Summary
Burada sunulan yöntem model organizma C. elegansnormal yaşlanma sırasında protein toplama keşfetmek için hedeftir. Protokolü temsil eden yaş ile oluşturmak son derece çözünmez büyük toplamları çalışmaya ve nasıl protein toplama proteostasis değişiklikleri etkisini belirlemek için güçlü bir araç.
Abstract
Son yıllarda, nörodejeneratif hastalıkları, Alzheimer hastalığı (Ah) ve Parkinson hastalığı (PD), gibi yaygınlığı büyüdü. Bu yaş ilişkili bozuklukları protein toplamları bu hastaların beynindeki fibrillary yapısı ile görünümünü ile karakterizedir. Tam olarak normal çözünür proteinler tabi neden bir toplama işlemi kötü anlaşılır kalır. Protein toplama hastalık süreçlerine sınırlı değildir ve bunun yerine normal yaşlanma sürecinin bir parçası protein toplama, ectopically kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları çalışma sağlar keşif insan ifade hastalık ilişkili proteinler. Burada Caenorhabditis elegans doğal protein toplamada tamamlayıcı yaklaşımlar ile incelemek için yöntemleri açıklanmaktadır. İlk olarak, biz yaşlı hayvanlar elde etmek için çok sayıda yaş senkronize C. elegans yetiştirmeyi incelemek ve biz son derece-çözünmez-büyük toplamları ayırmak için biyokimyasal yordamlar mevcut. Hedeflenen genetik nakavt ile birlikte, teşvik ya da yaş bağımlı protein toplama nicel kütle spektrometresi ile ya da kapsamlı bir çözümlemesini kullanarak engelleyen bir gen rolünü incelemek mümkündür veya bir aday tabanlı analiz antikorlar ile. Bu bulgular sonra toplama eğilimli proteinler floresan öğesini ifade Transjenik hayvanlar ile vivo içinde analiz tarafından onaylanır. Bu yöntemler belirli proteinler topluluğu ile yaş ve sonuçta bu proteinler tamamen işlevsel tutmayı yatkındır neden açıklamak yardımcı olmalıdır.
Introduction
Protein misfolding ve toplama bir hallmark reklam, PD, amyotrofik lateral skleroz (ALS), da demans (FTD) ve diğerleri gibi çeşitli nörodejeneratif hastalıkların kabul edilmektedir. Örneğin, α-synuclein derlemeler amiloid liflerinde içine bu PD hastalarında ALS hastalar TDP-43 veya FUS misfold iken motor nöronların oluşan bozucu formu sitoplazmik toplamları için özellikle de gözlemliyorum nigra Lewy organları olarak birikir. Her bu nörodejeneratif hastalıklar, protein homeostazı veya proteostasis Bakımı mekanizmaları hastalık için sonuç olarak lider misfolded proteinlerin birikimi önlemek başarısız.
Normal şartlar altında düzenleyici mekanizmaların sıkı bir şekilde denetlemesi protein sentezi, katlama ve bozulma oranını ve Proteostasis hücresel işlev görmesini sağlamak için önemlidir. Çeşitli çalışmalarda ile yaşlanma, protein homeostazı korumak yeteneği birçok hücre ve organların yavaş yavaş açığa ve yaş proteostasis ağlarıyla fizyolojik bozulma için önemli bir ağırlaştırıcı faktör olduğunu göstermek nörodejeneratif hastalıklar (başvurular1,2,3' te gözden). Protein kalite kontrol ve gelişeceğini protein stres hücresel yanıt yaşla birlikte tehlikeye protein misfolding ve toplama yaşlanma genel bir sonucu olabilir gösteriyor. Nitekim, biz ve diğerleri protein toplama hastalığı için sınırlı değildir ve bunun yerine Proteom parçası çok deterjan-yaşlı hayvanlar4,5,6',7 çözünmez olur göstermiştir ,8,9,10. Hesaplamalı ve in vivo analizi bu fizyolojik yaşı ile ilgili toplamları çeşitli yönleri5hastalık toplamları benzer saptandı. Endojen, yaş-bağımlı protein toplama keşfi bize protein toplama, ectopically ifade insan hastalık ilişkili proteinler kullanmadan düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için fırsat verir. Şu anda, bu bozukluk organizmanın sağlık üzerine etkisi ve yaygın protein insolubility düzenlenmesi hakkında sadece sınırlı bilgi bulunmaktadır.
Nematot C. elegans bu hayvanlar nispeten kısa bir ömrü var ve daha yüksek organizmalarda gözlenen birçok karakteristik yaşlanma özellikleri göstermek gibi araştırma yaşlanma içinde en yoğun olarak çalışılan model organizmalar biridir. Protein insolubility yaşlanma etkilerini C. elegans içinde ateş araştırma11 alan hastalık toplamları ayıklamak için yaygın olarak kullanılan farklı çözünürlük göre sıralı biyokimyasal ayırma tarafından incelenmiştir . Nicel kütle spektrometresi tarafından birkaç yüz proteinler toplama C. elegans eğilimli hastalık5yokluğunda olmak için gösterildi. Burada biz ayrıntılı olarak tarif sıvı kültür ve miktar için toplanan proteinler kütle spektrometresi ve analiz tarafından Western blot tarafından izole etmek için sıralı ayıklama solucanlar çok sayıda büyümeye protokolü. Çünkü misfolded ve toplama eğilimli proteinler yaşlı içinde birikir C. elegans gonads ve maskeleri değişikliklerinin diğer somatik dokular5,12,13, erbezi daha az mutant protein analizi odaklanmak için kullanmak Sigara üreme dokularda insolubility. Yöntemi sunulan % 0.5 SDS çözünmez ve nispeten düşük santrifüj hızlı tarafından pelleted son derece çözünmez, büyük toplamları çözümleme sağlar. Alternatif olarak, aynı zamanda daha küçük ve daha fazla çözünür toplamları toplamak için daha az sıkı bir ayıklama Protokolü oldu başka bir yerde10yayınlandı. Ayrıca, C. eleganstoplama vivo içinde değerlendirmek için kullanılan yöntem açıklamaktadır.
Genel olarak, bu yöntemleri RNA müdahale (RNAi) ile birlikte bir gen yaş bağımlı protein toplama oransal ilgi rolü değerlendirebilir. Bunun için biz genç ve yaşlı kurt ve nakavt RNAi kullanarak ilgi belirli bir protein olmayan özler analizini açıklar. Bu yöntemler proteostasis ağ bileşenlerini protein insolubility düzenleyen belirlemek için güçlü bir araç olmalıdır. Birkaç müdahaleler gibi insülin/İnsülin benzeri büyüme faktörü (IGF) azaltılmış 1 (IIS) sinyal gösterilmiştir dramatik C. elegans yaşlanma14geciktirmek için. Uzun ömürlü yolları genellikle protein-kalite kontrol mekanizmaları teşvik ve böylece bu yolları aktif protein toplama oranını etkileyen. Örneğin, sınırlı doğal protein toplama IIS yolu7inhibisyonu üzerine uzun ömürlü hayvanlarda göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: yordamı daha iyi anlamak için bir şematik (şekil 1) iş akışının bağlı olduğu.
