Målet med metoden som presenteres her er å utforske protein aggregering under normal aldring i modellen organismen C. elegans. Protokollen representerer et kraftig verktøy til å studere de svært uløselig store aggregatene som danner med alderen og bestemme hvordan endringer i proteostasis påvirker protein aggregering.
I de siste tiårene, har utbredelsen av nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom (AD) og Parkinsons sykdom (PD), vokst. Disse alder-tilknyttede lidelser er preget av utseendet på protein aggregat med fibrillary strukturen i hjernen til disse pasientene. Nøyaktig hvorfor vanligvis løselige proteiner gjennomgå fortsatt en samling prosessen dårlig forstått. Oppdagelsen at protein samling er ikke begrenset til sykdom prosesser og en del av normal aldringsprosessen kan stedet studere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. Her beskriver vi metoder for å undersøke iboende protein samling i Caenorhabditis elegans gjennom supplerende tiltak. Først vi undersøker hvordan å vokse stort antall alder-synkroniserte C. elegans hente alderen dyr og presenterer vi de biokjemiske fremgangsmåtene for å isolere svært uløselig-store mengder. I kombinasjon med en målrettet genetisk knockdown, er det mulig å dissekere rollen en genet av interesse i å fremme eller forebygge alder-avhengige proteiner aggregering ved hjelp av enten en omfattende analyse med kvantitative massespektrometri eller kandidat-basert analyse med antistoffer. Disse funnene er deretter bekreftet av i vivo analyse med transgene dyr uttrykke fluorescerende-merket samling utsatt proteiner. Disse metodene bør klargjøre hvorfor visse proteiner er utsatt for samlet med alder og til slutt hvordan beholde disse proteinene funksjonell.
Protein misfolding og aggregering gjenkjennes som et kjennetegn på flere nevrodegenerative sykdommer som Annonsen, PD, amyotrofisk lateral sklerose (ALS), frontotemporal-demens (FTD) og mange andre. For eksempel α-synuclein samlinger i amyloid fibrils som akkumuleres som Lewy-legemer i substantia nigra PD pasienter, mens i ALS pasienter TDP-43 eller Fu misfold til skjemaet cytoplasmatiske aggregat i degenereres motor neurons. I hver av disse nevrodegenerative lidelser mislykkes mekanismer opprettholde protein homeostase eller proteostasis å hindre akkumulering av misfolded proteiner, derfor fører til sykdom.
Proteostasis er avgjørende for å sikre cellulære funksjoner under normale forhold disse regulatoriske mekanismene kontroll tett frekvensen av proteinsyntese, bretting og fornedrelse. Flere studier viser at med aldring, evne til mange cellene og organene å bevare protein homeostase settes gradvis og fysiologiske forverring av proteostasis nettverk med alderen er en viktig skjerpende faktor for nevrodegenerative sykdommer (omtalt i referanser1,2,3). Det faktum at protein kvalitetskontroll og cellulær respons på brettet protein stress er utsatt med alderen antyder at protein misfolding og aggregering kan være en generell konsekvens av aldring. Faktisk har vi og andre vist at protein samling er ikke begrenset til sykdom og i stedet en del av proteom blir svært vaskemiddel-uløselig i alderen dyr4,5,6,7 ,8,9,10. Beregningsorientert og i vivo analyse viste at disse fysiologiske aldersrelatert aggregater ligner sykdom mengdefunksjoner i flere aspekter5. Oppdagelsen av endogen, alder avhengig av protein aggregering gir oss muligheten til å analysere molekylære og cellulære mekanismer som regulerer protein aggregering, uten å bruke ectopically uttrykt menneskelige sykdomsassosierte proteiner. I dag finnes begrenset informasjon om regulering av utbredt protein insolubility og effekten av denne feilregulering på helsen til organismen.
Rundormer C. elegans er en av de mest omfattende studerte modell organismene i aldring forskning som disse dyrene har en relativt korte levetid og viser mange karakteristiske aldring funksjoner i høyere organismer. Effektene av aldring på protein insolubility har vært studert i C. elegans av sekvensiell biokjemiske fraksjoneres basert på differensial løselighet, som er mye brukt til å trekke ut sykdom aggregater innen neurodegeneration forskning11 . Ved kvantitative massespektrometri, ble mange hundre proteiner vist å bli aggregering utsatt i C. elegans i fravær av sykdom5. Her beskrive vi i detalj protokollen for å vokse stort antall ormer i flytende kultur og sekvensiell utvinning isolere aggregert proteiner for kvantifisering av massespektrometri og analyse ved Western blot. Fordi misfolded og aggregering utsatt proteiner akkumuleres i alderen C. elegans gonader og masker endringer i andre somatiske vev5,12,13, vi bruker en gonad-mindre mutant fokusere analyse på protein insolubility i ikke-reproduktiv vev. Metoden presentert kan analyse av svært-uløselig, stor Sammendrag som er uløselig i 0,5% SDS og pelleted ved relativt lav sentrifugal hastighet. Alternativt en mindre strenge utvinning protokoll samle også mindre og mer løselig aggregater har vært publisert andre steder,10. I tillegg beskriver vi metoden brukes til å vurdere aggregering i vivo i C. elegans.
Samlet kan disse metodene sammen med RNA-interferens (RNAi) vurdere rollen en genet av interesse modulerende alder-avhengige proteiner aggregering. For dette beskrive vi analyse av ekstrakter fra ung og gammel ormer med og uten knockdown av et bestemt protein rundt ved hjelp av RNAi. Disse metodene bør være et kraftig verktøy for å finne ut hvilke komponenter av proteostasis nettverket regulere protein insolubility. Flere tiltak som redusert insulin/insulin-lignende vekstfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har vist seg å forsinke dramatisk C. elegans aldring14. Levetid veier indusere ofte protein kvalitet kontrollmekanismer og dermed disse veiene kan være aktivt påvirke hastigheten av protein aggregering. Som et eksempel viser vi redusert iboende protein samling i varige dyr på hemming av IIS veien7.
Her rapporterer vi en metode for å isolere svært-uløselig protein aggregater fra aldring C. elegans utsatt for RNAi for analyse av massespektrometri og vestlige blotting. Vi viser at forbedre proteostasis ved å redusere IIS sterkt hindrer alder-avhengige proteiner aggregering. Ved å velge bestemte aggregering utsatt proteiner til overexpress i C. elegans, er det mulig å analysere videre mekanismer modulerende iboende protein aggregering.
Iboende alder-avhengige …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra DZNE og Marie Curie International reintegrasjon stipend (322120 til D.C.D.)
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
E.coli strain | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |