Summary

Um baseado em RANKL Osteoclast cultura ensaio de Mouse medula óssea para investigar o papel de mTORC1 na formação de Osteoclast

Published: March 15, 2018
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Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para isolar e cultura osteoclastos em vitro da medula óssea de rato e estudar o papel do alvo da rapamicina 1 complexo na formação do osteoclast mamíferos/mecanicista.

Abstract

Osteoclastos são único osso-resorbing células que diferenciam-se da linhagem de monócitos/macrófagos da medula óssea. Disfunção dos osteoclastos pode resultar em uma série de doenças metabólicas ósseas, incluindo osteoporose. Para desenvolver metas farmacêuticas para a prevenção da perda de massa óssea patológica, devem-se compreender os mecanismos pelos quais osteoclastos diferenciarem dos precursores. A capacidade de isolar e cultura de um grande número de osteoclastos em vitro é fundamental para determinar o papel de genes específicos na diferenciação do osteoclast. Inactivação do alvo da rapamicina complexo 1 (TORC1) em osteoclastos mamíferos/mecanicista pode diminuir o número de osteoclasto e aumento da massa óssea; no entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, é descrito um protocolo baseado em RANKL isolar e cultura osteoclastos da medula óssea de rato e estudar a influência de inativação de mTORC1 na formação do osteoclast. Este protocolo com sucesso resultou em um grande número de osteoclastos gigantes, normalmente dentro de uma semana. Exclusão de Raptor deficiente formação osteoclasto e diminuiu a atividade secretora fosfatase ácida tartarato-resistente, indicando que mTORC1 é fundamental para a formação do osteoclast.

Introduction

Osso é um órgão em constante mudança e é remodelado por osteoblastos e osteoclastos ao longo da vida. Osteoclastos são responsáveis pela reabsorção de matriz mineralizada e osteoblastos sintetizam e segregam o novo osso matrizes1. O equilíbrio entre a reabsorção óssea e formação óssea é crucial para a saúde óssea, incluindo a manutenção do osso em massa e resposta à estimulação e lesão. Se esse equilíbrio é perturbado, pode ocorrer uma série de doenças metabólicas do osso, incluindo osteoporose e doenças periodontais. Estas doenças, perda de massa óssea resultante da reabsorção óssea osteoclástica excede o osso formando a capacidade de osteoblastos2,3. Assim, a fim de desenvolver metas farmacêuticas para tratar distúrbios esqueléticos, tais como osteoporose, é fundamental para compreender a geração e a biologia dos osteoclastos4.

Osteoclastos são únicas células multinucleadas gigantes localizadas em ou perto da superfície do osso e pertencem à família de monócitos/macrófagos1. Ibbotson K. J. et al. relatou um método para gerar células osteoclasto em vitro com meio contendo 1,25-diidroxi-vitamina D35. A identificação do fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) e ativador do receptor para o ligante de B fator nuclear-κ (RANKL) como fatores essenciais da formação do osteoclast aumentou drasticamente a eficiência do osteoclastogenesis em vitro 1 , 6 , 7. a capacidade de cultura osteoclastos em vitro melhorou a nossa compreensão da geração e regulação dos osteoclastos.

Mamíferos/mecanicista alvo de rapamicina (mTOR) funções em dois complexos estruturalmente e funcionalmente distintos, ou seja, mTORC1 e mTORC28,9. Os dois complexos de proteínas multi são distintos uns dos outros devido a seus diferentes componentes e substratos a jusante. mTORC1 contém a proteína reguladora associada exclusiva de mTOR (Raptor), enquanto mTORC2 contém o companheiro rapamicina diferenciação da mTOR (Rictor)9. mTORC1 pode integrar e transmitir sinais importantes que regulam crescimento celular, proliferação e diferenciação. Recentemente, temos demonstrado que mTORC1 desempenha um papel fundamental na rede de reabsorção óssea catabólica pela exclusão de Raptor para inactivar mTORC1 em osteoclastos10. No entanto, os mecanismos subjacentes exigem um estudo mais aprofundado. No presente estudo, um método baseado em RANKL osteoclastogenic foi usado para gerar os osteoclastos de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs) do selvagem-tipo (WT) e RapCtsk ratos e estudar a influência de inativação de mTORC1 no osteoclasto formação.

Protocol

Todos os procedimentos relativos aos animais foram realizados de acordo com o protocolo aprovado pelo painel administrativo de Stanford no laboratório Animal conta (APLAC) e foram aprovados pelo Comitê de uso do Instituto de bioquímica de Shanghai e célula e cuidado Animal Biologia. 1. preparação Gerar osteoclast específico Raptor exclusão ratos (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, outra vida RapCtsk) pelo acasalamento Raptor<s…

Representative Results

Utilizando o presente protocolo, um grande número de osteoclastos gigantes foram visto no dia 6; se osteoclastos gigantes não são vistos, mais um dia de diferenciação osteoclast pode ser necessário (Figura 1). Formação osteoclast sucesso foi confirmada pela armadilha de coloração (Figura 2A). Os osteoclastos foram células gigantes de vinho vermelho/roxo com mais de 3 núcleos. Mais de 250 osteoclastos foram obtidos em …

Discussion

O ensaio de osteoclastogenic é o método mais utilizado para isolar e cultura osteoclastos em vitro12,13. Enquanto várias induções baseadas em RANKL osteoclast têm sido descritos13,14,15, o presente estudo descreveu um protocolo com algumas modificações com base em métodos anteriores.

No estudo anterior, BMMs foram chapeamento…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores Obrigado Dr. Minghan Tong e S. Kato para ratos e gentilmente fornecendo reagentes. Agradecemos os membros do laboratório Zou para debates úteis. Este trabalho foi financiado em parte por subvenções de 973 programa do ministério chinês da ciência e tecnologia (a maioria) [2014CB964704 e 2015CB964503], programa de pesquisa clínica do Hospital do povo 9, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Obrigado pela ajuda de instalação de núcleo de biologia celular e facilidade do núcleo para a biologia química, CAS centro de excelência em Molecular célula ciência, Shanghai Instituto de Bioquímica e biologia celular, Academia Chinesa de Ciências.

Materials

Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

References

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Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

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