Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

En RANKL-baserede osteoklast kultur Assay af musen knoglemarven til at undersøge rollen, som mTORC1 i osteoklast dannelse

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver en protokol til at isolere og kultur osteoklaster in vitro- fra mus knoglemarven og studere rollen til pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin komplekse 1 i osteoklast dannelse.

Abstract

Osteoklaster er unikke ben-resorbing celler, der adskiller fra knoglemarven monocyt/makrofag slægt. Dysfunktion af osteoklasterne kan resultere i en serie af knogle metaboliske sygdomme, herunder osteoporose. For at udvikle farmaceutiske mål for forebyggelse af patologiske masse knogletab, skal de mekanismer, hvorved osteoklaster differentiere fra prækursorer forstås. Evnen til at isolere og kultur et stort antal af osteoklasterne i vitro er kritisk for at fastslå rollen af specifikke gener i osteoklast differentiering. Inaktivering af pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin komplekse 1 (TORC1) i osteoklaster kan mindske osteoklast antallet og øge knoglemasse; men de underliggende mekanismer kræver yderligere undersøgelse. I den foreliggende undersøgelse, er en RANKL-baseret protokol til at isolere og kultur osteoklaster fra mus knoglemarven og studere påvirkning af mTORC1 inaktivering på osteoklast dannelse beskrevet. Denne protokol resulterede med held i en lang række gigantiske osteoklaster, typisk inden for en uge. Sletning af Raptor nedsat osteoklast dannelse og nedsat aktivitet af sekretoriske tartrat-resistente sur fosfatase, der angiver, at mTORC1 er afgørende for osteoklast dannelse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bone er en skiftende orgel og er ombygget af osteoblaster og osteoklaster hele livet. Osteoklaster er ansvarlig for mineraliseret matrix resorption og osteoblaster syntetiserer og udskiller ny knogle matricer1. Balance mellem knogleresorption og knogledannelse er afgørende for knogle sundhed herunder vedligeholdelse af knogle masse og respons på stimulation og skade. Hvis denne balance forstyrres, kan en serie af metaboliske knoglesygdomme forekomme, herunder osteoporose og parodontale sygdomme. I disse sygdomme overstiger knogle masse tab som følge af osteoclastic knogleresorption knogledannende kapacitet af osteoblaster2,3. For at udvikle farmaceutiske mål for at behandle skelet lidelser, såsom osteoporose, er det således afgørende at forstå generation og biologi af osteoklasterne4.

Osteoklaster er unikke giant multinucleated celler beliggende på eller i nærheden af knoglen overfladen, og tilhører monocyt/makrofag familien1. Ibbotson K. J. et al. rapporteret en metode til at generere osteoklast-lignende celler in vitro- med medium indeholdende 1,25-dihydroxy-vitamin D35. Identifikation af makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator for nuklear factor-κ B ligand (RANKL) som afgørende faktorer for osteoklast dannelse har dramatisk øget effektivitet af osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. muligheden for at kultur osteoklaster in vitro- har forbedret vores forståelse af generation og regulering af osteoklasterne.

Pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin (mTOR) funktioner i to strukturelt og funktionelt adskilte komplekser, nemlig mTORC1 og mTORC28,9. De to multi protein komplekser er adskilt fra hinanden på grund af deres forskellige komponenter og downstream substrater. mTORC1 indeholder den unikke regulerende forbundet protein af mTOR (Raptor), mens mTORC2 indeholder rapamycin-ufølsom følgesvend mTOR (Rictor)9. mTORC1 kan integrere og sender vigtige signaler til regulerer cellevækst, spredning og differentiering. For nylig, viste vi, at mTORC1 spiller en central rolle i netværket af kataboliske knogleresorption ved sletning af Raptor til at inaktivere mTORC1 i osteoklaster10. Men de underliggende mekanismer kræver yderligere undersøgelse. I den foreliggende undersøgelse, blev en RANKL-baserede osteoclastogenic metode brugt til at generere osteoklaster fra knoglemarv-afledte makrofager (BMMs) af wild-type (WT) og RapCtsk mus og studere påvirkning af mTORC1 inaktivering på osteoklast dannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle procedurer vedrørende dyr blev udført i henhold til protokollen, godkendt af Stanford Administrative Panel på Laboratory Animal Care (APLAC) og blev godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Shanghai Institut for biokemi og celle Biologi.

1. forberedelse

  1. Generere osteoklast specifikke Raptor sletning mus (Raptorfl/fl; Ctsk-cre, herefter RapCtsk) af parring Raptorfl/fl mus med Ctsk-cre mus. Bruge Raptorfl/fl mus som kontrolelementet WT i denne undersøgelse.
  2. Har en container med is til at holde isolerede knogle.
  3. Forberede næringssubstratet.
    1. Forberede α-MEM dyrkningsmediet ved at supplere minimum afgørende medium alpha (α-MEM) med 1 x glutamin, penicillin-streptomycin og 10% føtalt kalveserum.
    2. Forberede knoglemarv makrofag induktion medium bestående af 50 mL af α-MEM medium og M-CSF på 20 ng/mL.
    3. Forberede osteoklast induktion medium bestående af M-CSF og RANKL på 20 ng/mL, henholdsvis, i 50 mL af α-MEM medium.
  4. Forbered de følgende buffere før FÆLDEN farvning.
    1. Forberede løsning bestående af 6,5 mL acetone, 2,5 mL citratopløsning og 0,8 mL 37% (vol/vol) formaldehyd løsning.
    2. Forberede FÆLDE farvning løsning.
      1. Prewarm ionbyttet vand til 37 ° C.
      2. Tilsæt 100 µL af hurtigt granat GBC basisløsningen og 100 µL af natrium nitrit løsning i en 1,5 mL microtube og mix af blid inversion for 30 s. Lad blandingen henstår i 2 min.
      3. Prewarm 9 mL deioniseret vand til 37 ° C. Tilføje 200 µL af diazotized hurtigt granat GBC basisløsningen fra trin 1.4.2.2, 100 µL af naphthol AS-BI fosfat løsning, 400 µL af acetat løsning og 200 µL af tartrat løsning.
      4. Holde FÆLDEN farvning blanding løsning i et vandbad ved 37 ° C.
  5. Forberede følgende bufferen før FÆLDEN aktivitet kvantificering af næringssubstratet.
    1. Forberede tartrat buffer (50 mL): 2 mL af 0,33 M L-vinsyre, 48 mL 0,33 M natrium tartrat dibasiske dehydrere. Juster pH-værdien til 4,9.
    2. Forbered 4-nitrophenylfosfat fosfat dinatrium (pNPP) buffer (200 mL): 1.502 g af glycin, 41 mg af MgCl2, 27,2 mg af ZnCl2og 180 mL deioniseret vand. Juster pH-værdien til 10.4 med 3 M NaOH og volumen til 200 mL med deioniseret vand.
    3. Forberede pNPP buffer med fosfatase substrat (for en 96-brønd plade): 49.37 mg af fosfatase substrat og 175 µL af pNPP buffer på trin 1.5.2.
    4. Forberede substratbuffer (9 mL/96-brønd plade): 6.24 mL deioniseret vand, 360 μL af acetat løsning, og 2,4 mL tartrat buffer. Mix af vortex og Forvarm ved 37 ° C før brug.
    5. Tilføje 90 μL pNPP buffer med fosfatase substrate(1.5.3) til 9ml af forvarmet substrat buffer(1.5.4) at gøre et substrat blanding og vortex for 10 s.

2. dissektion (dag -1)

  1. Aflive 3 one-måned-forhenværende kvindelig WT og RapCtsk mus af CO2 separat. Udføre CO2 inhalation med passende udstyr af uddannet personale.
  2. Fordyb 6 mus i et baegerglas sammen med 100 mL 75% ethanol (vol/vol) for 5 min at forhindre bakteriel forurening og derefter placere på en dissektion bord i en liggende stilling. Gøre et snit på den distale af tibia lodret og dissekere huden langs hind lemmer med oftalmologiske saks.
  3. Skære artikulær ledbånd i hofteleddet med saks og splitte hind lemmer fra stammen.
  4. Skære artikulær ledbånd i knæleddet og forsigtigt fjerne tilknytningen af skinnebenet og lårbenet fra knæleddet. Fjern forsigtigt det bløde væv med en saks.
  5. Placere alle knogler af en genotype i en mus i hvert hul i en seks-godt-plade med 2 mL af α-MEM på is.
    Bemærk: For at bevare cellernes levedygtighed, knoglen bør holdes i disse betingelser for mindre end 1 time.

