l’autre et subissent une maturation centrosome et la migration vers les pôles opposés pendant le stade diplotène pour faciliter la formation des axes bipolaires. Un spermatocyte diplotène début subissant la disjonction des paires de centriole nouvellement formée a été visualisée par immunomarquage préparations tubule avec anticorps contre pericentrin (PCNT), un composant protéique du PCM et du Centrin-3 (CETN3) à l’occasion de centrioles (Figure 2E). Mise en scène a été déterminée en utilisant des anticorps contre SYCP3 et DAPI a été utilisé pour colorer les ADN.
Figure 1 : Analyse représentative de la transition G2/MI méiotique, à l’aide de préparations tubule. Préparations du tubule ont été effectuées sur des segments de tube séminifère de C57BL/6J souris âgés de 24 dpp. (A) représentant champ de développement spermatocytes immunomarquées avec des anticorps contre alpha-tubuline centromères (rouges), (verts) et l’ADN tachent DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole, bleu). (B) courges tubule sauvage ont été colorées au DAPI (bleu) ainsi que d’immunomarquées avec des anticorps contre alpha-tubuline (rouge) et l’élément latéral de la SC, SYCP3 (vert). (C) courges tubule sauvage ont été colorées au DAPI (bleu) ainsi que d’immunomarquées avec des anticorps contre alpha-tubuline (rouge) et le vert AURKB () de kinase de cycle cellulaire). Caractéristiques cytologiques des chromosomes tels que les DCI et les ponts de l’anaphase peuvent être visualisées à l’aide de préparations du tubule. (D) pour observer les DCI, spermatocytes prométaphase ont été immunomarquées avec des anticorps dirigés contre les centromères (rouges) ainsi qu’un composant méiotique spécifiques cohesin, REC8 (vert) et colorées au DAPI (bleu). (E, F) Morphologie des chromosomes a été visualisée au cours de l’anaphase, utilisant des anticorps contre alpha-tubuline centromères (rouges), (verts), et le DAPI stain (bleu). Une gamme complète de développer des spermatocytes peut être identifiée en utilisant la technique de courge tubule (L/Z, spermatocytes de stade leptotène/zygotène ; P/D, spermatocytes de stade pachytène/diplotène ; H, spermatocytes prométaphase ; M, spermatocytes métaphase ; A, spermatocytes de l’anaphase). Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples de modifications morphologiques supplémentaires et des structures associées à la progression de la prophase méiotique chez les mâles à l’aide de préparations tubule. Préparations du tubule effectuées sur tube séminifère segments de souris C57BL/6J âgés de 12 à 18 dpp et ont été colorés au DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole, bleu) pour marquer l’ADN. (A-C) Synapsis homologue est couplée à la formation et la dispersion progressive du chromosome « bouquet » au cours de la progression de la prophase. (A)de leptotène, zygotène (B)et spermatocytes de stade pachytène (C) ont été immunomarquées avec des anticorps contre SYCP3 (rouge) et les centromères (vert). (D-E) Préparations du tubule peut être utilisé pour détecter les modifications cytologiques uniques et structures pendant la prophase mâle j’ai progression notamment inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) et la duplication du centrosome. (D) les spermatocytes de stade pachytène subissant MSCI ont été détectés à l’aide d’anticorps anti-yH2AX (Ser139) pour marquer le corps du sexe (vert, pointe de flèche), et les centromères sont indiquées en rouge. (E) diplotène spermatocytes de scène ont été identifiés à l’aide d’anticorps anti-SYCP3 (rouge) et les centrosomes (pointe de flèche) ont été détectés en utilisant des anticorps anti-Centrin-3 (vert) et Pericentrin (magenta) d’étiqueter les centrioles et le péricentriolaire matériel/matrice, respectivement. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Ordre du jour | Montant | Concentration finale |
| 1 x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16 % PFA | 500 ΜL | 0,8 % (v/v) |
| TritonX-100 de 10 % dans du PBS | 100 ΜL | 0,1 % (v/v) |
Tableau 1 : solution Fix/lyse. Description : Ajuster le pH à 9 avec NaOH [50mM]. Envelopper le contenant de la solution dans le papier d’aluminium pour protéger de la lumière et conserver à 4 ° C. Ne pas utiliser la solution fix/lyse si plus d’une semaine. PFA solide permet également de faire la solution. Utilisation d’une hotte est recommandée pour éviter l’exposition de la PFA.
| Ordre du jour | Montant | Concentration finale |
| 1 x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3 % (p/v) |
| Sérum de cheval | 5 mL | 10 % (v/v) |
| TritonX-100 de 10 % dans du PBS | 250 ΜL | 0,05 % (v/v) |
Tableau 2 : recette de tampon (ADB) anticorps dilution. Description : Magasin ADB à 4 ° C ou stocks de congélation à-20 ° C si vous faites des quantités plus importantes. ADB peuvent être contaminés, s’assurer que les bonnes techniques d’asepsie sont utilisés et évaluer la solution pour la contamination avant chaque utilisation. Préparer de petites parties aliquotes de ADB pour minimiser la contamination.
| Type de cellule | Processus cellulaires | Âge de la souris (dpp) |
| Leptotène | Formation de l’ADN ORD | 10 - 12 |
| Ensemble d’éléments axiales | ||
| Zygotène | Initiation des homologues réparation ORD et synapsis | 12 - 16 |
| Pachytène | Achèvement de la réparation DSB autosomique | 16 - 20 |
| Maturation des événements de recombinaison crossover | ||
| Synapsis complet entre homologues | ||
| Inactivation méiotique des chromosomes sexuels (MSCI) | ||
| Maturation de Duplication/Centrosome centriole | ||
| Diplotène et diacinèse | SC désynapsis | 18 - 22 |
| Séparation du centrosome | ||
| Métaphase I | Point de contrôle de broche | 22 - 26 |
| Spermatide ronde | Remplacement de protamine | > 24 |
| Formation de l’acrosome |
Tableau 3 : près-synchrone première vague de la spermatogenèse chez les jeunes souris. Description : Des étapes spécifiques de la spermatogenèse sont enrichies à différents stades de développement juvénile chez la souris.
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Discussion
Souris ont prouvé d’être un organisme modèle utile pour étudier les événements cellulaires qui régissent la méiose progression au cours de la spermatogenèse. En outre, il est nécessaire de développer des outils pris en charge à l’étude de la spermatogenèse parce que beaucoup d’événements, tels que sortir de la prophase méiotique, j’ai, sont sexuellement dimorphe. Ce protocole décrit une méthode de courge tube séminifère pour la visualisation et l’étude des différentes étapes de la spermatogenèse souris. Cette méthode préserve l’intégrité cellulaire et permet ainsi des analyses détaillées des structures nucléaires et cytoplasmiques. Les résultats représentatifs représentés dans cette étude démontrent l’utilité de ce protocole pour évaluer les spermatocytes primaires en cours de progression méiotique. De plus, ce protocole utilisable également pour étudier d’autres processus cellulaires au cours de la spermatogenèse, y compris la prolifération et la différenciation des spermatogonies et étapes de la spermiogenèse27,28. Les méthodes décrites sont dans sont adaptées du tubule décrites précédemment squash techniques8,9. Toutefois, ce protocole est le premier guide détaillé, couvrant tous les réactifs et les étapes nécessaires, de se procurer les tubules pour visualiser les cellules individuelles par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence. En outre, nous avons présenté des images sur les fonctions cellulaires supplémentaires, y compris le centriole et le bouquet de télomères, qui peut être visualisé à l’aide de la technique.
Il y a quelques éléments techniques qui sont la clé pour l’optimisation des préparations du tubule. Tout d’abord, il faut appliquer une quantité suffisante de force à la lamelle de verre. Défaut d’appliquer une force suffisante produira diapositives avec quelques cellules adhérentes, comme la plupart des cellules resteront dans les tubules séminifères. Deuxièmement, on doit Incuber le matériel de testicules dans la solution fix/lyse pour la durée appropriée. En règle générale, la fixation doit être limitée à 5 min, mais une fourchette comprise entre 5 et 15 min est acceptable. Les tubules qui ont été fixées pour une période prolongée sera difficiles à manipuler et donne des résultats médiocres. Toutefois, il est possible, de prolonger le temps d’incubation en réduisant la concentration de l’IFP. Par exemple baisser le pourcentage PFA à 0,5 % permettrait pour des temps d’incubation accrue dans la solution fix/lyse. Dans la méthode que nous avons présentés, les étapes de la perméabilisation et fixation produisent simultanément, cependant, ces étapes peuvent être effectuées un après l’autre, respectivement. Séparant les étapes perméabilisation et fixation peut aider à réduire les niveaux de signal de fond cytoplasmique. Variation des stratégies de fixation et/ou perméabilisation peut également être testée afin d’optimiser les conditions pour une analyse d’une structure spécifique de subcellulaire ou d’anticorps. Par exemple, la visualisation des centrosomes et broche protéines peuvent être améliorées à l’aide de méthanol au lieu de PFA29,30,31. En outre, il est avantageux d’utiliser des souris juvéniles qui progressent à travers la première vague de la spermatogenèse (environ 10-26 dpp) afin de plus précisément et robuste visualiser les rares événements cellulaires méiotique12. Alternativement, il est possible d’isoler des cellules méiotiques spécifiques au stade de souris adultes en observant le schéma d’absorption de la lumière dans le tube séminifère32. Compte tenu du cycle asynchrone de la spermatogenèse chez la souris adulte, toutefois, analyser les rares événements méiotiques en détail peut être difficile. Cette limitation peut être surmontée en injectant des souris avec bisdichloroacetyldiamine, gagner 18 446, dont métabolisme de vitamine A de blocs et stoppe la différenciation spermatogonies33. Après le traitement par gagner 18 466, reprise de la spermatogenèse se produira de façon synchrone, produisant de grandes quantités de populations enrichies de cellules germinales d’un animal mature34. Cette stratégie de synchronisation peut être utilisée avant la technique de courge tubule pour étudier les différences entre les premières vagues semi-synchrone de la spermatogenèse à ceux qui se produisent dans les adultes35,36, 37. en outre, corrélation entre vieillissement paternel et aneuploïdie pourrait également être évaluée à l’aide de gagner 18 466 ségrégation des chromosomes de synchronisation et d’évaluer avec la méthode de squash du tubule.
En résumé, cette méthode peut être utilisée en conjonction avec la microscopie en immunofluorescence d’observer des cellules dans les différentes étapes de la spermatogenèse. Appliqué de façon plus large, cette technique peut également servir à évaluer les sous-populations de spermatogonies, les spermatocytes et les spermatides et peut être adaptée pour étudier un large éventail de processus au cours de la spermatogenèse. Cette approche a servi pour les cellules vivantes d’imagerie des spermatocytes et modifié à mener diverses études cellulaires et biochimiques38,39,40. La technique de courge tubule a été utilisée pour les souris et le rat des tubules séminifères, ce qui suggère qu’il devrait s’appliquer facilement à d’autres systèmes chez les mammifères, y compris humaine40. Cette technique peut aider à définir les perturbations cellulaires qui donnent lieu à l’infertilité et l’aneuploïdie de sperme.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIGM (R01GM11755) à P.W.J. et une bourse de subvention de formation de l’Institut National de Cancer (NIH) (CA009110) à S.R.W. et J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
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