Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans
Summary
L’obiettivo del metodo qui presentato è quello di esplorare l’aggregazione di proteine durante l’invecchiamento normale nell’organismo modello di c. elegans. Il protocollo rappresenta un potente strumento per studiare i grandi aggregati altamente insolubili che formano con l’età e per determinare l’impatto di cambiamenti nel proteostasis aggregazione proteica.
Abstract
Negli ultimi decenni, la prevalenza dei disordini neurodegenerative, quali il morbo di Alzheimer (annuncio) e malattia di Parkinson (MDP), è cresciuta. Queste malattie età-associate sono caratterizzate dalla comparsa di aggregati di proteine con struttura fibrillare nei cervelli di questi pazienti. Esattamente perché normalmente solubili proteine subiscono un processo di aggregazione rimane capito male. La scoperta che l’aggregazione proteica non è limitato ai processi di malattia e invece parte del normale processo di invecchiamento consente lo studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano l’aggregazione proteica, senza l’utilizzo di ectopically espresso umano proteine associate a malattia. Qui descriviamo metodologie per esaminare l’aggregazione proteica inerente in Caenorhabditis elegans attraverso approcci complementari. In primo luogo, esaminiamo come far crescere un numero elevato di età-sincronizzato elegans del c. di ottenere animali invecchiati e presentiamo le procedure biochimiche per isolare altamente insolubile grandi aggregati. In combinazione con un atterramento di genetico mirato, è possibile sezionare il ruolo di un gene di interesse nel promuovere o prevenire l’aggregazione proteica età-dipendente utilizzando sia un’analisi completa con spettrometria di massa quantitativa o un analisi basata su candidati con gli anticorpi. Quindi, questi risultati sono confermati dall’analisi in vivo con animali transgenici che esprimono proteine fluorescenti-etichettate aggregazione-incline. Questi metodi dovrebbero aiutare a chiarire perché alcune proteine sono inclini ad aggregarsi con l’età e, in definitiva, come mantenere queste proteine completamente funzionale.
Introduction
Misfolding e aggregazione sono riconosciuti come un marchio di garanzia di parecchie malattie neurodegenerative quali AD, PD, sclerosi laterale amiotrofica (ALS), la demenza frontotemporale (FTD) e molti altri. Per esempio, α-synuclein assembly in fibrille amiloidi che si accumulano come i corpi di Lewy specialmente nel nigra di substantia dei pazienti del Palladio, mentre in misfold di TDP-43 o FUS di pazienti ALS a formare aggregati citoplasmatici a degenerazione dei neuroni di motore. In ciascuno di questi disordini neurodegenerative, meccanismi di mantenimento omeostasi della proteina o proteostasis non riescono ad impedire l’accumulo di proteine misfolded, conseguenza che conducono alla malattia.
Proteostasis è fondamentale per garantire le funzioni cellulari e in condizioni normali questi meccanismi regolatori sotto stretto controllano il tasso di sintesi proteica, pieghevole e degradazione. Parecchi studi dimostrano che con l’invecchiamento, la capacità di molte cellule e organi per mantenere l’omeostasi della proteina è gradualmente compromessa e il deterioramento fisiologico delle reti proteostasis con l’età è un importante fattore aggravante per malattie neurodegenerative (rivisto in riferimenti1,2,3). Il fatto che il controllo di qualità di proteina e la risposta cellulare allo stress spiegata della proteina sono compromessi con l’età suggerisce che misfolding e aggregazione potrebbe essere una conseguenza di invecchiamento generale. Infatti, noi ed altri abbiamo dimostrato che l’aggregazione proteica non è limitato alla malattia e invece parte del proteoma diventa altamente detersivo-insolubili in animali invecchiati4,5,6,7 ,8,9,10. Analisi computazionale e in vivo ha rivelato che questi aggregati relativi all’età fisiologici simili aggregati di malattia in diversi aspetti5. La scoperta di aggregazione della proteina endogena, età-dipendente ci dà la possibilità di sezionare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano l’aggregazione proteica, senza l’utilizzo di ectopically espressi proteine umane di malattia-collegati. Allo stato attuale, solo informazioni limitate esistono circa il regolamento di insolubilità di proteina diffusa e circa gli effetti di questa disregolazione sulla salute dell’organismo.
Il nematode c. elegans è uno dei microrganismi più estesamente studiati nella ricerca di invecchiamento come questi animali hanno una durata relativamente breve e mostrano molte caratteristiche di invecchiamento caratteristica osservate negli più alti organismi. Gli effetti dell’invecchiamento sull’insolubilità di proteina sono stati studiati in c. elegans di frazionamento biochimico sequenziale basato sulla solubilità differenziale, che è ampiamente usato per estrarre aggregati di malattia nel campo della ricerca di neurodegenerazione11 . Mediante spettrometria di massa quantitativa, parecchie centinaia di proteine sono stati indicati per diventare incline aggregazione in c. elegans in assenza di malattia5. Qui descriviamo in dettaglio il protocollo per crescere un numero elevato di vermi in coltura liquida e l’estrazione sequenza per isolare aggregati proteici per quantificazione mediante spettrometria di massa e analisi mediante Western blot. Perché le proteine misfolded e aggregazione-incline si accumulano in età di c. elegans gonadi e maschere cambiamenti in altri tessuti somatici5,12,13, usiamo un mutante di gonade-meno mettere a fuoco l’analisi della proteina insolubilità in tessuti non riproduttiva. Il metodo presentato consente l’analisi di aggregati altamente insolubile, grandi, che sono insolubili in 0,5% SDS e pellettato di relativamente bassa velocità centrifuga. In alternativa, un protocollo di estrazione meno rigoroso a raccogliere anche aggregati più piccoli e più solubili è stato pubblicato altrove10. In più, descriviamo il metodo utilizzato per valutare l’aggregazione in vivo in c. elegans.
Nel complesso, questi metodi in combinazione con interferenza del RNA (RNAi) possono valutare il ruolo di un gene di interesse nel modulare l’aggregazione proteica età-dipendente. Per questo abbiamo descrivere l’analisi di estratti da vermi giovani e invecchiati con e senza atterramento di una specifica proteina di interesse mediante RNAi. Questi metodi dovrebbero essere un potente strumento per determinare quali componenti della rete proteostasis regolano insolubilità di proteina. Diversi interventi ridotti come fattore di crescita dell’insulina/insulino-simile (IGF) 1 segnalazione (IIS) hanno dimostrato di ritardare notevolmente c. elegans invecchiamento14. Vie di longevità spesso inducono meccanismi di controllo di qualità di proteina e così queste vie potrebbero essere attivamente influenzare il tasso di aggregazione della proteina. Ad esempio, dimostriamo l’aggregazione di proteine intrinseche ridotta in animali longevi all’inibizione del pathway IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui segnaliamo una metodologia per isolare gli aggregati altamente insolubili della proteina da invecchiamento di c. elegans sottoposti a RNAi per l’analisi mediante spettrometria di massa e Western blotting. Mostriamo che miglioramento proteostasis riducendo notevolmente IIS impedisce l’aggregazione proteica età-dipendente. Selezionando specifiche proteine di aggregazione-inclini a iperesprimono in c. elegans, è possibile sezionare ulteriormente i meccanismi che modulano l’aggregazione proteica inere…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del DZNE e un Marie Curie International Reintegration Grant (322120 a D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
References
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