3. isolering (dag -1)

  1. Fyld et godt for en six-godt plade med 75% ethanol (3 mL) og andre 5 brøndene med α-MEM medium (3 mL).
  2. Sætte alle knogler af en genotype i ethanol vask for 15 s og vask knogler 5 gange med α-MEM medium for 10 s hver gang.
  3. Afbrød epifyser med en saks og indsætte en 0,45-mm sprøjte nål i hulrum og flush knoglemarven ud med α-MEM medium i et 50 mL-centrifugerør.
  4. Skyl knogle hulrummet efter samme metode fra anden enden af knoglen. Gentag mindst to gange for at vaske knogle hulrum grundigt, før knoglen er bleg.
  5. Der centrifugeres knoglemarv for at opnå en celle pellet ved 800 x g og 4 ° C i 5 min. aspirat supernatanten.
  6. Tilføj 3 mL af røde blodlegemer lysisbuffer ind i centrifugeglasset og pipette forsigtigt til resuspend knoglemarven. Holde centrifugeglas på is til 8 min til lyse røde blodlegemer.
  7. Tilføj 6 mL af α-MEM medium i centrifugeglasset at stoppe celle lysering. Der centrifugeres ved 500 x g og 4 ° C i 10 min og Opsug supernatanten.
  8. Resuspend i 3 mL af α-MEM næringssubstratet og placere celler i en seks-godt plade (normalt en mus pr. brønd).
  9. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator natten over.

4. plating (dag 0)

  1. Overføre supernatanten til en 15 mL centrifugeglas at indsamle de separate celler næste morgen.
  2. Der centrifugeres ved 800 x g og 4 ° C i 5 min og Opsug supernatanten.
  3. Resuspend i 4 mL af α-MEM næringssubstratet.
  4. Tage 20 µL af opløsningen celle og blandes med 20 µL af Trypan blå. Tilføje 10 µL af blandingen til optælling kammer og opnå celletal pr. mL opløsning.
  5. Tilsættes en passende mængde af α-MEM næringssubstratet at opnå en celle løsning af 500.000 celler/mL.
  6. Tilføje 500 µL og 50 µL af knoglemarven makrofag induktion medium til hver brønd med en 24-godt og 96-brønd plader, henholdsvis.
  7. Tilsæt 500 µL og 50 µL af celle løsning i hver brønd med en 24-godt og 96-brønd plader, henholdsvis.
  8. Der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 3 dage.

5. differentiering (dag 3-7)

  1. Tre dage efter plating, indsamle 50 µL medium fra hver brønd af 96-brønd-plade og fryse ved-20 ° C, og derefter Opsug den resterende medium.
  2. Tilsæt 1 mL og 100 µL osteoklast induktion medium til hver brønd med en 24-godt og en 96-brønd plader.
  3. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 dage.
  4. Indsamle 50 µL af medium fra hver brønd og Opsug den resterende medium.
  5. Tilføje osteoklast induktion medium til hver brønd.
  6. Der inkuberes ved 37 ° C i 1 dag.
    Bemærk: På dette tidspunkt, store, multinucleated osteoklaster bør ses i en inverteret mikroskop (figur 2A).
  7. Hvis osteoklaster ikke ses, ændre osteoklast induktion medium og iagttage dagligt indtil osteoklaster ses.
  8. Indsamle 50 µL af medium fra hver brønd af 96-brønd plade efter osteoklaster har dannet.

6. tartrat resistente sur fosfatase (FÆLDE) farvning

Bemærk: Modne osteoklaster kan være til stede efter 6-7 dage af in vitro- kultur (trin 4).

  1. Opsug medium og vask forsigtigt 3 gange med 1 x PBS.
  2. Fastsætte cellerne i hvert hul i 96-brønd plade med 100 µL af løsning til 30 s ved stuetemperatur.
  3. Efter fiksering, Opsug løsningen og vask forsigtigt 3 gange med deioniseret vand forvarmet til 37 ° C. Opsug deioniseret vand.
  4. Tilsæt 100 µL af TRAP pletten i hver brønd i 96-brønd-pladen, og pladen anbringes i en inkubator ved 37 ° C i 30 min og skjold fra lys.
  5. Efter farvning, Aspirér FÆLDE pletten og forsigtigt vask 3 gange med deioniseret vand.
  6. Billede osteoklaster ved hjælp af en omvendt mikroskop på 40 X forstørrelse.

7. TRAP aktivitet kvantificering af næringssubstratet

  1. Saml 30 µL kultur supernatanten fra hver brønd i 96-brønd-pladen fra trin 5.1 og 5.4 5.8; Bruge 30 µL af ikke-kulturperler osteoklast induktion medium som den negative kontrol. Placer prøverne i en ny 96-brønd plade.
  2. Tilføje 90 μL af substrat mixture(1.5.5) i hver brønd i 96-brønd-pladen.
  3. Pladen anbringes i en inkubator ved 37 ° C for 1t og skjold fra lys.
  4. Reaktionen standses ved at tilføje 50 µL af 3 M NaOH i hver brønd i 96-brønd-pladen.
  5. Måling af theabsorbance ved en bølgelængde på 405 nm.

8. Western Blotting

Bemærk: Efter 6-7 dage af in vitro- kultur i 24-godt plade, skal modne osteoklaster være synlige.

  1. Opsug mediet.
  2. Vask forsigtigt med afkølet pre 1 x PBS 3 gange.
  3. Opsug PBS.
  4. Tilsæt 100 µL 1 x SDS lysis buffer indeholdende protease hæmmer cocktail.
  5. Varme lysates ved 105 ° C i 10 min og centrifuger på 12.000 × g og 4 ° C i 10 min. indsamle analysere indeholdende proteiner.
  6. Adskille de lysates, der indeholder 30 µg protein af 10% SDS-PAGE11 og derefter overføre til en polyvinylidene fluorid (PVDF) membran.
  7. Blokere membraner med 5% nonfat mælk i 30 min.
  8. Inkuber membraner med anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-actin på 1:1,000 fortynding i 5% nonfat mælk ved 4 ° C natten over.
  9. Vask membraner med Tris bufferet saltvand med Tween-20 (TBST) i 10 min ved stuetemperatur.
  10. Gentag trin 8,9 to gange.
  11. Inkuber membraner med peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret anti-mus eller kanin IgG antistoffer på 1:5,000 fortynding i 5% nonfat mælk i 1 time ved stuetemperatur.
  12. Vask membranerne 3 gange med TBST i 10 min ved stuetemperatur.
  13. Til kemiluminescens påvisning, tilføje vestlige kemiluminescens HRP substrat på membraner og Inkuber i 5 min ved stuetemperatur. Dræne det overskydende substrat og udsætte blots til X-ray film.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ved hjælp af denne protokol, blev et stort antal kæmpe osteoklaster set på dag 6; Hvis kæmpe osteoklaster ikke ses, en dag af osteoklast differentiering kan være nødvendig (figur 1). Vellykket osteoklast dannelse blev bekræftet af TRAP farvning (figur 2A). Osteoklaster var kæmpe vin rød/lilla celler med mere end 3 kerner. Mere end 250 osteoklaster blev opnået i hver brønd i 96-brønd plade i WT BMMs (figur 4A).

Sletning af Raptor blev bekræftet af western blotting analyse og inaktivering af mTORC1 var bestemt ved et fald i ribosomale protein S6 fosforylering (P-S6), som er meget udbredt som udlæsningen til mTORC1 (figur 3).

Antallet af TRAP-positive osteoklaster faldt i RapCtsk BMMs sammenlignet med gruppen WT (figur 4A), hvoraf det fremgik, at Raptor mangel nedsat osteoklast dannelse.

Aktiviteten af sekretoriske FÆLDE er vigtigt for knogleresorption, og FÆLDEN aktivitet i dyrkningsmediet blev analyseret i den foreliggende undersøgelse. Som vist i figur 4B, FÆLDE aktivitet øget på grund af stimulation af RANKL i både WT og RapCtsk BMMs. Derudover FÆLDE aktivitet faldt i RapCtskBMMs sammenlignet med tilsvarende WT-gruppen (P < 0,05).