1. büyük numaraları genç ve yaşlı C. elegans büyüme RNAi hedefleme için ilgi çekici bir gen tabi
Not: büyük popülasyonlarda yaşlı senkronize elde etmek için kullanım C. elegans steril gon-2(q388) sıcaklık kaynaklı mutantlar (CF2253). Tüm adımları sırasında açık alev ile yarı steril koşullarda çalışmak ve hiçbir contaminations (örneğin, ile mantar veya bakteri) mevcut olup olmadığını kontrol için önemlidir. Sıcaklığını değil anlatılan adımları (de centrifugations) oda sıcaklığında gerçekleştirin.
- Erbezi daha az hayvan edinmek için C. elegans gon-2(-) mutantlar hazırlanması
Not: steril hayvanlar gonads eksik elde etmek için işlev kaybı mutasyon üst hayvanlarda Bunlar son larva aşamasında (L4) değişen 25 ° C-anne tarafından katkı önlemek için bağlı olmak gerekir.- Gon-2(-) hayvanların sıcaklığı vardiya için ebeveyn üretimi toplamak için ilk genişleme
- Çizgi Escherichia coli OP50 bir Lysogeny suyu (LB) tabağa strain ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Ertesi gün bir OP50 klon ile 200 mL LB orta aşılamak ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya
- Sonraki gün tohum 15 yüksek büyüme (HG) orta plakaları (çapı 9 cm) ile 0.5 mL OP50 ve OP50 bir spatula ile dağıtmak. Tabakları oda sıcaklığında iki gün boyunca tutun.
- 15 HG orta plakaları OP50 ile seribaşı üzerine gon-2(-) hayvanlar (son iki kuşak için açlıktan değil) yığın ve onları korumak 20 ° C'de plakaları ile yetişkin Konfluent bazı OP50 hala kullanılabilir hale gelene kadar.
- Bu arada, tohum 60 HG orta plakaları ile OP50 açıklandığı gibi 1.1.1.3 adım ve tabakları oda sıcaklığında tutmak. Dikkat: agar oda sıcaklığında çatlamak olacak gibi numaralı seribaşı plakaları bir haftadan fazla tutulmalıdır değil.
- Çoğu yetişkin yukarıda açıklanan15yumurta bırakmaya başlayınca Konfluent tabakları çamaşır suyu. İki 15 mL-tüpler içinde yumurta toplamak ve bir gecede 20 ° C'de nutating Mikser yerleştirin
- Sonraki gün yıkama L1s M9 arabellek (85 mM NaCl, 42 mM Na2HPO4·7H2O, 22 mM KH2PO4) ile yumurtadan: 3000 x g, santrifüj 30 s, atma süpernatant ve dolgu M9 15 mL işaretiyle kadar için. Santrifüj kapasitesi, süpernatant atmak ve 1.1.1.6 adımı yineleyin. Tüpler ile elde edilen solucan granül M9 15 mL işaretiyle kadar doldurun.
- L1s toplam sayısı diseksiyon mikroskop ile L1s numaralı seribaşı olmayan agar Tabaklarda yerleştirilen 2 µL damla mevcut sayarak değerlendirin. Ortalama en az dokuz damla elde edilen sayılar.
- 6500 L1s numaralı seribaşı HG plaka ve solucanlar büyümeye izin başına 20 ° C'de L4 sahne kadar ekleyin.
- Erbezi daha az hayvan deney için elde etmek için gon-2(-) hayvanların ikinci genişleme
- L4 aşamada solucanlar adım 1.1.1.9-25 ° C kadar yumurta bırakmaya başlarlar ve L1s yumurtadan kaydır.
- Yumurta ve L1s topluluğu tarafından sedimantasyon
Not: 25 ° c sıcaklık vardiyadan sonra sedimantasyon kırılgan yumurta ve L1s yetişkinlerden ayırmak için nazik bir teknik olarak kullanmak için tercih edilir.- M9 ile plakalar 5 mL M9 beş tabak başı kullanarak yıkayın. Solucanlar 50 mL tüpler içine aktarın.
- Tüm tüpler M9 ile 45 mL işaretine kadar doldurun, Yetişkin tortu yaklaşık 10 dakika için izin, bir 50 mL tüp her süpernatant toplamak ve Pelet ile bu işlemi tekrarlayın. 3000 x g 1 dk. için yumurta ve L1s içeren süpernatant santrifüj kapasitesi, yaklaşık 10 dk L1s tortu izin ve 15 mL kaldı kadar süpernatant kaldırın.
Not: Bu kritik bir adımdır. Süpernatant çok erken, mümkün olduğu kadar çok L1s toplamak için kaldırmaz. - Gecede 25 ° C'de nutating Mikser üzerinde yumurta ve L1s içeren tüpler yerleştirin
- Gon-2(-) hayvanların sıcaklığı vardiya için ebeveyn üretimi toplamak için ilk genişleme
- Genç ve yaşlı hayvanlar bir gen ilgi hedefleme RNAi tabi toplamak için erbezi daha az hayvan sıvı kültür
Not: Bazı genler cevaben RNAi sıcaklık yukarıda açıklanan16olarak bağımlı olabilir. RNAi alternatif, bir mutant gen gon-2(-) arka plana dahil.- Sıvı kültür için bakteri hazırlanması
- 4 L LB orta ilgili bakteri kültürü 12 mL ile aşı OP50 ve RNAi bakteri (istenen dsRNA ve denetimi olarak boş vektör ile bakteri üreten bakteri) hazırlamak (50 µg/mL carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon için RNAi Ekle Bakteriyel kültürlerde) ve onları gece 180 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya.
- Ertesi gün 6.700 x g 4 ° C'de 10 dakika için de kültürler hasat Supernatants kaldırın ve her Pelet 60 mL buz gibi S Bazal medya (100 mM NaCl, 50 mM potasyum fosfat pH 6, buz tuttu) resuspend. Üç resuspended granül tutmak (OP50, RNAi bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi için kontrol) 4 ° c kadar adım 1.2.2 ya da 1.2.3.
Not: Solucanlar üzerinde RNAi L1 Sahne Alanı'ndan yetiştirilen olabilir (bkz. Adım 1.2.3) veya son larva aşamasından L4 gelişimsel kusurlar önlemek için (bkz. Adım 1.2.2).
- RNAi en son larva sahne L4 başlangıç ile tedavi için sıvı kültür
- Bir Fernbach kültür şişesi 200 mL S Bazal medya ekleyin (kapasite 2.800 mL). 300 mL son kültür hacmi için (bkz: 1.2.2.4), 10 mM potasyum sitrat, pH 6, 3 mL izleme metaller çözüm (5 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 2.5 mM FeSO4, 1 mM MnCl2, 1 mM ZnSO4, 0,1 mM CuSO4), 3 mM MgSO4 Ekle , 3 mM CaCl2, 100 ng/mL carbendazim ve 5 µg/mL kolesterol). Bir membran vida kapaklı şişe kapatın. Tablo 1 ' e arabellekleri tariflerini bakın.
- L1s 25 ° C (Adım 1.1.2.2.3) dışarı almak ve 15 mL tüpler için aktarabilirsiniz. 1.900 x g 3 dk de santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 2 µL olduğu gibi adım 1.1.1.8 başına L1s saymak. 500.000 L1s önceki adımda hazırlanan Fernbach kültür şişesi içine ekleyin.
