Summary
L'obiettivo di questa tecnica di squash del tubulo è quello di valutare velocemente le caratteristiche citologiche di sviluppare spermatociti di mouse, preservando l'integrità cellulare. Questo metodo consente lo studio di tutte le fasi della spermatogenesi e può essere facilmente implementato al fianco di altri approcci biologici biochimici e molecolari per lo studio di meiosi del mouse.
Abstract
Progressione meiotica nei maschi è un processo che richiede l'azione concertata di un numero di eventi cellulari altamente regolamentati. Errori che si verificano durante la meiosi possono portare alla sterilità, perdita di gravidanza o difetti genetici. Che inizia all'inizio della pubertà e proseguendo per tutta l'età adulta, onde continue semi-sincrone di spermatociti subiscono la spermatogenesi e alla fine formano spermatozoi aploidi. La prima ondata di spermatociti di mouse in fase di iniziazione meiotica appaiono al 10 ° giorno post-parto (dpp 10) e vengono rilasciati nel lume del tubulo seminifero come sperma maturo a 35 dpp. Pertanto, è preferibile utilizzare topi all'interno di questo intervallo di tempo dello sviluppo al fine di ottenere popolazioni altamente arricchiti di interesse. Analisi delle fasi di rara delle cellule è più difficile in più vecchi topi grazie al contributo di successive ondate di spermatogenesi, che aumentano la diversità delle popolazioni cellulari all'interno dei tubuli. Il metodo qui descritto è una tecnica facile da implementare per la valutazione citologica delle cellule trovate all'interno dei tubuli seminiferi dei topi, tra cui spermatogoni, spermatociti e spermatidi. La tecnica di squash tubulo mantiene l'integrità delle cellule germinali maschili isolate e permette l'esame delle strutture cellulari che non sono facilmente visibili con altre tecniche. Per illustrare le possibili applicazioni di questa tecnica di squash tubulo, gruppo fusello è stato monitorato in spermatociti progredendo attraverso la profase alla metafase di transizione (transizione G2/MI). Inoltre, duplicazione centrosoma, inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) e formazione di mazzo del cromosoma sono stati valutati come esempi delle strutture citologiche che possono essere osservate utilizzando questo metodo di squash del tubulo. Questa tecnica può essere utilizzata per individuare difetti specifici durante la spermatogenesi che sono causati dalla mutazione o perturbazione esogeni, e quindi, contribuisce alla nostra comprensione dei meccanismi molecolari della spermatogenesi.
Introduction
Meiosi sono un evento cellulare complesso in cui un singolo ciclo di replicazione del DNA è seguito da due successivi cicli di divisione cellulare. Diversi eventi di meiosi specifici devono essere coordinati durante le fasi iniziali della meiosi per assicurare la segregazione del cromosoma accurata. Questi eventi comprendono il completamento di ricombinazione omologa, co-orientamento della sorella cinetocori durante la prima divisione meiotica e la perdita graduale della coesina complessi per risolvere chiasmata tra omologhi. Regolazione precisa di questi processi è necessaria per mantenere la fertilità e cromosoma malsegregazione di eventi che possono portare a disturbi dello sviluppo genetici e aborto spontaneo1.
Mentre gli eventi chiavi della meiosi si svolgono sia maschi che femmine, esistono differenze significative di temporale e meccanicistiche tra spermatogenesi e oogenesi2. Ad esempio, durante la meiosi femminile, profase si verifica durante lo sviluppo embrionale e si arresta nella fase di dictyate fino alla pubertà. Al contrario, la spermatogenesi inizia alla pubertà e progredisce in onde tutta la vita adulta senza arresto. Le differenze tra maschio e femmina meiosi sottolinea la necessità di sviluppare metodi che sono specificamente orientate verso valutare questi processi sia spermatociti e ovociti. Attualmente, valutare la progressione meiotica in gran parte si basa sull'uso di cromatina spread3,4,5. Mentre gli spread della cromatina sono utili per studiare i cromosomi meiotici, riescono a preservare l'integrità cellulare, impedendo la valutazione delle strutture cellulari quali mandrino microtubuli, centrosomi, l'involucro nucleare e gli allegati del telomero. Live imaging e tecniche di coltura a lungo termine notevolmente hanno avanzato la nostra comprensione della meiosi femminile; approcci simili per visualizzare l'intera cellula intatta, tuttavia, sono meno frequentemente implementati per lo studio della spermatogenesi6,7. Per visualizzare gli eventi dinamici durante meiosi maschile, abbiamo adattato stabilito tubulo squash tecniche per valutare rapidamente le caratteristiche citologiche di sviluppare del mouse spermatociti8,9. Il metodo qui descritto mantiene l'integrità della cellula, permettendo lo studio di strutture cellulari multiple durante diverse fasi della spermatogenesi.
Questa tecnica di squash del tubulo è un approccio a cellula intera, che consente la valutazione delle strutture cellulari tramite microscopia di immunofluorescenza. Approcci comuni istologici di visualizzare progressione meiotica in di topo maschio come haematoxylin ed eosina di testicoli di paraffina ed etichettatura immunofluorescente di cryosections consentono un'ampia panoramica della progressione meiotica. Tuttavia, queste tecniche non riescono a risolvere le singole cellule nella misura necessaria per un'analisi dettagliata degli eventi che si verificano durante meiosi10,11. Tecniche alternative per visualizzare processi meiotici si basano su interruzioni significative chemiosmotica spermatocita per isolare e difficoltà materiali nucleari3,4,5. Questi trattamenti chimici ostacolano l'osservazione di tipi cellulari diversi da spermatociti primari. Un metodo recentemente descritto da Namekawa ha permesso alla comunità di ricerca di preservare l'architettura nucleare di spermatociti isolati, ma richiede l'uso di un cytospin e accessori che non siano prontamente disponibili per alcuni laboratori4. Al contrario, la tecnica di squash tubulo richiede solo attrezzature che è generalmente standard nella maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule.
Il metodo di squash tubulo qui descritto può essere utilizzato per visualizzare i tipi di cellule diversi trovati all'interno del tubulo seminifero, comprese cellule di sertoli, spermatogoni, spermatociti primari e secondari e spermatidi. Accoppiando questa tecnica con la prima ondata vicino-sincrono della spermatogenesi in topi giovani, è possibile ottenere arricchiti popolazioni delle cellule spermatogenetiche mentre progrediscono attraverso meiosi12. Questo processo permette l'analisi dettagliata dei processi durante la spermatogenesi, quali eventi precoci profase, il G2/MI e la metafase per transizioni anafase e spermiogenesi. Inoltre, preparazioni di squash tubulo possono essere utilizzati per visualizzare le caratteristiche citologiche dei cromosomi (ad es. interchromatid domini (ICD) e cinetocori) e centrosomi (centrioli e pericentriolar materiale/matrici). Il metodo di zucca può essere facilmente eseguito in parallelo con altri approcci sperimentali, come spread della cromatina ed estrazione di proteine. Inoltre, questa tecnica è stata modificata con successo per depositare le cellule spermatogenetiche viventi su slitte per la visualizzazione diretta13.
Il metodo qui descritto richiede una tecnica di squash del tubulo seminifero cellula intera per analizzare la transizione G2/MI in topi C57BL/6J wild-type. Le caratteristiche citologiche di spermatociti primari entrando la prima divisione meiotica sono state visualizzate con microscopia di immunofluorescenza per osservare il fuso meiotico. Questa tecnica versatile può essere facilmente modificata per visualizzare altre fasi meiotic e diversi tipi di cellule. La tecnica è anche favorevole alla strategie di visualizzazione alternativi, come DNA e RNA pesce approcci.
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Protocol
L'uso di topi è stato approvato dal istituzionale Animal Care e utilizzare Comitato della Johns Hopkins University. Gli esperimenti sono stati eseguiti su giovanile (20-26 giorni post-partum, dpp) topi C57BL/6J, approfittando della prima ondata semi-sincrona della spermatogenesi. Tuttavia, questa tecnica può essere eseguita anche utilizzando topi adulti.
1. dissezione e isolamento dei tubuli seminiferi del mouse
- Preparare la correzione/soluzione e anticorpo diluizione buffer di lisi (ADB) descritto nella tabella 1 e tabella 2.
- Preparare una capsula di Petri 35 mm con 3 mL di 1x tampone fosfato salino (1x PBS, pH 7.4) e un altro piatto di 35mm con 2 mL di soluzione di correzione/Lisi per topo.
- Sacrificare il mouse tramite dislocazione cervicale o CO2 asfissia e spruzzare l'addome ventrale con etanolo al 70%. Aprire la cavità abdominopelvic utilizzando forbici sterili, rendendo un'apertura a forma di V. Quindi rimuovere i testicoli, tirando il grasso epididimario usando il forcipe ed evitare di disturbare la tunica albuginea. Posizionare i testicoli in una capsula Petri 35 mm contenente 1X PBS.
Nota: Utilizzare la prima ondata di spermatogenesi al fine di osservare una popolazione delle cellule arricchite di interesse14. Fasi specifiche della spermatogenesi sono arricchite alle età del mouse differenti (tabella 3). - Rimuovere il testicolo albuginea di Tunica perforando il tessuto con una pinza punta tagliente e raccogliere i tubuli seminiferi sciolti. Trasferire i tubuli una nuova 35 mm piastra Petri contenente 2 mL di soluzione di correzione/lisi.
- Incubare i tubuli nella soluzione fix/Lisi per 5 min a temperatura ambiente.
2. preparazione del tubulo seminifero
- Preparare un vetrino di vetro rivestito di poli-L-lisina delineando i bordi della diapositiva con una penna di liquido bloccante.
- Applicare 100 µ l di soluzione di correzione/Lisi al centro del vetrino.
- Utilizzando pinze sterili e forbici delicatamente a pezzi stuzzicare i tubuli seminiferi. Taglio fuori tubulo lungo singolo segmenti di circa 20 mm di lunghezza.
Nota: Per visualizzare le strutture che sono sensibili all'esposizione prolungata fissativo, quali i centrosomi, separare i tubuli prima in PBS 1X, quindi tritare direttamente i tubuli sulla superficie delle diapositive di poli-lisina rivestito in 100 µ l di soluzione di correzione-lisi. - Trasferimento cinque segmenti di tubulo seminifero lungo 20 mm per il vetro rivestito di poli-L-lisina preparato diapositiva contenente soluzione di correzione/lisi.
- Utilizzando forbici sterili triti tubuli seminiferi in segmenti di 1,5 a 3,0 mm.
- Utilizzando pinze sterili disporre i segmenti tubulo il vetrino in modo che nessun tessuto si sovrappone, e i tubuli sono distribuiti in modo uniforme.
Nota: Il numero di segmenti tubulo su un vetrino ottimale è tra 20 e 40.
3. lo schiacciamento dei tubuli seminiferi
- Trasferire il vetrino contenente segmenti Tubulo seminifero dispersi su un benchtop. Rimuovere il liquido in eccesso usando un laboratorio per evitare di perdere tessuto durante il passaggio di squash.
- Applicare un vetrino coprioggetti (22 x 60-1.5 mm) sopra il vetrino ed esercitare una pressione con il tallone del palmo della mano per 10-20 secondi. È importante applicare forza sufficiente a disperdere spermatociti da tubuli seminiferi.
Nota: Osservare i tubuli utilizzando un microscopio di dissezione al fine di ottimizzare il passaggio schiacciamento, in modo che tutti i segmenti del tubulo sono interrotti. - Usando il forcipe di diapositiva, immediatamente flash congelare il vetrino in un dewar piccolo liquido N2 per 15 secondi, o fino a quando il liquido non cessa di bolla. Se immunolabeling immediatamente, rimuovere il vetrino coprioggetto con una lama di rasoio bordo dritto, bene punta forcipe o ago da 21 gauge.
Nota: Per ottenere risultati ottimali, marcatura le diapositive immediatamente (Vedi punto 4). Tuttavia, a questo punto diapositive possono essere conservati a-80 ° C fino a due settimane. Per ottimizzare la durata delle proteine e strutture cellulari, immediatamente archiviare le diapositive sul ghiaccio secco o trasferimento in un congelatore a-80 ° C e mantenere il coprioggetto sul vetrino. Quando immunolabeling memorizzati diapositive, è necessario rimuovere il vetrino coprioggetto immergendo i vetrini in liquido N2 per 15 secondi, come descritto al punto 3.3.
4. Immunolabeling di tubuli seminiferi montati
- Immergere il vetrino in 1X PBS e lavare tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS.
Nota: Mai lasciare i vetrini a completamente asciutto durante immunolabeling. - Applicare 1 mL di tampone di diluizione di anticorpo su lastra di vetro viene bloccato per 1-2 h in una camera umidificata.
- Rimuovere il tampone di diluizione dell'anticorpo e applicare 100 µ l di anticorpo primario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo in una camera umidificata.
Nota: Per risultati ottimali, Incubare gli anticorpi primari durante la notte a 4 ° C. Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm. Convalidare e ottimizzare gli anticorpi primari15. - Sciacquare i vetrini tre volte per 5 min in una vaschetta di Coplin 50 mL contenente 1X PBS.
Nota: Per migliorare i lavaggi, agitare Coplin vasetti utilizzando una piccola ancoretta magnetica e posizionare su una piastra magnetica a bassa velocità o la vaschetta di Coplin su un mixer da tavolo a bassa velocità. - Applicare 100 µ l di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione dell'anticorpo per 1-1,5 h in una camera umidificata a temperatura ambiente. Incubare i vetrini in una scatola scuro per evitare foto imbianchimento di anticorpi coniugato fluoroforo.
Nota: Utilizzare volumi più piccoli dell'anticorpo (ad es. 50 µ l) coprendo il vetrino con un vetrino coprioggetto o parafilm. - Sciacquare i vetrini due volte per 5 min in una vaschetta di Coplin da 50 mL contenente 1X PBS.
- Montare i vetrini in mezzo di montaggio contenente 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1,5 µ g/mL) e applicare i coprioggetti (22 x 60-1,5 mm).
- Sigillare i coprioggetti per le diapositive con smalto trasparente per preservare le diapositive e impediscono il movimento di lamelle.
5. analisi e imaging del tubulo squash preparati
- Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con fase automatizzata che consente il movimento dell'asse z preciso e una telecamera ad alta risoluzione per la cattura delle immagini. In alternativa, utilizzare un microscopio confocale laser.
Nota: È possibile utilizzare qualsiasi software e hardware disponibile per questo passaggio. Ad esempio, immagini visualizzate in Figura 1 e Figura 2 sono state catturate utilizzando un Zeiss cella osservatore Z1 collegata a un'ORCA-Flash 4.0 CMOS telecamera e analizzati con il software di immagine di Zeiss ZEN 2012 blue edition. - Valutare le diapositive utilizzando un obiettivo X 20 per determinare la qualità della preparazione squash. Diapositive di buona qualità hanno un monostrato di nuclei che sono distribuiti uniformemente.
Nota: Alcune sezioni della diapositiva possono essere meglio di altri, è utile notare le coordinate di dove le migliori regioni della diapositiva possono essere trovate per ulteriori analisi con maggiore ingrandimento. - Utilizzando il più alto obiettivo di ingrandimento (es. 63X o da 100x), cattura regioni della diapositiva che dispongono di un monostrato coerenza dei nuclei. Una volta selezionata una regione, impostare il superiore e inferiore Z-stack per garantire che tutta la luce messa a fuoco viene catturata.
Nota: Il numero ottimo di Z-stack catturati tra il limite superiore e inferiore è generalmente indicato con il software di acquisizione di immagini e per ogni obiettivo è diverso. - Utilizzare il software di elaborazione di immagini per compilare un'immagine messa a fuoco estesa profondità. Il software combina la luce messa a fuoco da ogni Z-stack ed è essenziale per l'acquisizione ottima delle preparazioni squash del tubulo.