Figure 1
Figur 1: skematisk diagram over osteoklast induktion protokol. BMMs blev isoleret på dag 1 og inkuberes med grundlæggende α-MEM medium natten over. På dag 0, blev BMMs indsamlet og belagt på en 96-brønd og 24-godt plader efterfulgt af inkubation i α-MEM medium med 10 ng/mL M-CSF. På dag 3, blev mediet ændret til α-MEM medium med 20 ng/mL M-CSF og 20 ng/mL RANKL til induktion af osteoklast differentiering. På dag 5, blev osteoklast differentiering mediet ændret. Dag 6, et stort antal osteoklaster var synlige og osteoklast assays blev udført. Hvis osteoblaster ikke var synlig, osteoklast induktion mediet blev ændret og inkubation fortsatte til en dag mere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative visning af osteoklasterne. (A) gigant osteoklaster observeret i lysfelt på dag 6. Den røde linje skitseret grænsen af osteoklasterne. (B) en typisk gigant, multinucleated, FÆLDE positive (vin rød) osteoklast. Den sorte pil angivet to kerner af den multinucleated osteoklast. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: mTORC1 inaktivering i RapCtsk BMMs. Western blotting analyse af Raptor, P-S6 og S6 udtryk i WT og RapCtsk BMMs på dag 6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Sletning af Raptor nedsat osteoklast dannelse. (A) TRAP farvning af BMMs på dag 6. Høj forstørrelse billeder af pladser i WT og RapCtsk grupper er vist, henholdsvis. Der var mindre gigant, FÆLDE positive osteoklaster dannet i RapCtsk BMMs i forhold til WT gruppe. (B) TRAP aktivitet af kulturperler WT og RapCtsk BMMs. Data repræsenterer betyder ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Osteoclastogenic analyse er den mest udbredte metode til at isolere og kultur osteoklaster in vitro-12,13. Mens flere RANKL-baserede osteoklast induktioner har været beskrevet13,14,15, beskrevet den nuværende undersøgelse en protokol med nogle ændringer baseret på de tidligere metoder.

I den tidligere undersøgelse, BMMs plating umiddelbart efter isolation14,15. Vi anbefalede, at BMMs var kulturperler med grundlæggende medium natten før plating at isolere BMMs fra mesenkymale stamceller og fibroblaster, som straks holde sig til fadet. M-CSF kan fremme udbredelsen af monocytter at osteoklast prækursorer og stimulere osteoklast prækursorer for at udtrykke rang, der binder RANKL og derefter inducerer dannelsen af modne osteoklaster6,16,17. Derfor, i vores undersøgelse, BMMs blev induceret med 10 ng/mL M-CSF for 3 dage før osteoklast induktion, i stedet for osteoklast induktion på andendagen efter plating15. Celle massefylde er kritisk for osteoklast formation in vitro. Det anbefales, at 25.000 BMMs var seedede i hvert hul i en 96-brønd plade følgende ved 3 dages inkubation med 10 ng/mL M-CSF. Når cellen sammenløbet nåede 80-90%, er det et passende tidspunkt for osteoklast induktion af RANKL. Normalt, modne osteoklaster form på dag 6. Den mest almindelige årsag til par osteoklaster er suboptimal celle tæthed, som kan være resultatet af en lav seeding tæthed eller lav celle levedygtighed. BMMs er delikat primærelementer og skal behandles forsigtigt. At holde knoglen på is i lang tid eller resuspending kraftigt mindsker levedygtigheden af BMMs og efterfølgende hæmmer dannelsen af osteoklasterne. Den optimale seeding tæthed af levedygtige BMMs er således afgørende for at opnå et stort antal osteoklaster.

Aktiviteten af sekretoriske FÆLDE er afgørende for osteoclastic knogleresorption. I denne undersøgelse beskriver vi en metode til at analysere kvantitativt sekretoriske FÆLDE aktivitet i dyrkningsmediet. Ændringen af TRAP aktivitet i dyrkningsmediet kan skyldes ændringer af osteoklast antallet eller sekretoriske TRAP osteoklast eller en kombination af begge. Således, dette kan være en nyttig metode til analyse af osteoklast funktion i vitro sammen med osteoklast resorption assay beskrevet tidligere18.

mTOR er en evolutionært bevaret protein kinase, der kan regulere celle metabolisme og differentiering9. I denne undersøgelse fandt vi, at mTORC1 spillede en vigtig rolle i knogleresorption ved at regulere osteoklast dannelse. mTORC1 kan være en potentiel farmakologiske mål for behandling af metaboliske knoglelidelser såsom osteoporose i fremtiden.

Sammenfattende vores protokol for osteoklast induktion med held resulterede i et stort antal af gigantiske osteoklaster in vitro- og vores data tyder på, at mTORC1 er afgørende for osteoklast dannelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere, at de har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takke Dr. Minghan Tong og S. Kato for venligt leverer reagenser og mus. Vi takke medlemmerne af Zou lab til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet i en del af tilskud fra 973 Program fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (mest) [2014CB964704 og 2015CB964503], klinisk forskningsprogram af 9 People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Tak for hjælpen af Core facilitet for cellebiologi og Core facilitet i kemisk biologi, CAS Center for ekspertise inden for Molekylær celle videnskab, Shanghai Institut for biokemi og cellebiologi, kinesiske Academy of Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
En RANKL-baserede osteoklast kultur Assay af musen knoglemarven til at undersøge rollen, som mTORC1 i osteoklast dannelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter