Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولا لعزل والثقافة الآكلة في المختبر من الماوس نخاع العظام، ودراسة دور هدف ربمسن 1 المعقدة في تشكيل اوستيوكلاست/آليا إلى الثدييات.

Abstract

الآكلة فريدة من نوعها في ريسوربينج العظام الخلايا التي تميز من نسب الوحيدات/بلعم نخاع العظام. قد يؤدي إلى اختلال وظيفي للأكلة سلسلة من الأمراض الأيضية العظام، بما في ذلك مرض هشاشة العظام. على وضع أهداف الصيدلية لمنع فقدان كتلة العظم المرضية، يجب أن يكون مفهوما أن الآليات التي تميز الآكلة من السلائف. القدرة على عزل والثقافة عددا كبيرا من الآكلة في المختبر أمر بالغ الأهمية من أجل تحديد دور جينات محددة في تمايز اوستيوكلاست. يمكن إنقاص عدد اوستيوكلاست المنظمة المستهدفة/آليا إلى الثدييات من ربمسن 1 معقدة (TORC1) في الآكلة وزيادة كتلة العظام؛ غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. ويرد في هذه الدراسة، بروتوكول المستندة إلى رانكل لعزل والثقافة الآكلة من نخاع العظام الماوس ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 على تشكيل اوستيوكلاست. وأسفر هذا البروتوكول بنجاح عدد كبير من الآكلة العملاقة، عادة خلال أسبوع واحد. ضعف تشكيل اوستيوكلاست حذف رابتور وتناقص نشاط الافرازية الفوسفاتيز الحمضي طرطرات المقاوم، مشيراً إلى أن mTORC1 أمر حاسم لتشكيل اوستيوكلاست.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

العظم هو هيئة دائمة التغير ويتم تشكيلها بواسطة خلايا الاوستيوبلاستس والأكلة طوال الحياة. الآكلة المسؤولة عن ارتشاف مصفوفة غضاريف وخلايا الاوستيوبلاستس توليف وتفرز مصفوفات العظام الجديدة1. التوازن بين ارتشاف العظام وتكوين العظام حاسم بالنسبة لصحة العظام بما في ذلك الحفاظ على العظام الجماهيري والاستجابة للتحفيز والإصابة. إذا تعطل هذا التوازن، قد تحدث سلسلة من أمراض العظام الأيضية، بما في ذلك مرض هشاشة العظام وأمراض اللثة. في هذه الأمراض، ويتجاوز فقدان كتلة العظام الناتجة عن ارتشاف العظام أوستيوكلاستيك العظام تشكيل قدرة خلايا الاوستيوبلاستس2،3. وهكذا، من أجل تطوير أهداف الأدوية لعلاج أمراض الهيكل العظمى مثل هشاشة العظام، أنها حاسمة لفهم جيل وعلم الأحياء من الآكلة4.

الآكلة هي خلايا مولتينوكليتيد العملاقة فريد من نوعه يقع في أو بالقرب من سطح العظام، وتنتمي إلى الأسرة بلعم الوحيدات/1. ج. ك. Ibbotson et al. وذكرت وسيلة لتوليد اوستيوكلاست-مثل الخلايا في المختبر مع المتوسطة التي تحتوي على 1, 25-ديهيدروكسي-فيتامين D35. تحديد عامل تحفيز مستعمرة بلعم (م-CSF) والمنشط مستقبلات ليجند ب النووية عامل-κ (رانكل) كعوامل أساسية في تشكيل اوستيوكلاست زاد زيادة كبيرة كفاءة أوستيوكلاستوجينيسيس في المختبر 1 , 6 , 7-القدرة على ثقافة الآكلة في المختبر قد تحسن فهمنا لتوليد وتنظيم الآكلة.

الهدف/آليا إلى الثدييات الوظائف ربمسن (mTOR) في اثنين من المجمعات المتميزة هيكلياً ووظيفيا، وهما mTORC1 و mTORC28،9. مجمعين البروتين المتعددة متميزة عن بعضها البعض بسبب مكوناتها المختلفة وركائز المتلقين للمعلومات. mTORC1 يحتوي على بروتين التنظيمية المرتبطة فريدة من mTOR (رابتور)، بينما يحتوي mTORC2 على رفيق ربمسن غير متحسسة من mTOR (Rictor)9. ويمكنك دمج mTORC1 وإرسال إشارات هامة لتنظيم نمو الخلايا وانتشارها والتمايز. في الآونة الأخيرة، أثبتنا أن mTORC1 دوراً رئيسيا في الشبكة لارتشاف العظم تقويضي بحذف رابتور لإلغاء تنشيط mTORC1 في الآكلة10. غير أن الآليات الأساسية التي تتطلب المزيد من الدراسة. في هذه الدراسة، استخدمت أسلوب المستندة إلى رانكل أوستيوكلاستوجينيك لتوليد الآكلة من المشتقة من نخاع العظم الضامة (بنغلادش) البرية من نوع (WT) والفئران الرابكتسك ، ودراسة تأثير المنظمة mTORC1 في اوستيوكلاست تشكيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع الإجراءات المتصلة بالحيوانات أجريت وفقا للبروتوكول الذي وافق عليه "الفريق الإداري ستانفورد" في العناية بالحيوانات المختبرية (أبلاك) ووافقت عليها بالعناية بالحيوان واستخدام اللجنة لمعهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وخلية علم الأحياء.

1-إعداد

  1. توليد اوستيوكلاست محددة رابتور الحذف الفئران (رابتورfl/فلوريدا؛ كتسك-لجنة المساواة العرقية، الآخرة الرابكتسك) قبل التزاوج فئران رابتورfl/fl مع الفئران كتسك-لجنة المساواة العرقية . استخدام الفئران رابتورfl/fl كعنصر التحكم بالوزن في هذه الدراسة.
  2. تحتوي حاوية مع الجليد للحفاظ على العظام معزولة.
  3. تعد الثقافة المتوسطة.
    1. إعداد متوسطة الثقافة α-الفنزويلية باستكمال الحد الأدنى المتوسط أساسي ألفا (α-MEM) مع البنسلين والستربتوميسين، 1 x الجلوتامين ومصل العجل الجنين 10%.
    2. إعداد نخاع العظام بلعم التعريفي المتوسط تتألف من 50 مل المتوسطة α-الفنزويلية والخدمات القطرية م في 20 نانوغرام/مليلتر.
    3. إعداد اوستيوكلاست التعريفي المتوسط تتألف من M-CSF ورانكل في 20 نانوغرام/ملليلتر، على التوالي، في 50 مل متوسطة α-الفنزويلية.
  4. إعداد المخازن المؤقتة التالية قبل تلطيخ فخ.
    1. إعداد حل تتكون من 6.5 مل الأسيتون، 2.5 مل من سترات الحل و 0.8 مل من محلول الفورمالديهايد (المجلد/المجلد) 37 في المائة.
    2. إعداد فخ تلطيخ الحل.
      1. بريوارم المياه إلى 37 درجة مئوية.
      2. إضافة 100 ميليلتر العقيق سريع GBC قاعدة الحل و 100 ميليلتر من حل نتريت الصوديوم في microtube 1.5 مل ومزيج من انعكاس لطيف لإجازة س. 30 المخلوط الوقوف لمدة دقيقة 2.
      3. بريوارم 9 مل مياه إلى 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر ديازوتيزيد سريعة العقيق GBC الحل الأساسي من الخطوة 1.4.2.2، 100 ميليلتر نافثول AS-ثنائي فوسفات الحل و 400 ميليلتر من حل خلات 200 ميليلتر من طرطرات الحل.
      4. تبقى في فخ تلطيخ حل الخليط في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  5. إعداد المخزن المؤقت التالية قبل مصيدة النشاط الكمي للثقافة المتوسطة.
    1. إعداد طرطرات المخزن المؤقت (50 مل): 2 مل حمض الطرطير ل م 0.33، مل 48 من طرطرات الصوديوم 0.33 متر مائي يذوي. قم بضبط قيمة pH إلى 4.9.
    2. تحضير 4-نيتروفينيل فوسفات ثنائي الصوديوم (بنب) المخزن المؤقت (200 مل): 1.502 ز جليكاين، 41 ملغ مجكل2و 27.2 ملليغرام من زنكل2و 180 مل من المياه. ضبط قيمة pH إلى 10.4 مع 3 م هيدروكسيد الصوديوم والحجم إلى 200 مل مع المياه.
    3. إعداد المخزن المؤقت بنب مع الركازة الفوسفاتيز (للوحة 96-بئر واحدة): 49.37 مغ من الركازة الفوسفاتيز وميليلتر 175 من المخزن المؤقت بنب الخطوة 1.5.2.
    4. تعد الركيزة المخزن المؤقت (9 مل/96-بئر لوحة): 6.24 مل من المياه، ميكروليتر 360 من خلات الحل، و 2.4 مل طرطرات المخزن المؤقت. مزيج من دوامة ويسخن عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    5. إضافة ميكروليتر 90 من المخزن المؤقت بنب مع الفوسفاتيز substrate(1.5.3) إلى 9 مل من الركازة مسخن buffer(1.5.4) لجعل الخليط الركيزة ودوامه لمدة 10 ق.

2-تشريح (اليوم-1)

  1. Euthanize 3 واحد شهرا الإناث WT و الرابكتسك الفئران CO2 بشكل منفصل. أداء استنشاق أول أكسيد الكربون2 مع المعدات المناسبة من الموظفين المدربين.
  2. تزج الفئران 6 في كوب مع 100 مل من 75 ٪ الإيثانول (المجلد/المجلد) لمدة 5 دقائق منع التلوث البكتيري ومن ثم ضع على لوح تشريح في موقف ضعيف. إجراء شق في الأعلى من الساق عمودياً وتشريح الجلد على طول أطرافهم هند مع مقص العيون.
  3. قطع في الرباط المفصلي الورك مع المقص وانخلاع أطرافه هند من الجذع.
  4. قطع في الرباط مفصلي الركبة وتنأى بعناية في الساق والفخذ من الركبة. إزالة الأنسجة اللينة بلطف مع المقص.
  5. ضع كل العظام الوراثي واحد في واحد بالماوس في كل من صفيحة ستة آبار جيدا مع 2 مل من α-الفنزويلية على الجليد.
    ملاحظة: للحفاظ على بقاء الخلية، ينبغي إبقاء العظام في هذه الظروف لأقل من 1 ح.

3-عزل (اليوم-1)

  1. سد بئر واحدة من صفيحة ستة-جيدا مع 75% إيثانول (3 مل) والآبار الأخرى 5 مع α-الفنزويلية المتوسطة (3 مل).
  2. وضع جميع عظام الوراثي واحد في الغسيل الإيثانول للعظام 15 ق ويغسل 5 مرات مع المتوسطة α-الفنزويلية لمدة 10 ثانية في كل مرة.
  3. قطع ابيفيسيس مع مقص وإدراج إبرة حقنه 0.45 ملم في تجويف وتدفق نخاع العظام خارجاً مع المتوسطة α-الفنزويلية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي.
  4. مسح تجويف العظام باستخدام نفس الأسلوب من الطرف الآخر من العظام. كرر مرتين على الأقل يغسل تجويف العظام جيدا حتى العظم شاحب.
  5. الطرد المركزي نخاع العظام للحصول على بيليه خلية في 800 x ز و 4 درجات مئوية عن أدنى 5 Aspirate المادة طافية.
  6. أضف 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء في أنبوب الطرد المركزي وماصة بلطف ريسوسبيند نخاع العظام. الاحتفاظ بالانبوب الطرد المركزي على الجليد لمدة 8 دقائق خلايا الدم الحمراء.
  7. إضافة 6 مل متوسطة α-الفنزويلية في أنبوب الطرد المركزي لإيقاف تحلل الخلية. الطرد المركزي في 500 x ز و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ونضح المادة طافية.
  8. ريسوسبيند في 3 مل من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة ووضع الخلايا في لوحة ستة آبار (ماوس واحدة عموما كل بئر).
  9. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% بين عشية وضحاها.

4-الطلاء (يوم 0)

  1. نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل لجمع الخلايا فاتحة في صباح اليوم التالي.
  2. الطرد المركزي في 800 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.
  3. ريسوسبيند في 4 مل من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة.
  4. تأخذ 20 ميليلتر من الحل خلية وتخلط مع 20 ميليلتر تريبان الأزرق. إضافة 10 ميليلتر من المخلوط إلى قاعة فرز الأصوات والحصول على عدد خلايا كل مل من محلول.
  5. إضافة وحدة تخزين مناسبة من α-الفنزويلية الثقافة المتوسطة للحصول على حل خلية من خلايا/مل 500,000.
  6. إضافة 500 ميليلتر و 50 ميليلتر من نخاع العظام بلعم التعريفي المتوسطة في كل بئر لوحة 24-جيدا ولوحة 96، حسنا، على التوالي.
  7. إضافة 500 ميليلتر و 50 ميليلتر من حل الخلية في كل بئر لوحة 24-جيدا ولوحة 96، حسنا، على التوالي.
  8. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5% لمدة 3 أيام.

5-التمايز (3-7 أيام)

  1. ثلاثة أيام بعد الطلاء، جمع 50 ميليلتر المتوسطة من كل بئر من 96-جيدا--اللوحة وتجميد في-20 درجة مئوية، وثم نضح المتوسطة المتبقية.
  2. أضف 1 مل و 100 ميليلتر اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة في كل بئر من صفيحة 24-جيدا وطبق 96، حسنا، على التوالي.
  3. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة يومين.
  4. جمع 50 ميليلتر من المتوسطة من كل بئر ونضح المتوسطة المتبقية.
  5. إضافة اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة في كل بئر.
  6. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
    ملاحظة: عند هذه النقطة من الوقت، ينبغي أن ينظر الآكلة الكبيرة، مولتينوكليتيد تحت مجهر مقلوب (الشكل 2A).
  7. إذا لم تعتبر الآكلة، تغيير المتوسطة التعريفي اوستيوكلاست ومراقبة يومية حتى تعتبر الآكلة.
  8. جمع 50 ميليلتر من المتوسطة من كل بئر من لوحة 96-جيدا بعد أن شكلت الآكلة.

6-طرطرات تلطيخ مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP)

ملاحظة: قد تكون الآكلة ناضجة موجودة بعد 6-7 أيام في المختبر الثقافة (الخطوة 4).

  1. نضح متوسطة ويغسل 3 مرات بلطف مع 1 x PBS.
  2. إصلاح الخلايا في كل من لوحة 96-جيدا جيدا مع 100 ميليلتر من حل لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد التثبيت، نضح في الحل وتغسل بلطف 3 مرات بالمياه بريوارميد إلى 37 درجة مئوية. نضح المياه.
  4. إضافة 100 ميليلتر من فخ وصمة عار في كل من لوحة 96-جيدا جيدا ووضع اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 30 دقيقة ودرع من الضوء.
  5. بعد تلطيخ، نضح وصمة عار فخ واغسل 3 مرات بلطف مع المياه.
  6. صورة الآكلة استخدام مجهر مقلوب في 40 X التكبير.