- OP50 (Kimden adım 1.2.1) orantılı olarak solucanlar sayısını ekleyin. Örneğin, 500.000 solucanlar için 60 mL OP50 ekleyin.
- Solucan kültür Toplam hacim için 300 mL getirmek için Bazal S ile tamamlayın. L4 sahne titreyen bir kuluçka 150 d/d ile 25 ° c kadar solucan kültür kuluçkaya.
- Ertesi gün, solucanlar vahşi tipli L4s boyutunun olması gerekir. RNAi bakteri OP50 değiştirmek için altı 50 mL tüpler hayvanlarda toplamak, tortu izin ve süpernatant kaldırın. L4s kalan OP50 bakteri kaldırmak için M9 ile yıkayın: santrifüj kapasitesi 1900 x g 3 min için de ve tüm L4s bir 50 mL-tüp içine transfer süpernatant çıkarın. 5 µL başına L4s (en az dokuz kez) saymak. İki kez 50,000 L4s genç solucan koleksiyonu için gerekli olan ve iki kez 100.000 L4s yaşlı solucan koleksiyonu için ihtiyaç vardır.
- 1.2.2.1 içinde açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişeler hazırlayın. Ayrıca 50 µg/mL Carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon her şişe ekleyin.
- Denetimi RNAi eklemek bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi (Kimden adım 1.2.1) orantılı olarak solucanlar sayısı için: 7 mL şişesi genç solucanlar için başına ilgili bakterilerin ve şişesi yaşlı kurt için başına 14 mL ekleyin.
- Şişesi genç solucan koleksiyonu için başına 50.000 solucanlar ve şişesi yaşlı solucan koleksiyonu için başına 100.000 solucanlar ekleyin ve ilâ 300 mL doldurmak için Bazal S kültürlerle tamamlayın. 25 ° C ve 150 rpm solucan kültürler (Toplam dört) kuluçkaya.
- RNAi L1 aşamada başlangıç ile tedavi için sıvı kültür
- 1.2.2.1 içinde açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişeler hazırlamak ve 50 µg/mL carbenicillin ve 1 mM IPTG son bir konsantrasyon ekleyin.
- 1.2.2.2 içinde açıklandığı gibi L1s hazırlanması ile devam edin. Toplamda, 300.000 solucanlar onları dört şişe bölmek için ihtiyaç vardır.
- Denetimi RNAi eklemek bakteri ve RNAi bakteri gen (dan ilgi adım 1.2.1) açıklandığı gibi solucanlar sayısı ile orantılı için adım 1.2.2.7 ve ayrıca L1 ve L4 sahne arasında büyüme aşamasında göz önünde bulundurun: 13 mL ilgili bakteri şişesi genç w için ücret ekleyin ORMS ve şişesi yaşlı kurt için başına 26 mL.
- 1.2.2.8 adımda anlatıldığı gibi devam edin.
- C. elegans sıvı kültürlerin bakım
- Düzenli olarak bir aliquot her sıvı kültür ve yer bir cam slayt üzerinde toplamak (alternatif olarak bir agar plaka üzerinde) hiçbir contaminations doğrulamak için. Diseksiyon mikroskop kullanmadan, bakteriyel gıda düzeyleri kültür özellikle büyüme aşamasında kontrol edin. Önceden kontrol RNAi kültürleri 2 L hazırlamak bakteri ve RNAi bakteri gen 1.2.1 adımda anlatıldığı gibi ilgi için. Bunlar C. elegans sıvı kültürleri için gerekirse ekleyin ve geri kalan 4 ° C'de tutmak
- Düzenli olarak hayvanlar steril olduğundan emin olun. Hayvanlarının çoğu erbezi yoktur. Alellerle gon-2 mutasyon bağlı olarak bazı Gonad yapıları iptal ama hiçbir hayvan yumurta ile dikkat edilmelidir.
- Sıvı kültür için bakteri hazırlanması
- Genç ve yaşlı kurt RNAi için sıvı kültüründe tabi topluluğu
Not: Tüm aşağıdaki adımları bir sıvı kültür şişesi için ancak kontrolü ve RNAi bakteri ile aynı yaşta ilgi gen için her iki kültürleri birlikte işlenip.- Genç kurt 2 gün veya gün protein insolubility bazal düzeyleri ölçmek için 3 toplama. Nüfusun yarısının ölen yaşlı kurt (en geç), toplanan olmalıdır. Bunu belirlemek için ölü ve canlı solucanlar sıvı kültürünün bir agar plaka üzerine yerleştirilen birkaç damla olarak dikkate alınır. Oranları en az dokuz damla üzerinde ortalama.
- Aşağıdaki reaktifler hazırlamak: 1 L M9, 1 L M9 %0.01 ile Octoxynol-9 (M9 + Octoxynol-9) ve 40 mL % 60 Sükroz GKD2O. reaktifleri buz üzerinde tutmak.
- Bir balonun üzerinden solucanlar bir ayrılık huni içine dökün ve solucanlar tortu oda sıcaklığında 10 dakika izin ver. Stopcock açın ve solucanlar bir 50 mL tüp içine damla.
- Solucan Pelet iki 15 mL-tüpler içine split ve oda sıcaklığında 5 min için 1.900 x g, santrifüj kapasitesi. Solucanlar yıkamak için süpernatant çıkartın ve ilâ 15 mL M9 ile doldurun. Santrifüjü yineleyin. Son olarak iki 50 mL tüp solucanları aktarmak ve 20 mL toplam birime buz gibi M9 ile doldur.
- Kaldırmak için bakteri ve ölü solucanlar, eklemek iki 20 mL sulandırılmış solucan granül iki 50 mL tüpler için 20 mL buz gibi % 60 Sükroz ile dolu. 2700 x g oda sıcaklığında, 9 hızlanma ve yavaşlama 7, 5 min için de hızlı bir şekilde santrifüj kapasitesi. En iyi solucan katman büyük damlalıklı (25 mL) ile dikkatli bir şekilde çıkarın. 15 mL al (ama az belli ki orada bir sürü ölü solucanlar). Bu M9 + Octoxynol-9 doğrudan 37 mL koymak (sukroz tüp başına 3 tüpler) hazırlanan buzda. 2700 x g 3 dakika oda sıcaklığında, hızlanma, yavaşlama 7 ve 9 santrifüj kapasitesi.
Not: Her ikisi de buz gibi olmak gerekir; Aksi takdirde ayırma çalışmaz. Karıştırmayın! Sükroz solucanlar için zehirli olduğundan aşağıdaki adım için hızlı olmak önemlidir. - Pelet dört 15 mL-tüpler içine bölmek ve yıkama iki kez buz gibi M9 + Octoxynol-9 ile: 1.900 x g, santrifüj, oda sıcaklığında 1 dk için. Süpernatant kaldırmak için buz gibi M9 + Octoxynol-9 ve tekrar yordamı ile 15 mL işaretine doldur.
- Bir kez buz gibi M9 ile yıkayın ve iki tüp için dört tüpler birleştirir. Toplam hacmi 4 mL 15 mL tüpler için oda sıcaklığında M9 ile doldurmak ve a nutating Mikser 40 dk. 25 ° c üzerinde döndürün.
Not: Bu artık bakterileri gut sindirmek için solucanlar yardımcı olur. Solucanlar hiçbir ölü olanlar görmek için mikroskop altında kontrol edin. - Buz gibi M9 + Octoxynol-9 ile iki kez solucanlar 1.3.5 içinde açıklandığı gibi yıkayın. İki kez M9 ile yıkayın ve bir tüp solucanlar aktarın.
- Solucanlar bir kez yeniden bir araya getirme (RAB) yüksek tuz çıkarımı arabellek (0.1 M 4-morpholineethanesulfonic asit (MES), 1 mM ethyleneglycoltetraacetic asit (EGTA), 0,1 mM EDTA, 0,5 mM MgSO4, 0,75 M NaCl, 0,02 M sodyum florür (kaf)) inhibitörleri olmadan yıkayın koleksiyon daha önce. Hiçbir sıvı solucan Pelet üstüne kadar süpernatant kaldırın.
Not: Bu adımı ve sonraki hızla yüksek tuz konsantrasyonu arabellek neden solucan aktarımında önlemek için yapılmalıdır. - Solucan Pelet hacmi tahmin ve RAB özdeş bir birim inhibitörleri (2 x proteaz inhibitörü kokteyl) ile ekleme. Pasteur pipet kullanarak, solucanlar kadar çizmek ve yavaş yavaş sıvı azot kuru buzun içinde yer yarısı dolu bir 50 mL tüp içine damla. Sıvı azot buharlaşır ve-80 ° C'de donmuş solucanlar daha fazla işleme kadar saklamak izin.
Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı azot olduğunu; uygun koruma giymek.
2. çözünmez Protein çıkarma ile ilgi bir gen hedefleme RNAi tabi genç ve yaşlı hayvan
-
1.3. adımda toplanan hayvanların bozulma
Not: Herhangi bir solucan örnekleri çözme önlemek önemlidir. Sıvı azot ile harç sakin ve kuru buza tam yordamı gerçekleştirin.
Dikkat: Son derece düşük bir sıcaklıkta sıvı azot olduğunu; uygun koruma giymek.- Donmuş solucanlar için önceden soğutulmuş harç transfer ve 2.5 min için eziyet.
Not: Taşlama sırasında dikkatli olun: Başlangıçta, donmuş kurt küçük mermi vardır ve onları kaybetmek kolaydır. - Sıvı azot (yaklaşık 100 mL) tekrar serin ve solucan cesetleri kırık mikroskop ile başka bir 2.5 dk. onay için eziyet tozu ekleyin. Toz 2 mL tüpler içine aktarın ve onlara-80 ° C'de depolayın
- Donmuş solucanlar için önceden soğutulmuş harç transfer ve 2.5 min için eziyet.
-
Hızlı çözünmez protein çıkarma Western blot analizi için
Not: Toplam protein içerik ve çözünmez protein düzeyleri farklı gün ve faiz gen hedefleme RNAi olmayan arasında karşılaştırmak için bu yöntemi kullanın. Adım 2.2.3 buz kadar tüm adımları gerçekleştirin!- Zemin Worms adım 2.1 ile 150'den 50 mg solubilize µL Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek (50 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, % 0.5 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 0.5 sodyum deoxycholate (SDO), %1 nonylphenylpolyethylenglycol (NP40), 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF), 1 x proteaz inhibitörü kokteyl). 1 mL şırınga gri iğneyle (27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm); kullanma süspansiyon homojenize süspansiyon kadar 10 kez çizin.
- 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj Süpernatant toplamak.
- Pelet 100 µL RIPA arabellek ve santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de resuspend Süpernatant atmak, kısa bir süre spin ve artık süpernatant kaldırmak dikkatli olun.
- Son derece çözünmez proteinler solubilize için Pelet 75 µL üre/SDS arabellekte (8 M üre, % 2 SDS, 50 mM dithiothreitol (DTT), 50 mM Tris, pH 8) resuspend ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
- Toplam protein içeriği analiz etmek için ilk RIPA 2.2.2 adımından süpernatant ve üre/SDS Pelet resuspension birleştirir. Çıkış için kullanılan birimler için hesap için toplam kesir RIPA süpernatant üçte ikisi ve üre/SDS Pelet kesir üçte biri bulunması gerekmektedir. Küçük 4-%12 degrade jel üzerinde 4 µL toplam kombine protein ve üre/SDS fraksiyonunun 9 µL yükleme çözünmez protein seviyesini kontrol edin. Bir toplam protein leke boyama protein düzeyleri izlemek için gerçekleştirin. Batı tarafından insolubility için bireysel proteinler tarafından kütle spektrometresi sayısal olarak değişiklikleri doğrulamak belirli antikorları kullanarak kurutma (Bölüm 3 bakınız).
-
Kütle spektrometresi SDS çözünmez proteinleri yalıtmak için çözünmez protein çıkarma
Not: buzda tüm adımları gerçekleştirin.- Kuru buza 350 mg zemin solucanlar her zaman noktası başı RNAi bakteri (genç ve yaşlı kurt, denetim RNAi bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi için) 2 mL tüpler içine tartmak dışarı iki kez.
- Yüksek tuz çözünür proteinler kaldırmak için RAB iki birim başına ağırlık (700 µL) inhibitörleri, 1 mM PMSF, ben ve 100 µg/mL RNase A her tüp ve buz üzerinde toz solubilize 200 U/mL Dnaz ekleyin. Süspansiyon kadar bir 1 mL şırınga (gri iğne, 27 G x ½", 0.4 mm x 13 mm) 15 kez çizmek ve 10 dk santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de buz üzerinde kuluçkaya Yağ katman sayesinde gidip koşul (Toplam dört tüpler) başına bir 2 mL tüp içine yüksek tuz çözünür protein içeren süpernatant toplamak. Yağ çıkarmak ve bu atın. -80 ° C'de dondurmak için aliquot yüksek tuz çözünür proteinler
- Lipidler atmak için 1 M Sükroz içeren inhibitörleri ile Pelet 700 µL RAB ile solubilize (Dnaz olmadan ben ve RNase A). Süspansiyon kadar bir şırınga 10 kez çizmek ve 5 dk. santrifüj 18,400 x g 4 ° C'de 20 dk için de buz üzerinde kuluçkaya Tüm süpernatant ve lipidler kaldırmak ve onları atmak dikkatli olun.
- SDS-çözünür proteinler kaldırmak için Pelet 700 µL RIPA arabelleği ile solubilize. Süspansiyon kadar bir şırınga 10 kez çizmek ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya. 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj SDS-çözünür protein ve aliquot-80 ° C'de dondurmak için içeren süpernatant toplamak
- Her koşul birlikte iki örnekleri her Pelet 500 µL RIPA arabelleği ile çözücü sonra havuz. Süspansiyon kadar 10 kez bir şırınga çizin. 4 ° C'de 20 dk için 18,400 x g, santrifüj Tüm süpernatant kaldırmak ve onu atmak dikkatli olun.
