Summary

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

Published: March 15, 2018
doi:

Summary

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل والثقافة الآكلة في المختبر من الماوس نخاع العظام، ودراسة دور هدف ربمسن 1 المعقدة في تشكيل اوستيوكلاست/آليا إلى الثدييات.

Abstract

الآكلة فريدة من نوعها في ريسوربينج العظام الخلايا التي تميز من نسب الوحيدات/بلعم نخاع العظام. قد يؤدي إلى اختلال وظيفي للأكلة سلسلة من الأمراض الأيضية العظام، بما في ذلك مرض هشاشة العظام. على وضع أهداف الصيدلية لمنع فقدان كتلة العظم المرضية، يجب أن يكون مفهوما أن الآليات التي تميز الآكلة من السلائف. القدرة على عزل والثقافة عددا كبيرا من الآكلة في المختبر أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد دور جينات محددة في تمايز اوستيوكلاست. يمكن إنقاص عدد اوستيوكلاست المنظمة المستهدفة/آليا إلى الثدييات من ربمسن 1 معقدة (TORC1) في الآكلة وزيادة كتلة العظام؛ غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. ويرد في هذه الدراسة، بروتوكول المستندة إلى رانكل لعزل والثقافة الآكلة من نخاع العظام الماوس ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 على تشكيل اوستيوكلاست. وأسفر هذا البروتوكول بنجاح عدد كبير من الآكلة العملاقة، عادة خلال أسبوع واحد. ضعف تشكيل اوستيوكلاست حذف رابتور وتناقص نشاط الافرازية الفوسفاتيز الحمضي طرطرات المقاوم، مشيراً إلى أن mTORC1 أمر حاسم لتشكيل اوستيوكلاست.

Introduction

العظم هو هيئة دائمة التغير ويتم تشكيلها بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة طوال الحياة. الآكلة المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة غضاريف وخلايا الاوستيوبلاستس توليف وتفرز مصفوفات العظام الجديدة1. التوازن بين ارتشاف العظام وتكوين العظام حاسم بالنسبة لصحة العظام بما في ذلك الحفاظ على العظام الجماهيري والاستجابة للتحفيز والإصابة. إذا تعطل هذا التوازن، قد تحدث سلسلة من أمراض العظام الأيضية، بما في ذلك مرض هشاشة العظام وأمراض اللثة. في هذه الأمراض، ويتجاوز فقدان كتلة العظام الناتجة عن ارتشاف العظام أوستيوكلاستيك العظام تشكيل قدرة خلايا الاوستيوبلاستس2،3. وهكذا، من أجل تطوير أهداف الأدوية لعلاج أمراض الهيكل العظمى مثل هشاشة العظام، أنها حاسمة لفهم جيل وعلم الأحياء من الآكلة4.

الآكلة هي خلايا مولتينوكليتيد العملاقة فريد من نوعه يقع في أو بالقرب من سطح العظام، وتنتمي إلى الأسرة بلعم الوحيدات/1. ج. ك. Ibbotson et al. وذكرت وسيلة لتوليد اوستيوكلاست-مثل الخلايا في المختبر مع المتوسطة التي تحتوي على 1, 25-ديهيدروكسي-فيتامين D35. تحديد عامل تحفيز مستعمرة بلعم (م-CSF) والمنشط مستقبلات ليجند ب النووية عامل-κ (رانكل) كعوامل أساسية في تشكيل اوستيوكلاست زاد زيادة كبيرة كفاءة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر 1 , 6 , 7-القدرة على ثقافة الآكلة في المختبر قد تحسن فهمنا لتوليد وتنظيم الآكلة.

الهدف/آليا إلى الثدييات الوظائف ربمسن (mTOR) في اثنين من المجمعات المتميزة هيكلياً ووظيفيا، وهما mTORC1 و mTORC28،9. مجمعين البروتين المتعددة متميزة عن بعضها البعض بسبب مكوناتها المختلفة وركائز المتلقين للمعلومات. mTORC1 يحتوي على بروتين التنظيمية المرتبطة فريدة من mTOR (رابتور)، بينما يحتوي mTORC2 على رفيق ربمسن غير متحسسة من mTOR (Rictor)9. ويمكنك دمج mTORC1 وإرسال إشارات هامة لتنظيم نمو الخلايا وانتشارها والتمايز. في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن mTORC1 دوراً رئيسيا في الشبكة لارتشاف العظم تقويضي بحذف رابتور لإلغاء تنشيط mTORC1 في الآكلة10. غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. في هذه الدراسة، استخدمت أسلوب المستندة إلى رانكل أوستيوكلاستوجينيك لتوليد الآكلة من المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش) البرية من نوع (WT) والفئران الرابكتسك ، ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 في اوستيوكلاست تشكيل.

Protocol

جميع الإجراءات المتصلة بالحيوانات أجريت وفقا للبروتوكول الذي وافق عليه “الفريق الإداري ستانفورد” في العناية بالحيوانات المختبرية (أبلاك) ووافقت عليها بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لمعهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وخلية علم الأحياء. 1-إعداد توليد اوستيوكلاست محدد?…

Representative Results

باستخدام هذا البروتوكول، شوهدت عدد كبير من الآكلة العملاقة في يوم 6؛ إذا لم تعتبر الآكلة العملاقة، قد يكون يوم واحد للتمايز اوستيوكلاست اللازمة (الشكل 1). وأكد تشكيل اوستيوكلاست نجاح مصيدة تلطيخ (الشكل 2A). وكانت الآكلة العملاقة من الخلايا ا…

Discussion

تحليل أوستيوكلاستوجينيك هو الأسلوب الأكثر استخداماً لعزل والثقافة الآكلة في المختبر12،13. بينما عدة على أساس رانكل اوستيوكلاست الحث قد وصف13،،من1415، وصف هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استناداً…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الدكتور Minghan تونغ وكاتو س. يرجى توفير الكواشف والفئران. ونشكر أعضاء المختبر زو لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المنح من 973 برنامج من الوزارة الصينية للعلوم والتكنولوجيا (معظم) [2014CB964704 و 2015CB964503]، “برنامج البحوث السريرية” لمستشفى الشعب التاسع، “شانغهاي جياو تونغ جامعة كلية الطب”. شكرا لمساعدة “المرافق الأساسية” لبيولوجيا الخلايا والمرافق الأساسية “علم الأحياء الكيميائية”، والأكاديمية الصينية للعلوم في مركز للتفوق في مجال العلوم الخلية الجزيئية، معهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا، الأكاديمية الصينية للعلوم.

Materials

Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).

Play Video

Cite This Article
Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

View Video