7-فخ النشاط الكمي للثقافة المتوسطة

  1. جمع 30 ميليلتر الثقافة طافية من كل بئر من لوحة 96-جيدا من الخطوة 5-1، 5.4 و 5.8؛ استخدام 30 ميليلتر من غير مثقف اوستيوكلاست التعريفي المتوسطة كعنصر سلبي. وضع العينات في صفيحة 96-بئر جديدة.
  2. إضافة ميكروليتر 90 من الركازة mixture(1.5.5) في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.
  3. ضع اللوحة في حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1 ودرع من الضوء.
  4. وقف رد الفعل بإضافة 50 ميليلتر من هيدروكسيد الصوديوم م 3 في كل من لوحة 96-جيدا جيدا.
  5. قياس ثيبسوربانسي في الطول الموجي 405 نانومتر.

8-الغربية النشاف

ملاحظة: بعد 6-7 أيام للثقافة في المختبر في لوحة 24-جيدا، يجب أن تكون الآكلة ناضجة مرئية.

  1. نضح المتوسطة.
  2. قبل تبريده يغسل برفق مع 1 × برنامج تلفزيوني 3 مرات.
  3. نضح PBS.
  4. إضافة 100 ميليلتر من 1 × الحزب الديمقراطي الصربي تحلل العازلة التي تحتوي على مبطلات المانع كوكتيل.
  5. ليساتيس الحرارة عند 105 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وأجهزة الطرد المركزي في 000 12 × ز و 4 درجات مئوية للحد الأدنى 10 جمع سوبيرناتانتس التي تحتوي على بروتينات.
  6. فصل في ليساتيس الذي يحتوي على 30 ميكروغرام من البروتين بنسبة 10 في المائة الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة11 وثم نقل إلى غشاء فلوريد (PVDF) الفينيليدن.
  7. كتلة الأغشية مع الحليب الخالي 5% لمدة 30 دقيقة.
  8. احتضان الأغشية مع رابتور المضادة، المضادة-P-S6، S6 مكافحة، مكافحة-β-أكتين في إضعاف 1:1,000 في اللبن الخالي 5% في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  9. غسل الأغشية مع "تريس مخزنة المالحة" مع توين-20 (تبسة) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  10. كرر الخطوة 8.9 مرتين.
  11. احتضان الأغشية مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-مترافق الأجسام المضادة مفتش الماوس المضادة أو أرنب في إضعاف 1:5,000 في 5% لبن الخالي من أجل ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  12. غسل الأغشية 3 مرات مع تبسة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  13. للكشف عن تشيميلومينيسسينت، إضافة الركازة HRP تشيميلومينيسسينت الغربية في الأغشية واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف الركيزة الزائدة وفضح البقع لفيلم الأشعة السينية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

باستخدام هذا البروتوكول، شوهدت عدد كبير من الآكلة العملاقة في يوم 6؛ إذا لم تعتبر الآكلة العملاقة، قد يكون يوم واحد للتمايز اوستيوكلاست اللازمة (الشكل 1). وأكد تشكيل اوستيوكلاست نجاح مصيدة تلطيخ (الشكل 2A). وكانت الآكلة العملاقة من الخلايا النبيذ الأحمر/الأرجواني مع أنوية أكثر من 3. وتم الحصول على أكثر من 250 الآكلة في كل بئر من لوحة 96-جيدا في بنغلادش WT (الشكل 4 أ).

حذف رابتور وأكد تحليل النشاف الغربية وتقرر المنظمة mTORC1 بانخفاض الفسفرة ريبوسومال البروتين S6 (ف-S6)، الذي يستخدم على نطاق واسع قراءات ل mTORC1 (الشكل 3).

انخفض عدد الآكلة فخ-الإيجابية في بنغلادش الرابكتسك مقارنة مع مجموعة WT (الشكل 4 أ)، التي أشارت إلى أن نقص رابتور البصر تشكيل اوستيوكلاست.