Not: Çıkarma amacı çözünür proteinler çözünmez proteinler ayırmaktır. Bu nedenle, tüm kalıntı RIPA formik asit sonraki adımda eklemeden önce süpernatant kaldırmak önemlidir. - 400 µL % 70 formik asit ile son derece çözünmez protein içeren son Pelet solubilize ve süspansiyon kadar bir şırınga 20 kez çizin. Buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. 50.000 x g 20 dk 4 ° C, 3 hızlanma ve yavaşlama 5, solucan kütikül enkaz kaldırmak için için santrifüj kapasitesi. Son derece çözünmez protein içeren süpernatant toplamak ve-80 ° C'de dondurmak
- Çözünmez protein kesirler için kütle spektrometresi diyaliz
Not: 4 ° C'de diyaliz- 8 L diyaliz arabellek (50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, pH 7.5) hazırlamak ve sekiz 1 L Şişeler için bölmek. Üç membranlar yer (membran filtreleri 0.025 µM =) her 1 L kabı için arabellek yüzeyi.
- Membran dikkatle çözünmez protein formik asit 2.3.6. adımda elde çözündürüldükten 65 µL yükleyin. Her koşul altı membranlar ayrılmıştır.
- Bir örnek pH 5 µL kaldırıp bir pH şerit ekleyerek ile kontrol edin. PH (yaklaşık 2 h sonra) 7 ve 8 arasında ise, yukarı ve aşağı yavaşça pipetting tarafından örnek toplamak. Son olarak, 10 µL diyaliz arabellek her membran kapalı çökelti yıkamak için kullanın. Örnekleri-80 ° C'de dondurmak
3. kapsamlı kimlik ve miktar Protein Insolubility ile ilgi bir gen hedefleme RNAi tarafından indüklenen yaş olarak değişiklikler
-
Kütle spektrometresi analiz için hazırlık
- Diyaliz örneklerinde çözünmez protein miktarı % 4-12 degrade jel ile birlikte örneği bilinen konsantrasyon üzerine bir aliquot yükleyerek değerlendirin. Toplam protein jel boyama gerçekleştirmek ve bir görüntü analiz yazılımı ile protein miktarı ölçmek. (Adım 3.1.4) sindirim için gerekli tripsin tahmin etmek bu adım gereklidir.
- Santrifüj Evaporatör kullanarak örnekleri konsantre ve 8 M üre son bir konsantrasyon çözünmez protein solubilize.
- Alkillenme ve azaltma
- Eklemek Tris(2-carboxyethyl) için 4 mM örnekleri için son bir konsantrasyon fosfamin hidroklorür (TCEP). 1s 57 ° c 300 RPM için kuluçkaya. Örnekleri oda sıcaklığına koymak.
- İodoacetamide 8.4 mM son bir konsantrasyon için ekleyin. İçinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 45 dk (2s için inkübe) için kuluçkaya.
- Son 2 M üre konsantrasyonu elde etmek için 150 mM amonyum bikarbonat örneklerinde sulandırmak.
- Özet proteinler ile % 5 w/w tripsin gecede, 37 ° C ve 400 rpm değiştiren.
- Bir örnek % 12 SDS jel üzerinde sindirilir proteinlerin yüklemek ve bir toplam protein jel boyama sindirim işe yaradıysa analiz etmek için gerçekleştirin. Hala bazı grup mevcut yoksa 3.1.4 ve 3.1.5 arasındaki adımları yineleyin.
- Genç ve yaşlı kontrol ve tedavi RNAi C. elegans peptidler üreticinin yönergelerini takip göreli ve mutlak Nefelometri için izobarik etiketleri ile etiketlenmiştir.
Not: Alternatif olarak, tandem kitle Etiketler gibi miktar peptidler veya proteinler etiketleme için diğer yöntemleri kullanılabilir.
Not: Kütle spektrometresi analizi: örnek karmaşıklığını azaltmak için peptidler güçlü katyon değişim Kromatografi tarafından farklı bölümler için kütle spektrometresi analizi5içine ayrılmalıdır. Birkaç Kütle Spektrometreleri başka bir yerde17açıklandığı gibi göreli ve mutlak Nefelometri için çözümleme izobarik Etiketler yeteneğine sahiptirler. Elde edilen veriler uygun yazılım ile işlenip. Genel olarak bu analiz son derece çözünmez proteinler ve yaş ve proteostasis modülasyon yaptıkları değişiklikleri sağlar.
4. yaşlanma sırasında ilgi bir genin etkisi toplama desen Vivo içinde değerlendirilmesi
- Kütle spektrometresi analizde Bölüm 3, RNAi için tabi hayvanlarda farklı ölçüde biriken bir yaş bağımlı toplama eğilimli protein seçin. Transgenik C. elegans oluşturmak bu proteinin ifade satır öğesini floresan bir protein ile ve onun ilgili organizatörü veya bir doku özgü organizatörü kontrolü altında (uygun bir organizatörü seçim için konuya bakın). 15 ° C'de zorlanma OP50 ile seribaşı Yuvarlak solucanlar büyüme (NG) plakaları standart teknikleri ile sürdürmek. Örneğin, polyadenylate-bağlayıcı protein (PAB-1) N-terminus faringeal kas promotor kontrol altına tagRFP için erimiş ifade bir solucan yük açmadı pmyo-2.
-
Toplama yaş üzerine gen inhibisyonu ile ilgi değişimler vivo içinde değerlendirilmesi
- 1-2 gün önceden hazırlamak NG/carbenicillin (Carb) / IPTG tabaklar bir denetimle (boş RNAi vektör L4440) bakteri ve RNAi bakteri gen ilgi etkisizleştirmek için. ( C. elegans RNAi hakkında detaylı bir iletişim kuralı için Jüpiter bilim eğitim bkz: Database. Biyoloji 1 essentials: Maya, Drosophila ve C. elegans. RNAi C. elegansiçinde. Aman Tanrım, Cambridge, MA, doi: 10.3791/5105 (2017)).
- L1 üzerinden RNAi tedavi için yer solucanları birkaç üzerine yumurta atarken denetim RNAi veya RNAi bakteri gen 20 ° C'de ilgi ile seribaşı küçük NG/karbonhidrat/IPTG (6 cm çapında) tabaklar ayırın. 20 ° C'de döl tutma 2 h sonra Yetişkin kaldırmak Gelişimsel hataları önlemek için RNAi tedaviler L4 larva aşamadan sonra başlatılabilir.
- Belgili tanımlık çoluk çocuk L4 larva sahne ulaştıktan sonra bu L4s kontrol RNAi veya RNAi bakteri gen ilgi ile seribaşı yeni NG/karbonhidrat/IPTG levhalar üzerine aktarın. Dokuz pilakalar ve 15 transgenics her iki koşul için ayarlamak ve 20 ° C'de saklayın Yaşlanma solucanlar onların döl uzak için yeni tabaklar onları--dan onların çoluk çocuk ayırt edebilmek için iki günde onların üreme dönemi sonuna kadar aktarılması gereken.
- Dağıtım sırasında yetişkinlik, her gün 24 x büyütme ile floresan bir stereo mikroskop altında floresan bir etiketle etiketlenmiş toplama eğilimli protein değişiklikleri değerlendirin.
Not: Parlak puncta toplama eğilimli protein yaş bağımlı birikimi toplama için bir okuma kullanılır. Bu puncta son derece hareketsiz yapıları toplamları karakterize edilebilir olmalıdır. Bu floresan kurtarma tarafından photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) sonra confocal mikroskobu kullanılarak tespit edilmelidir. İçin toplanan protein, hiçbir kurtarma sonra en az 4 min5,18ağartılmış bölgede dikkat edilmelidir. Yaş grubu değişiklikler ölçmek için biz dağıtım desenleri PAB-1 2 gün, 5 gün ve gün 7 aşağıdaki olarak erişkin overexpressing yaş senkronize solucanlar attı: düşük toplama düzeyleri (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta posterior faringeal ampul içinde) Orta toplama düzeyleri (posterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta) ve yüksek toplama düzeyleri (anterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz burada ne kadar uzun ömürlü hayvanlarla değerlendirmek için sunulan yöntemleri kullanılan azaltılmış IIS modüle yaş bağımlı protein toplama. Tarafından Western blot (2.2, çabuk çözünmez protein çıkarma Western blot analizi için bkz. adım), toplam ve genç (3. gün erişkin) çözünmez protein içeriği analiz ve yaş (gün 18 yetişkinlik) solucanlar kontrol RNAi ve insülin hedefleme RNAi / IGF-1-benzeri reseptör daf-2. RNAi koşulları (Şekil 2A) toplam protein düzeyleri yaş ile veya denetim daf-2 arasında büyük değişiklik görülmektedir. Beklendiği gibi güçlü bir yaşa bağlı artış düzeyleri kontrol hayvanlarda (Şekil 2B) son derece çözünmez proteinlerin tespit ettik. Daf-2 RNAi uzun ömürlü hayvanlarda buna karşılık toplama eğilimi büyük ölçüde azaldı. Tüm protein çözünmez özleri, boyama 18 bayat solucanlar daf-2 yaş eşlemeli kontrollere göre RNAi özler daha az karmaşık bir protein grubu desende ortaya koydu. Nicel kütle spektrometresi analiz gösterdi azaltılmış IIS ile uzun ömürlü hayvan-si olmak daha az genel yaş ilişkili protein toplama ve önemlisi, daf-2 inhibisyon kaldırıldı tamamen yaş bağlı insolubility, bir belirli alt proteinler7. Bu bulgular üzerinde takip için biz bir toplama eğilimli bu proteinler, PAB-1 üzerinde duruldu. PAB-1 öngörülen "deli dana gibi" etki alanı ile bir RNA-bağlama proteindir. Antikor boyama uzun ömürlü hayvanların PAB-1 Yaş (Şekil 2C) ile çözünür tutulan doğruladı.
PAB-1 toplama vivo içinde analiz için biz Transjenik hayvanlar tagRFP::PAB-1 faringeal kaslarda ifade üretti. Genç hayvanlarda tagRFP::PAB-1 esas olarak diffüz (şekil 3A, "düşük" toplama düzeyi) yutak yer alıyordu ama yaşlandıkça, biz parlak puncta posterior faringeal ampul ( başlayan bir ilerici birikimini gözlenen Şekil 3A, "ara" toplama düzeyi). Yaşlanma sırasında ayrıca hayvan sayısı giderek artan bir ön faringeal ampul (şekil 3A, "yüksek" toplama düzeyi) toplamada görülmektedir. Bu farklı kategorilerde gruplama hayvanlar tarafından bir nüfus PAB-1 toplama oranını attı. Erişkin 2 gün hiç veya çok az puncta (% 88) solucanların en vardı ve hiçbir hayvan yüksek toplama düzeyleri ile tespit edildi. Zaten 5 gün, %19 ara gösterdi nüfus ve gün süre 7 %70 daha fazla solucanların, % 16 yüksek toplama düzeyleri orta ve yüksek toplama düzeyleri sundu. TagRFP:PAB yaş bağımlı toplama üzerinde uzun ömürlü etkisini analiz için-1, transgenik tagRFP::PAB-1 solucanlar daf-2 mutasyon ile oluşturulan. Bu hayvanlar gösterdi önemli ölçüde azaltılmış tagRFP:PAB-1 puncta oluşumu ile yaşlanma, orta ve yüksek toplama düzeyleri bile gün 7 (şekil 3B) sergilenmesi nüfus % 15'den az olan.
Burada açıklanan farklı yaklaşımlar kullanarak, biz yaş bağımlı protein toplama farklı kapsamları için azaltılmış IIS engeller ve uzun ömürlü hayvanların PAB-17dinamiği geri yüklenmesi için özellikle verimli saptandı.
Resim 1 : Doğal protein toplama değişimler çağda ile çalışmaya iş akışının şematik C. elegans. Ana adımları kalın yazılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Protein insolubility artırır yaş denetim hayvanlar ama azaltılmış daf-2 sinyal ile hayvanlar ile. (A), 3. gün ve gün 18 gon-2(-) mutantlar denetim ve daf-2 (25 ° C de yetiştirilen) RNAi tabi toplam kesir toplam protein boyama. (B), 3. gün ve gün 18 gon-2(-) mutantlar denetim ve daf-2 (25 ° C de yetiştirilen) RNAi tabi SDS çözünmez kesir toplam protein boyama. Paneli başvuru7' den yayınlanacaktır. (C) Immunoblot PAB-1 ilgili protein bantları kırmızı okla gösterilen SDS çözünmez kesir algılama. Paneli başvuru7' den yayınlanacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Daf-2 indirimli sinyalizasyon engeller tagRFP::PAB-1 puncta yaş ile birikimi. (A)tagRFP::PAB-1 overexpression faringeal kaslarda Kurtlarla temsilcisi resimleri (yüksek büyütme mikroskop, tagRFP algılama ayarları: uyarma 558 nm, emisyon 583 nm). Hayvanlarla düşük (0-10 tagRFP::PAB-1 puncta posterior faringeal ampul), orta (posterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta) ve yüksek toplama düzeyleri (anterior faringeal ampul içinde 10'dan fazla puncta) gösterilir. Ölçek çubuğu = 20 µm. (B) miktar farklı tagRFP::PAB-1 toplama düzeyleri ile wildtype çağda ve daf-2 mutant arka plan şiddetle gecikmeli tagRFP::PAB-1 toplama ile yaş uzun ömürlü hayvanlarda ortaya koymaktadır. 2 gün, 5 gün ve 7 gün daf-2(-) wildtype arka plan karşı orta ve yüksek toplama düzeyleri ile karşılaştırıldığında düşük: Fisher'in kesin testi, ***p < 0,0001. Paneli başvuru7' den yayınlanacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Hisse senedi çözüm | Tutar | Son konsantrasyonu | Yorumlar/açıklama |
| Sıvı kültür, Toplam hacim 300 mL | |||
| S (500 mL: 5,9 g için NaCl, 50 mL 1 M potasyum fosfat pH 6) Bazal | 200 mL | 1 M potasyum fosfat pH 6: için 1 l: 129 g KH2PO4 yem mono, 52 g K2HPO4 dibasic susuz | |
| 1 M potasyum sitrat pH 6 (için 400 mL: 13,1 g sitrik asit monohidrat, 134.4 g tri-potasyum sitrat monohidrat) | 3 mL | 10 mM | |
| İzleme metaller çözüm (için 1 l: 1.86 g Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 H2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O) | 3 mL | Hisse senedi çözüm karanlıkta 4 ° C'de depolayın | |
| 1 M MgSO4 (500 mL: 123.3 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 1 M CaCl2 (500 mL: 73,5 g) | 900 ΜL | 3 mM | |
| 200 µg/mL Carbendazim (50 mL: 10 mg metanol içinde) | 150 ΜL | 100 ng/mL | |
| 5 mg/mL kolesterol (için etanol 100 mL: 0,5 g) | 300 ΜL | 5 µg/mL | |
| Yeniden birleştirme (RAB) yüksek tuz çıkarımı arabellek, 30 mL | |||
| 1 M 4-Morpholineethanesulfonic asit (MES) | 3 mL | 100 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 0,5 M Ethyleneglycoltetraacetic asit (EGTA) | 60 ΜL | 1 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 0,5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) | 6 ΜL | 0,1 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 1 M MgSO4 | 15 ΜL | 0,5 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 5 M NaCl | 4.5 mL | 750 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 1 M sodyum florür (kaf) | 600 ΜL | 20 mM | RAB stok arabelleği bileşen |
| 30 ml GKD2ile O toplam tamamlamak | |||
| Proteaz inhibitörü kokteyl x 50 | * | 2 x | * Sonra RAB hisse senedi arabellek miktarı alarak gerekli reaktifler ekleyin (kütle spektrometresi çıkarılması için 6 mL). |
| 100 mM Phenylmethylsulfonyl florür (PMSF) isopropanol,-20 ° C | * | 1 mM | |
| 10 U/µL DNaseI | * | 200 U/mL | |
| 4 mg/mL RNaseA | * | 100 µg/mL | |
| RAB ile 1 M sukroz, 30 mL | |||
| 2 M sukroz (50 mL: 34,2 g için) | 15 mL | 1 M | RAB arabellek reaktifler yanı sıra DNaseI ve RNaseA ekleyin |
| Radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabellek, 30 mL | |||
| 1 M Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 8 | 1,5 mL | 50 mM | RIPA stok arabelleği bileşen |
| 5 M NaCl | 0.9 mL | 150 mM | RIPA stok arabelleği bileşen |
| 0,5 M EDTA | 0.3 mL | 5 mM | RIPA stok arabelleği bileşen |
| % 10 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) | 1,5 mL | % 0.50 | RIPA stok arabelleği bileşen |
| % 10 sodyum deoxycholate (SDO) | 1,5 mL | % 0.50 | RIPA stok arabelleği bileşen |
| Nonylphenylpolyethylenglycol (NP40) | 0.3 mL | % 1 | RIPA stok arabelleği bileşen |
| 30 ml GKD2ile O toplam tamamlamak | |||
| 100 mM PMSF | * | 1 mM | * Sonra RIPA hisse senedi arabellek miktarı alarak gerekli reaktifler ekleyin (kütle spektrometresi çıkarılması için 10 mL). |
| Proteaz inhibitörü kokteyl x 50 | * | 1 x | |
| Üre/SDS arabellek, 10 mL | |||
| Üre | 4.8 g | 8 M | |
| % 10 SDS | 2 mL | % 2 | |
| Dithiothreitol (DTT) | 77 mg | 50 mM | |
| 1 M Tris pH 8 | 0.5 mL | 50 mM | |
| 10 ml GKD2ile O toplam tamamlamak | |||
| Diyaliz arabellek, 1 L | |||
| Tris | 6 g | 50 mM | |
| DTT | 154 mg | 1 mM | |
| 100 mM PMSF | 1 mL | 0,1 mM | |
| PH 7.5 ve 1 M'ye toplam GKD2O ile tam uyum | |||
Tablo 1: Sıvı kültür, çözünmez protein çıkarma ve diyaliz arabelleklerini.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada son derece çözünmez protein toplamları RNAi için analiz için kütle spektrometresi ve Western Blot tarafından tabi C. elegans yaşlanma dan izole etmek için bir metodoloji raporu. Biz proteostasis IIS büyük ölçüde azaltarak iyileştirilmesi yaş bağımlı protein toplama engellediğini gösterir. C. elegansiçinde overexpress için belirli toplama eğilimli proteinler seçerek, daha fazla doğal protein toplama oransal mekanizmaları incelemek mümkündür.
Hastalık ilişkili Protein toplama karşı doğal yaş bağımlı Protein toplama
Bu büronun iş protein toplama spesifik proteinlerin bir hastalık bağlamda toplayarak için sınırlı değildir önceki bulgular temel alır. Ectopically ifade hastalık ilişkili proteinler yerine endojen toplama eğilimli proteinler odaklanarak, beklenti içine fizyolojik düzenleme toplama işlemi, roman fikir sağlamaktır. Yaş bağımlı protein toplamları farklı hücresel yerlerde5' te bulunur gibi yaptıkları çalışmada bölme içgörü Ayrıca belirli kalite kontrol mekanizmaları sağlamalıdır. Genel olarak, doğal protein toplama kontrol mekanizmaları da hastalık protein toplama önlemede alakalı olabilir. Yaş bağımlı protein toplama çeşitli yönleri hastalığı protein toplamada benzer, ancak Not, bu hala olup amiloid liflerinde, birçok hastalık toplamları karakteristik bu toplamları içeren belirsizdir.
Seçimi C. Elegans Model: avantajları ve sınırlamaları
Memeli manken, bir yaşlanma ile ilgili karakteristik çalışmaya C. elegans kullanmanın en büyük avantajlarından biri onun çok kısa ömrü karşılaştırılır. Birkaç yüz proteinler sürekli olarak yaşlanma sırasında son derece toplama-eğilimli olmak ve bu büyük artış insolubility, hatta bir basitleştirilmiş biyokimyasal çıkarma ile kolayca algılanabilir. Ancak, yaş bağımlı protein toplama eğitimi için C. elegans kullanımının önemli bir sınırlama çok sayıda yaşlı hayvanlar izole etmek için zorunluluktur. C. elegans hünsa vardır ve yaklaşık 220 üretmek veya onların üreme sırasında daha fazla döl19aşama gibi üreme önlemek ya da döl bir nüfus yaş için ortadan kaldırmak için önemlidir. Kısırlık neden kullanabileceğiniz birkaç seçenek vardır: bir seçenektir kimyasal fluorodeoxyuridine (FUdR), bir DNA sentezi inhibitörü kullanmak için. Ancak, FUdR çok sayıda yan-proteostasis değişiklikleri içeren ve protein toplama20,21,22azaltılmış etkileri için yol açar. Önemlisi, FUdR genotip özel yanıt23neden olmaktadır. Sıcaklığa duyarlı steril mutantlar kullanmak için başka bir seçenektir. Örneğin, spe-9(hc88), fer-15(b26), fem-1(hc17), glp-1(e2141) ve gon-2(q388) daha önce yaş bağımlı toplayarak Proteom5kütle spektrometresi analizleri için kullanılmıştır, 8.
Henüz bu mutant kullanarak ilgili bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, kısırlık sıcaklık bağımlı olduğu için 25 ° c, hafif bir stres oluşturmaktadır ve yaşlanma gibi protein toplama hızlandırır hayvanlar büyümek gereklidir. Diğer taraftan, biz gözlemledim vahşi-tipi 25 ° C'de (veri gösterilmez) muhafaza gon-2, glp-1 ve fem-1 mutantlar longer-lived ile karşılaştırıldığında. İkinci olarak, üreme kusur her türüyle ilişkili belirli sınırlamalar vardır. Sperm-arızalı mutantlar kullanarak bir dezavantaj döllenmemiş yumurta (Ayrıca üretilen yaşlı yaban tipi hünsa) yapımıdır. Bu yumurta kalitesini büyük ölçüde yaşla azalır ve onlar içinde erbezi24,25birikir. Nicel kütle spektrometresi analiz sperm-arızalı mutantlar çözünmez proteinler erbezi-az veya germline eksikliği mutantlar için karşılaştırıldığında yaş ile biriken birkaç kat daha yüksek seviyelere sahip gösterir. Bu protein misfolding gösterir ve12,13 erbezi5' i ile önceki anlaşma içinde yer alan toplama çalışmaları ve anormal yumurta bulunan ifşa toplanan proteinler in vivo deneyler kümeleri5. Bu nedenle, erbezi toplamada aşırı protein protein toplama somatik dokularda daha fazla ince değişiklikleri maskeleyeceği. Bu da üreme ve somatik doku proteostasis üzerinde farklı kapsamları için hareket müdahaleler karşılaştırırken dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, sadece bedensel protein toplama değerlendirmek için erbezi daha az gon-2 mutantlar kullanarak lehine. Alternatif germline eksikliği glp-1 mutantlar kullanmak olacaktır. Ancak, bu hayvanların gon-2 mutantlar5' e göre yaş ile daha az doğal protein toplama var unutmayın. Bu büyük olasılıkla germline-arızalı erbezi26,27,28sinyal nedeniyle somatik dokularda geliştirilmiş proteostasis bir sonucudur. Vahşi-türü hayvanlar kullanın ve döl sedimantasyon tarafından her gün kaldırmak için başka bir alternatiftir. Ancak, bu tamamen tüm döl çıkarma zorluğu nedeniyle sorunlu olduğunu.
C. elegans kullanmanın başka bir genel belirli doku çekimi zorlu kılan onun küçük büyüklük kısıtlamadır. Böyle bütün hayvan çekimi için nasıl farklı koşullar ilgili bilgileri sağlamak değil gibi protein toplama belirli dokularda modüle. Belirtmek gerekirse bu sorun büyük olasılıkla C. elegans29belirli hücreleri izole etmek Floresans aktif hücre sıralama üzerinde esaslı bir son zamanlarda gelişmiş yöntemi kullanarak hile. Bu yöntem çözünmez protein çıkarılması için yeterli malzeme elde etmek için uygun olacak ve yaşlı hayvanlar için geçerli olacağını olup olmadığını tespit edilecek kımıldamazmış. Alternatif olarak, doku belirli protein toplama ve onun Yönetmelik Ek vivo deneyler tarafından soruşturma. Transjenik hayvanlar seçtikleri fluorescently etiketli toplama eğilimli protein ifade hızla oluşturulabilir ve hayvanlar şeffaf olduğundan, protein toplama in situincelemek nispeten kolay.
Genel olarak, in vivo deneyler vahşi tipi arka planda proteomik sonuçlarla takip etmek önemlidir. Biyokimyasal ve mikroskopi temel alan nitelik özellikleri kombinasyonu protein toplama kapsamlı bir çalışma ve ilgi genlerin rolünün bir değerlendirme sağlar. İkinci C. elegans besleme ve belgili tanımlık availability tüm genom RNAi kütüphanelerin aracılı RNAi tarafından yönetilir. Ayrıca, çok sayıda karakterize mutantlar RNAi tarafından elde edilen sonuçları onaylamak için veya RNAi yerine kullanmak için mevcut.
Sıvı kültür ve biyokimyasal çıkarma: avantajları ve sınırlamalar
Proteinler yüksek toplanan toplam proteinlerin sadece küçük bir bölümü yaptıkça, çok sayıda hayvan ayıklama başlatmak gereklidir. İle büyük miktarlarda çözünmez proteinlerin kütle spektrometresi için örnek karmaşıklığı azaltmak ve böylece daha düşük bol protein tanımlaması geliştirmek için geniş peptid ayırma gerçekleştirmek için uygun zaman. Çözünmez proteinler küçük miktarlarda gereklidir yalnızca, solucanlar plakalar üzerinde büyümeye ve onları seramik boncuklar ile homojenize alternatifi değildir. Sıvı kültür dezavantajları bir kirlenme durumunda bütün kültür etkilenir ve atılmalıdır biridir. Genel olarak, C. elegans yaşlanma şiddetle sıcaklığı ile etkilenir ve bu parametre sıkı sıvı kültüründe yaş bağımlı protein toplama varyasyon önlemek için kontrol gerekir. Sıcaklık kontrolü de erbezi daha az hayvan homojen bir nüfusa gon-2(-) mutantlar kullanırken elde etmek için önemlidir.
Çalışmanın amacı bağlı olarak, farklı çıkarma yöntemleri dikkate almak önemlidir. Burada sunulan biyokimyasal ayıklama başlangıçta hastalık ilişkili toplamları11,30,31yalıtmak için iletişim kurallarından uyarlanmıştır. Deterjanlar daha çözünmez toplamları ayırmak için % 0,5 SDS gibi nispeten yüksek konsantrasyonda seçtik. Ayrıca % 0.5 SDS çözünmez toplamları ile düşük Radyal hız peletleme tarafından bu protokolü sadece daha büyük toplamları ayırmak. Alternatif olarak, daha az sıkı bir iletişim kuralı kısa bir süre önce10yaşındaydı. Bu çalışmada, daha fazla çözünür ve daha küçük toplamları da SDS atlama ve 500.000 x g de çok yüksek Radyal hızları kullanarak elde. Farklı iletişim kurallarının bir karşılaştırma sayısı daha az sıkı protokol7kullanarak toplayarak Proteom proteinler olarak genel bir artış gösterir. Biz indirimli daf-2 verimli sinyal uzun ömürlü hayvanlarla SDS-çözünür ve SDS çözünmez toplamları erbezi daha az hayvan7birikimi engelledi unutmayın.
Vivo Yaş bağımlı Protein toplama analizi
Aşağıdaki yaş bağımlı protein toplama işlemi transgenik modelleri oluştururken, ilgi ve hangi ifade düzeylerde Toplama eğilimli protein overexpress için hangi doku düşünün alakalı. Biz ifade dokularda yaşlanma bağırsaklarda önemli olduğu autofluorescence, girişimi engellemek için baş bölgesinde yer alan lehine. Düşük-büyütme ile floresan etiketli toplamları görselleştirmek için toplama eğilimli protein nispeten yüksek bir düzeyde ifade edilmelidir. Öte yandan, çok yüksek ifade formu toplamaları için toplama eğilimli protein zaten genç hayvanlarda neden olur.
Birlikte ele alındığında, bu yöntemler neden Yaşlandıkça Proteom parçası toplar anlamak ve sonuçta sağlıklı yaşlanma teşvik stratejilerinin geliştirilmesi için yol için bize yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser DZNE ve Marie Curie International Reintegration Grant (D.C.D. 322120) fon tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
References
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. The Nematode Caenorhabditis elegans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