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Representative Results
Qui, abbiamo usato il metodo di squash tubulo visualizzare popolazioni di transitorio delle cellule che subiscono la profase alla metafase (G2/mi) transizione, che sono stati arricchiti dalla raccolta testicoli da topi wild-type giovanili che subiscono la prima ondata della spermatogenesi (24 DPP). Figura 1 raffigura immagini rappresentative delle varie fasi delle cellule che possono essere visualizzate utilizzando il metodo di squash del tubulo. Arricchita di popolazioni di metafase I spermatociti sono stati visualizzati usando gli anticorpi contro alfa-tubulina (Figura 1A). Abbiamo utilizzato marcatori per precoce e tardiva meiosi I della progressione meiotica fase. Preparazioni di squash tubulo immunolabeled con un anticorpo alla proteina del complesso Sinaptonemale, SYCP3, per visualizzare le fasi della Profase I. Leptotene/zigotene e spermatociti di pachitene/diplotene sono mostrati in Figura 1B. Spermatociti che subiscono la prima divisione meiotica possono essere chiaramente identificati usando gli anticorpi contro alfa-tubulina (Figura 1A e 1 C). Per studiare eventi meiotici ritardati, tubulo zucche erano immunolabeled usando gli anticorpi contro la chinasi di ciclo cellulare Aurora B (AURKB), che si localizza il centromero interiore durante la metafase, quindi relocalizes per il solco di fosforila e fenditura del mandrino durante anafase e citochinesi, rispettivamente (Figura 1). Caratteristiche citologiche di cromosomi sono state visualizzate durante la prima divisione meiotica. Per osservare gli ICD, tubulo squash preparazioni immunolabeled usando gli anticorpi contro la subunità alfa meiosi-specifiche-kleisin della coesina, REC8 (Figura 1). Cromosoma dinamica durante l'anafase sono stati valutati usando immunolabelling alfa-tubulina e la macchia di DNA, DAPI. Un spermatocita completato con successo la prima divisione meiotica è mostrato in Figura 1E, mentre un spermatocita contenente un ponte anafase è mostrato in Figura 1F. Utilizzando la tecnica di squash di tubulo, la lunghezza del fuso meiotico, segregazione e l'allineamento del cromosoma possono essere misurati e confrontati fra i topi mutanti e di controllo.
L'utilità di questo metodo per la visualizzazione di strutture subcellulari associate profase e ciclo cellulare ulteriori transizioni è stato illustrato nella Figura 2. Durante il Sottostadio leptotene della Profase I, iniziazione della coppia di cromosomi omologhi è mediato dai cambiamenti dinamici negli allegati del telomero per indurre la formazione di raggruppamenti di cromosoma rivolto verso un unico polo dell'involucro nucleare (NE)16, 17 , 18 , 19 , 20. questa conformazione, conosciuta come il cromosoma "bouquet" è pensato per aumentare la probabilità e la frequenza delle interazioni inter-omologo (Figura 2A). Inizio e il completamento di synapsis tra cromosomi omologhi si verifica durante lo zigotene (Figura 2B) e sottostadi pachitene (Figura 2), rispettivamente, corrispondente con progressiva dispersione della Mazzo di cromosoma. Per valutare simultaneamente dinamiche di mazzo synapsis e cromosoma in topi giovani, siamo preparati di squash tubulo immunolabeled con anticorpi anti-SYCP3 e dei centromeri e macchiato per DNA utilizzando DAPI. I cromosomi del mouse sono telocentric, pertanto immunolabeling centromero è stato utilizzato per rilevare le modifiche in allegati NE del telomero.
Inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) è un segno distintivo unico per meiosi maschile, per cui il non-omologo X ed Y cromosomi eludere attivazione dei checkpoints in fase di fosforilazione di tutto il cromosoma della variante dell'istone H2AFX (yH2AX; pSer139)21 ,22,23. La coppia del cromosoma di X-Y è trascrizionalmente silenziata e compartimenti stagni in un sottodominio nucleare denso, chiamato il "corpo di sesso". Spermatociti in fase di MSCI possono essere facilmente identificati durante i pachitene e diplotene sottostadi di preparazioni di squash del tubulo immunolabeling con gli anticorpi di yH2AX (Ser139). Figura 2D raffigura un spermatocita presso il pachitene Sottostadio immunolabelled con gli anticorpi contro yH2AX (Ser139), dei centromeri e macchiato con DAPI per visualizzare il DNA.
La duplicazione centrosoma è semi-conservatore e si verifica durante la profase che i della meiosi maschile al completamento del DNA di riparazione per garantire che ciascuna cellula figlia risultante eredita due centrioli (un centrosoma) seguendo la divisione cellulare24,25 . Centrosomi sono costituiti da due centrioli disposti ortogonalmente, collegati da un linker flessibile e sono circondati da una matrice amorfa delle proteine conosciute come il pericentriolar materiale/matrice (PCM)26. Dopo la duplicazione in sotto il tavolino di pachitene, neonata Centriolo coppie disinnestare uno da altro e sottoposti a maturazione dei centrosomi e migrazione ai poli opposti durante la fase di diplotene per facilitare la formazione di mandrini bipolare. Un precoce spermatocita diplotene subendo disgiunzione di coppie Centriolo formata di recente è stato visualizzato da preparazioni di squash tubulo immunolabeling con anticorpi pericentrin (PCNT), una componente proteica del PCM e Centrin-3 (CETN3) per contrassegnare centrioli (Figura 2E). Gestione temporanea è stata determinata usando gli anticorpi contro SYCP3 e DAPI è stato usato per macchiare il DNA.
Figura 1 : Analisi rappresentativa della transizione G2/MI meiotica preparazioni di squash tubulo. Preparazioni di squash del tubulo sono stati effettuati su segmenti Tubulo seminifero di C57BL/6J topi di età compresa tra 24 dpp. (A) campo rappresentativo di sviluppo spermatociti immunolabeled con gli anticorpi contro alfa-tubulina (rossi), centromeri (verdi) e il DNA macchia DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blu). (B) sciroppi di selvaggio-tipo del tubulo sono stati macchiati con DAPI (blu) come pure immunolabeled con gli anticorpi contro alfa-tubulina (rosso) e l'elemento laterale della SC, SYCP3 (verde). (C) sciroppi di selvaggio-tipo del tubulo sono stati macchiati con DAPI (blu) come pure immunolabeled con gli anticorpi contro alfa-tubulina (rosso) e il verde AURKB (chinasi di ciclo cellulare). Caratteristiche citologiche di cromosomi come ICDs e anafase ponti possono essere visualizzate utilizzando preparazioni di squash del tubulo. (D) per osservare gli ICD, spermatociti prometafase immunolabeled con gli anticorpi contro i centromeri (rossi) così come un componente di meiotic coesina specifici, REC8 (verde) e colorato con DAPI (blu). (E, F) Morfologia del cromosoma è stata visualizzata durante l'anafase usando gli anticorpi contro alfa-tubulina (rossi), centromeri (verdi), e il DAPI macchia (blu). Una serie completa di sviluppare spermatociti può essere identificata utilizzando la tecnica di squash tubulo (L/Z, spermatociti di stadio di leptotene/zigotene; P/D, spermatociti di pachitene/diplotene fase; P.M., spermatociti prometafase; M, spermatociti di metafase; A, spermatociti anafase). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Esempi di ulteriori modifiche morfologiche e strutture associate con la progressione di Profase Meiotica nei maschi preparazioni di squash tubulo. Preparazioni di squash del tubulo sono stati effettuati su tubulo seminifero segmenti dei topi C57BL/6J invecchiato 12-18 dpp e sono stati macchiati con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, blu) per etichettare del DNA. (A-C) Synapsis omologo è accoppiato alla formazione ed alla dispersione progressiva del cromosoma "mazzo" durante la progressione di profase. (A)leptotene, zigotene (B)e spermatociti di pachitene (C) fase erano immunolabeled con gli anticorpi contro SYCP3 (rosso) e dei centromeri (verde). (D-E) Preparazioni di squash tubulo può essere utilizzato per rilevare cambiamenti citologici unici e strutture durante la profase maschio ho progressione tra cui inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) e duplicazione centrosoma. (D) spermatociti di fase pachitene subendo MSCI sono stati rilevati utilizzando anticorpi anti-yH2AX (Ser139) di etichettare il sesso-corpo (punta di freccia verde,), e centromeri sono mostrati in rosso. (E) Diplotene spermatociti di fase sono stati identificati usando gli anticorpi contro SYCP3 (rosso) e centrosomi (punta di freccia) sono stati rilevati usando gli anticorpi contro Centrin-3 (verde) e Pericentrin (magenta) per etichettare i centrioli e il pericentriolar materiale/matrice, rispettivamente. Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Elemento | Importo | Concentrazione finale |
| 1x PBS | 10 mL | 1 x |
| 16% PFA | 500 ΜL | 0,8% (v/v) |
| 10% TritonX-100 in PBS | 100 ΜL | 0,1% (v/v) |
Tabella 1: soluzione Fix/lisi. Descrizione: Regolare il pH a 9 con NaOH [50mM]. Avvolgere il contenitore della soluzione in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce e conservare a 4 ° C. Non utilizzare la soluzione di fix/lisi se più di una settimana di vita. PFA solido è utilizzabile anche per rendere la soluzione. Un fumehood si consiglia di evitare l'esposizione PFA.
| Elemento | Importo | Concentrazione finale |
| 1x PBS | 50 mL | 1 x |
| BSA | 1,5 g | 3% (p/v) |
| Siero equino | 5 mL | 10% (v/v) |
| 10% TritonX-100 in PBS | 250 ΜL | 0,05% (v/v) |
Tabella 2: ricetta di buffer (ADB) di anticorpo diluizione. Descrizione: Archivio ADB a 4 ° C o scorte di congelare a-20 ° C se rendendo più grandi quantità. ADB può essere contaminato, assicurarsi buone tecniche asettiche sono utilizzati e valutare la soluzione per la contaminazione prima di ogni utilizzo. Preparare più piccole aliquote di ADB per minimizzare la contaminazione.
| Tipo di cella | Processo cellulare | Età del mouse (dpp) |
| Leptotene | Formazione di DNA DSB | 10 - 12 |
| Assemblaggio di elementi assiali | ||
| Zigotene | Iniziazione di omologa riparazione DSB e synapsis | 12 - 16 |
| Pachitene | Completamento della riparazione DSB autosomica | 16 - 20 |
| Maturazione degli eventi di ricombinazione di crossover | ||
| Synapsis completa tra omologhi | ||
| Inattivazione del cromosoma di sesso meiotica (MSCI) | ||
| Maturazione di duplicazione/centrosoma Centriolo | ||
| Diplotene e diacinesi | SC Desynapsis | 18 - 22 |
| Separazione del centrosoma | ||
| Metafase I | Mandrino Checkpoint | 22 - 26 |
| Round Spermatid | Sostituzione di protamina | > 24 |
| Formazione di acrosomiale |
Tabella 3: vicino-sincrono prima ondata della spermatogenesi in topi giovani. Descrizione: Specifiche fasi della spermatogenesi sono arricchiti nelle diverse fasi dello sviluppo giovanile del mouse.
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Discussion
Topi hanno dimostrato di essere un organismo modello utile per studiare gli eventi cellulari che regolano la progressione meiotica durante la spermatogenesi. Inoltre, è necessario sviluppare strumenti adatta allo studio della spermatogenesi, perché molti eventi, come uscita dalla Profase Meiotica I, sono sessualmente dimorfica. Questo protocollo descrive un metodo di squash tubulo seminifero per la visualizzazione e lo studio delle diverse fasi della spermatogenesi del mouse. Questo metodo mantiene l'integrità cellulare e quindi permette un'analisi dettagliata delle strutture nucleari e citoplasmatiche. I risultati rappresentativi raffigurati in questo studio dimostrano l'utilità del presente protocollo nella valutazione spermatociti primari in fase di progressione meiotica. Inoltre, questo protocollo utilizzabile anche per studiare altri processi cellulari durante la spermatogenesi, tra cui proliferazione e differenziazione di spermatogoni e fasi della spermiogenesi27,28. I metodi descritti sono all'interno sono adattati dal tubulo precedentemente descritti squash tecniche8,9. Tuttavia, questo protocollo è la prima guida dettagliata, che copre tutti i reagenti e i passaggi necessari, di ottenere i tubuli per visualizzare le singole cellule tramite microscopia a fluorescenza. Inoltre, abbiamo presentato immagini su ulteriori caratteristiche cellulari, tra cui il Centriolo e il bouquet del telomero, che possa essere visualizzato con la tecnica.
Ci sono alcuni elementi tecnici che sono la chiave per l'ottimizzazione delle preparazioni di squash del tubulo. In primo luogo, si deve applicare la giusta quantità di forza per il vetrino coprioggetti. Mancata applicazione di una forza sufficiente produrrà diapositive con poche cellule aderenti, come la maggior parte delle cellule rimarrà all'interno dei tubuli seminiferi. In secondo luogo, uno deve incubare il materiale di testicolo nella soluzione fix/Lisi per la lunghezza appropriata del tempo. In genere, fissazione dovrebbe essere limitata a 5 min, ma un intervallo compreso tra 5 e 15 min è accettabile. Tubuli che sono stati corretti per un periodo prolungato sarà difficile da manipolare e producono scarsi risultati. È possibile, tuttavia, estendere il tempo di incubazione riducendo la concentrazione di PFA. Ad esempio abbassando la PFA per cento allo 0,5% consentirebbe tempi di incubazione maggiore nella soluzione fix/lisi. Nel metodo che abbiamo presentato, i passaggi di permeabilizzazione e fissazione verificano contemporaneamente, tuttavia, questi passaggi possono essere eseguiti uno dopo l'altro, rispettivamente. Separando i passaggi di permeabilizzazione e fissazione può contribuire a ridurre i livelli di segnale citoplasmatico sfondo. Variazione delle strategie di fissazione e/o permeabilizzazione possa essere testate anche per ottimizzare le condizioni per la valutazione di una specifica struttura subcellulare o anticorpo. Ad esempio, visualizzazione di centrosomal e mandrino proteine possono essere migliorate utilizzando metanolo anziché PFA29,30,31. Inoltre, è vantaggioso utilizzare topi giovani che progrediscono attraverso la prima ondata della spermatogenesi (circa 10-26 dpp) al fine di specificamente e robustamente visualizzare eventi cellulare meiotica rari12. In alternativa, è possibile isolare le cellule meiotiche di fase-specifici da topi adulti osservando il modello di assorbimento della luce all'interno del tubulo seminifero32. Dato il ciclo asincrono della spermatogenesi in topi adulti, tuttavia, analizzando eventi rari meiotici in dettaglio può essere impegnativo. Questa limitazione può essere superata mediante iniezione di topi con bisdichloroacetyldiamine, vincere 18.446, quali metabolismo della vitamina A blocchi e ferma la differenziazione degli spermatogoni33. Dopo il trattamento con vincere 18.466, ripresa della spermatogenesi si verifica in modo sincrono, producendo grandi quantità di popolazioni delle cellule di germe arricchito da un animale maturo34. Questa strategia di sincronizzazione può essere utilizzata prima la tecnica di squash tubulo di indagare le differenze tra le prime onde semi-sincrone della spermatogenesi a quelli che si verificano nel36adulti35,, 37. Inoltre, correlazione tra invecchiamento paterna e l'aneuploide poteva essere anche valutata utilizzando WIN 18.466 segregazione del cromosoma di sincronizzazione e la valutazione con il metodo di squash del tubulo.
In sintesi, questo metodo può essere utilizzato in combinazione con microscopia di immunofluorescenza per osservare le cellule in diversi stadi della spermatogenesi. Applicato in modo più ampio, questa tecnica può essere utilizzata anche per valutare sotto-popolazioni di spermatogoni, spermatociti e spermatidi e può essere adattata per studiare una vasta gamma di processi durante la spermatogenesi. Questo approccio è stato utilizzato per live cell imaging di spermatociti e modificato di condurre una varietà di studi biochimici e cellulari38,39,40. La tecnica di squash del tubulo è stata utilizzata per topo e ratto tubuli seminiferi, suggerendo che dovrebbe essere facilmente applicato ad altri sistemi di mammiferi, tra cui umana40. Questa tecnica può aiutare a definire le perturbazioni cellulari che danno origine a sterilità e l'aneuploide di sperma.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. e da una borsa di sovvenzione di formazione dal National Cancer Institute (NIH) (CA009110) di S.R.W. e J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
References
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