نشاط افرازي فخ مهم لارتشاف العظام، وقد تم تحليل النشاط فخ في الأجلين المتوسط والثقافة في هذه الدراسة. كما هو موضح في الشكل 4 باء، زاد النشاط فخ نظراً لحفز رانكل في وزن وبنغلادش الرابكتسك . وبالإضافة إلى ذلك، انخفض نشاط فخ في بنغلادش الرابكتسكمقارنة مع مجموعة WT المقابلة (ف < 0.05).

Figure 1
رقم 1: رسم تخطيطي للبروتوكول التعريفي اوستيوكلاست- كانت معزولة في يوم 1 بنغلادش والمحتضنة مع α-الفنزويلية الأساسية المتوسطة بين عشية وضحاها. في اليوم 0، تم جمع بنغلادش ومطلي على لوحة 96-جيدا، ولوحة 24-جيدا متبوعاً بالحضانة في المتوسط α-الفنزويلية مع 10 نانوغرام/مل م-قوات الأمن المركزي. في يوم 3، تم تغيير المتوسطة إلى المتوسطة α-الفنزويلية مع 20 نانوغرام/مل م-CSF و 20 نانوغرام/مليلتر رانكل لتحريض تمايز اوستيوكلاست. في يوم 5، تم تغيير وسيلة تمايز اوستيوكلاست. في يوم 6، عدد كبير من الآكلة كانت واضحة وتم إجراء فحوصات اوستيوكلاست. إذا كانت خلايا الاوستيوبلاستس لم تكن مرئية، تم تغيير وسيلة التعريفي اوستيوكلاست وحضانة استمر ليوم واحد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: عرض تمثيلي للأكلة. (A) العملاقة الآكلة لوحظت في الميدان مشرق في يوم 6. وأوجز الخط الأحمر حدود الآكلة. (ب) عادة العملاق، مولتينوكليتيد، فخ الإيجابية (النبيذ الأحمر) اوستيوكلاست. وأشارت إلى السهم الأسود هما نواة اوستيوكلاست مولتينوكليتيد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: mTORC1 المنظمة في بنغلادش الرابكتسك . الغربية النشاف تحليل التعبير رابتور وف-S6 S6 في وزن وبنغلادش الرابكتسك يوم 6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: حذف رابتور البصر تشكيل اوستيوكلاست- (أ) فخ تلطيخ من بنغلادش في اليوم 6. يتم عرض الصور عالية التكبير من المربعات في مجموعات WT و الرابكتسك ، على التوالي. وكانت هناك أقل فخ الآكلة إيجابية عملاقة، شكلت في بنغلادش الرابكتسك بالمقارنة مع مجموعة WT. النشاط (ب) مصيدة لمثقف WT و الرابكتسك تمثل بنغلادش. البيانات يعني ± ف S.D.* < 0.05، n = 3. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تحليل أوستيوكلاستوجينيك هو الأسلوب الأكثر استخداماً لعزل والثقافة الآكلة في المختبر12،13. بينما عدة على أساس رانكل اوستيوكلاست الحث قد وصف13،،من1415، وصف هذه الدراسة بروتوكولا مع بعض التعديلات استناداً إلى الأساليب السابقة.

في الدراسة السابقة، تم طلاء بنغلادش فورا بعد عزل14،15. ننصح بأن بنغلادش كانت مثقف مع الأساسية المتوسطة بين عشية وضحاها قبل الطلاء لعزل بنغلادش من الخلايا الجذعية الوسيطة والليفية التي تنضم فورا إلى الطبق. يمكن أن تعزز انتشار وحيدات للسلائف اوستيوكلاست M-CSF وحفز السلائف اوستيوكلاست للتعبير عن الرتبة التي تربط رانكل ويدفع ثم تشكيل الآكلة ناضجة6،،من1617. ولذلك، في دراستنا، بنغلادش كانت المستحث مع 10 نانوغرام/مل م-CSF لمدة 3 أيام قبل اوستيوكلاست التعريفي، بدلاً من ذلك لتحريض اوستيوكلاست اليوم الثاني بعد تصفيح15. كثافة الخلية أمر بالغ الأهمية لتشكيل اوستيوكلاست في المختبر. من المستحسن أن بنغلادش 25,000 كانت تبذر في كل بئر من بعد لوحة 96-جيدا بالحضانة 3 أيام مع 10 نانوغرام/مل م-قوات الأمن المركزي. عند التقاء الخلية بلغ 80 – 90%، وقت مناسب لتحريض اوستيوكلاست رانكل. الناضجة عادة، شكل الآكلة في يوم 6. السبب الأكثر شيوعاً للأكلة قليل هو كثافة الخلايا دون المستوى الأمثل، الذي يمكن أن يكون نتيجة لانخفاض كثافة البذر أو بقاء الخلية منخفضة. بنغلادش هي الخلايا الأولية الدقيقة، ويحتاج إلى أن يعامل بلطف. حفظ العظام على الجليد لفترة طويلة أو ريسوسبيندينج بقوة يقلل من الجدوى بنغلادش ويعوق تشكيل الآكلة في وقت لاحق. وهكذا، كثافة البذر الأمثل بنغلادش قابلة للحياة حاسمة بالنسبة للحصول على عدد كبير من الآكلة.

نشاط افرازي فخ أمر بالغ الأهمية لارتشاف العظم أوستيوكلاستيك. في هذه الدراسة، يصف لنا طريقة لتحليل كمي الافرازية مصيدة النشاط في الأجلين المتوسط والثقافة. يمكن أن يؤدي تغيير النشاط فخ في الأجلين المتوسط وثقافة من التغييرات في عدد اوستيوكلاست أو فخ الافرازية اوستيوكلاست أو مزيج من كليهما. وهكذا، قد يكون وسيلة مفيدة لتحليل اوستيوكلاست الدالة في المختبر جنبا إلى جنب مع المقايسة ارتشاف اوستيوكلاست الموصوفة سابقا18.

mTOR هو كيناز بروتين تقحم المحافظة التي يمكن أن تنظم خلية الأيض والتمايز9. في هذه الدراسة، وجدنا أن mTORC1 دوراً هاما في ارتشاف العظام التي تنظم تشكيل اوستيوكلاست. mTORC1 قد تكون هدفا محتملاً دوائية لعلاج الاضطرابات الأيضية العظام مثل هشاشة العظام في المستقبل.

وباختصار، لدينا بروتوكول لتحريض اوستيوكلاست أسفرت عن عدد كبير من الآكلة العملاقة في المختبر بنجاح والبيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن mTORC1 أمر حاسم لتشكيل اوستيوكلاست.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

جميع المؤلفون أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون الدكتور Minghan تونغ وكاتو س. يرجى توفير الكواشف والفئران. ونشكر أعضاء المختبر زو لإجراء مناقشات مفيدة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في المنح من 973 برنامج من الوزارة الصينية للعلوم والتكنولوجيا (معظم) [2014CB964704 و 2015CB964503]، "برنامج البحوث السريرية" لمستشفى الشعب التاسع، "شانغهاي جياو تونغ جامعة كلية الطب". شكرا لمساعدة "المرافق الأساسية" لبيولوجيا الخلايا والمرافق الأساسية "علم الأحياء الكيميائية"، والأكاديمية الصينية للعلوم في مركز للتفوق في مجال العلوم الخلية الجزيئية، معهد شانغهاي للكيمياء الحيوية وبيولوجيا الخلايا، الأكاديمية الصينية للعلوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
على أساس رانكل "اوستيوكلاست الثقافة المقايسة للماوس نخاع العظام" التحقيق في دور mTORC1 في "تشكيل اوستيوكلاست"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter