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Developmental Biology

माउस अस्थि मज्जा की एक RANKL आधारित अस्थिशोषक संस्कृति परख अस्थिशोषक गठन में mTORC1 की भूमिका की जांच करने के लिए

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि को अलग करने और माउस अस्थि मज्जा से इन विट्रो में संस्कृति osteoclasts के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और अस्थिशोषक गठन में rapamycin परिसर 1 के स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य की भूमिका का अध्ययन ।

Abstract

Osteoclasts अद्वितीय अस्थि-resorbing कोशिकाओं है कि अस्थि मज्जा की monocyte/मैक्रोफेज वंश से अंतर कर रहे हैं । osteoclasts की शिथिलता हड्डी चयापचय रोगों, ऑस्टियोपोरोसिस सहित की एक श्रृंखला में परिणाम हो सकता है । रोग अस्थि जन हानि की रोकथाम के लिए दवा लक्ष्यों को विकसित करने के लिए, तंत्र जिसके द्वारा osteoclasts के अग्रदूतों से अंतर समझा जाना चाहिए । अलग करने की क्षमता और संस्कृति osteoclasts की एक बड़ी संख्या में इन विट्रो में महत्वपूर्ण है क्रम में अस्थिशोषक भेदभाव में विशिष्ट जीन की भूमिका निर्धारित करने के लिए । osteoclasts में rapamycin परिसर 1 (TORC1) के स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य की निष्क्रियता अस्थिशोषक संख्या में कमी और अस्थि द्रव्यमान बढ़ा सकते हैं; हालांकि, अंतर्निहित तंत्र आगे अध्ययन की आवश्यकता है । वर्तमान अध्ययन में, एक RANKL आधारित प्रोटोकॉल और माउस अस्थि मज्जा से osteoclasts संस्कृति को अलग करने और अस्थिशोषक गठन पर mTORC1 निष्क्रियता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णित है । इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक विशाल osteoclasts की एक बड़ी संख्या में परिणाम, आम तौर पर एक सप्ताह के भीतर । Raptor बिगड़ा अस्थिशोषक गठन के विलोपन और स्रावी tartrate-प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट की गतिविधि में कमी आई है, यह दर्शाता है कि mTORC1 अस्थिशोषक गठन के लिए महत्वपूर्ण है ।

Introduction

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हड्डी एक कभी बदलते अंग है और जीवन भर osteoblasts और osteoclasts द्वारा remodeled है । Osteoclasts खनिज मैट्रिक्स याला और osteoblasts संश्लेषित और स्रावित नई हड्डी मैट्रिक्स के लिए जिंमेदार हैं1। अस्थि अवशोषण और अस्थि गठन के बीच संतुलन हड्डी के रखरखाव सहित अस्थि स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है जन और उत्तेजना और चोट करने के लिए प्रतिक्रिया. यदि यह संतुलन बाधित है, अस्थि चयापचय रोगों की एक श्रृंखला, ऑस्टियोपोरोसिस और periodontal रोग सहित हो सकता है । इन रोगों में, osteoclastic हड्डी अवशोषण से उत्पन्न हड्डी द्रव्यमान हानि osteoblasts2,3की हड्डी बनाने की क्षमता से अधिक है । इस प्रकार, ताकि ऑस्टियोपोरोसिस जैसे कंकाल विकारों के इलाज के लिए दवा लक्ष्य विकसित करने के लिए, यह पीढ़ी और osteoclasts के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है4.

Osteoclasts पर या हड्डी की सतह के पास स्थित अद्वितीय विशाल multinucleated कोशिकाओं रहे हैं, और monocyte/मैक्रोफेज परिवार1के हैं । Ibbotson K. J. et al. 1, 25-dihydroxy-विटामिन डी 35युक्त माध्यम के साथ इन विट्रो में अस्थिशोषक-की तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक विधि की सूचना दी । मैक्रोफेज की पहचान-कॉलोनी उत्तेजक कारक (एम-सीएसएफ) और परमाणु कारक के लिए रिसेप्टर उत्प्रेरक-κ बी ligand (RANKL) अस्थिशोषक गठन के आवश्यक कारकों के रूप में नाटकीय रूप से osteoclastogenesis की क्षमता में वृद्धि हुई है इन विट्रो 1 , , 7. इन विट्रो में कल्चर osteoclasts करने की क्षमता ने osteoclasts की जनरेशन और रेगुलेशन की हमारी समझ में सुधार किया है ।

स्तनधारी/यंत्रवत लक्ष्य rapamycin (mTOR) दो संरचनात्मक और कार्यात्मक विशिष्ट परिसरों में कार्य करता है, अर्थात् mTORC1 और mTORC28,9। दो बहु प्रोटीन परिसरों उनके विभिंन घटकों और बहाव सब्सट्रेट के कारण एक दूसरे से अलग हैं । mTORC1 में mTOR (Raptor) का अद्वितीय विनियामक-संबद्ध प्रोटीन होता है, जबकि mTORC2 में rapamycin (mTOR)9का Rictor-संवेदी साथी होता है । mTORC1 एकीकृत और महत्वपूर्ण संकेतों संचारित करने के लिए सेल विकास, प्रसार और भेदभाव को विनियमित कर सकते हैं । हाल ही में, हम का प्रदर्शन किया है कि mTORC1 के नेटवर्क में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है catabolic हड्डी याला के विलोपन के द्वारा Raptor को निष्क्रिय करने के लिए mTORC1 में osteoclasts10. हालांकि, अंतर्निहित तंत्र आगे अध्ययन की आवश्यकता है । वर्तमान अध्ययन में, एक RANKL आधारित osteoclastogenic विधि के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) जंगली-प्रकार (WT) और रैपCtsk चूहों से osteoclasts उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और mTORC1 पर अस्थिशोषक निष्क्रियता के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए गठन.

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Protocol

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सभी जानवरों से संबंधित प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु देखभाल पर स्टैनफोर्ड प्रशासनिक पैनल द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया (APLAC) और पशु देखभाल और जैव रसायन और सेल के शंघाई संस्थान के उपयोग की समिति द्वारा अनुमोदित किए गए जीव.

1. तैयारी

  1. उत्पंन अस्थिशोषक विशिष्ट Raptor विलोपन चूहों (Raptorfl/ Ctsk-cre चूहों के साथ सहवास Raptorfl/fl चूहों द्वारा Ctsk-cre, इसके बाद रैपCtsk) । इस अध्ययन में WT नियंत्रण के रूप में Raptorfl/fl चूहों का प्रयोग करें ।
  2. बर्फ के साथ एक कंटेनर के लिए अलग हड्डी रखने के लिए ।
  3. संस्कृति माध्यम तैयार करें ।
    1. 1x glutamine, पेनिसिलिन-streptomycin, और 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम अल्फा (α-मेम) का सप्लीमेंट द्वारा α-मेम संस्कृति माध्यम तैयार करें ।
    2. तैयार अस्थि मज्जा मैक्रोफेज प्रेरण α के 50 मिलीलीटर-मेम मध्यम और एम-सीएसएफ पर 20 एनजी/
    3. α-मेम माध्यम के 50 मिलीलीटर में क्रमशः 20 एनजी/एमएल में एम-सीएसएफ और RANKL से मिलकर अस्थिशोषक इंडक्शन मीडियम तैयार करें ।
  4. ट्रैप धुंधला होने से पहले निंन बफ़र्स तैयार करें ।
    1. एसीटोन के 6.5 मिलीलीटर, साइट्रेट समाधान के 2.5 मिलीलीटर और 37% (vol/vol) formaldehyde समाधान की 0.8 मिलीलीटर से मिलकर ठीक समाधान तैयार करें ।
    2. जाल धुंधला समाधान तैयार करें ।
      1. 37 ° c के लिए गर्म पानी के नीचे ।
      2. फास्ट गार्नेट जीबीसी बेस समाधान के 100 µ एल जोड़ें और सोडियम नाइट्राइट समाधान के 100 µ एल में एक 1.5-एमएल microtube और मिश्रण के लिए कोमल उलटा द्वारा 30 एस । मिश्रण छोड़ 2 मिनट के लिए खड़े हो जाओ ।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पानी की 9 मिलीलीटर गर्म । कदम 1.4.2.2 से diazotized फास्ट गार्नेट जीबीसी बेस समाधान के 200 µ एल जोड़ें, µ के 100 naphthol एल के रूप में-द्वि फॉस्फेट समाधान, 400 µ एल के एसीटेट समाधान, और 200 µ एल के tartrate समाधान ।
      4. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में जाल धुंधला मिश्रण समाधान रखें ।
  5. संस्कृति माध्यम के ट्रैप गतिविधि ठहराव से पहले निंन बफ़र तैयार करें ।
    1. तैयार tartrate बफर (50 एमएल): 0.33 एम एल-tartaric एसिड की 2 मिलीलीटर, 0.33 मीटर सोडियम tartrate dibasic निर्जलीकरण की 48 मिलीलीटर । 4.9 के लिए पीएच मान समायोजित करें ।
    2. तैयार 4-Nitrophenyl फॉस्फेट disodium (pNPP) बफर (200 एमएल): १.५०२ जी की glycine, 41 मिलीग्राम की MgCl2, २७.२ मिलीग्राम की ZnCl2, और 180 मिलीलीटर पानी की. पीएच मान 3 एम NaOH के साथ 10.4 करने के लिए और मात्रा के साथ 200 मिलीलीटर को समायोजित पानी ।
    3. फॉस्फेट सब्सट्रेट (१ ९६-well प्लेट के लिए) के साथ pNPP बफर तैयार: ४९.३७ फॉस्फेट सब्सट्रेट के मिलीग्राम और 175 µ एल के pNPP बफर के चरण 1.5.2.
    4. सब्सट्रेट बफर तैयार (9 एमएल/96-well प्लेट): ६.२४ पानी की मिलीलीटर, 360 μL एसीटेट समाधान, और tartrate बफर के 2.4 मिलीलीटर । उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर भंवर और कचौरी से मिलाएं ।
    5. गरम सब्सट्रेट बफर (9ml) के 1.5.4 के लिए फॉस्फेट सब्सट्रेट (1.5.3) के साथ pNPP बफर के 90 μL जोड़ें एक सब्सट्रेट मिश्रण और 10 एस के लिए भंवर बनाने के लिए

2. विच्छेदन (Day-1)

  1. Euthanize ३ १ महीने पुरानी महिला WT और रैप Ctsk चूहों 2 अलग से सह द्वारा । प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा उपयुक्त उपकरणों के साथ2 साँस लेना सह प्रदर्शन.
  2. जीवाणु संक्रमण को रोकने और फिर एक लापरवाह स्थिति में एक विच्छेदन बोर्ड पर जगह के लिए 5 मिनट के लिए 75% इथेनॉल (vol/) के 100 मिलीलीटर के साथ एक चोंच में 6 चूहों विसर्जित कर दिया । टिबिया के बाहर खड़ी पर एक चीरा बनाओ और नेत्र कैंची के साथ हिंद अंग के साथ त्वचा काटना ।
  3. कैंची के साथ संयुक्त कूल्हे के जोड़दार बंधन में कटौती और ट्रंक से हिंद अंगों को स्थानांतरित ।
  4. संयुक्त घुटने के जोड़दार बंधन कट और ध्यान से टिबिया और फीमर संयुक्त घुटने से असंबद्ध । धीरे से कैंची के साथ नरम ऊतक निकालें ।
  5. बर्फ पर α-मेम के 2 मिलीलीटर के साथ एक छह अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुआं में एक माउस के एक जीनोटाइप के सभी हड्डियों प्लेस ।
    नोट: कोशिका व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए, हड्डी को इन शर्तों में 1 से कम के लिए रखा जाना चाहिए ज ।

3. अलगाव (Day-1)

  1. 75% इथेनॉल (3 मिलीलीटर) और α-मेम मध्यम (3 एमएल) के साथ अंय 5 कुओं के साथ एक छह अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह भरें ।
  2. 15 एस के लिए इथेनॉल धोने में एक जीनोटाइप के सभी हड्डियों रखो और हड्डियों को धोने के लिए 5 बार α-मेम मध्यम के लिए 10 एस हर बार के लिए ।
  3. कैंची के साथ epiphyses कट और हड्डी गुहा में एक 0.45 mm सिरिंज सुई डालने और α-मेम माध्यम के साथ बाहर फ्लश मज्जा एक 50 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में ।
  4. हड्डी के दूसरे छोर से एक ही विधि का उपयोग कर अस्थि गुहा फ्लश । हड्डी की पीली होने तक हड्डी की गुहा को अच्छी तरह से धो लें ।
  5. अस्थि मज्जा को 800 x जी में एक सेल गोली प्राप्त करने के लिए और 4 ° c 5 min. महाप्राण के लिए supernatant ।
  6. इस केंद्रापसारक ट्यूब में लाल रक्त कोशिका lysis बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें और पिपेट धीरे अस्थि मज्जा reसस्पेंड करने के लिए । लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं के लिए 8 मिनट के लिए बर्फ पर केंद्रापसारक ट्यूब रखो ।
  7. α के 6 मिलीलीटर जोड़ें-मेम मध्यम ट्यूब में बंद करने के लिए सेल lysis । 10 मिनट के लिए 500 x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant महाप्राण ।
  8. α के 3 मिलीलीटर में reसस्पैंड-मेम संस्कृति मध्यम और एक छह अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं जगह (आम तौर पर एक अच्छी तरह से प्रति माउस) ।
  9. एक 5% सह में 37 ° c पर मशीन2 मशीन रात भर ।

4. चढ़ाना (0 दिन)

  1. अगली सुबह unattached कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एक 15 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए supernatant स्थानांतरण ।
  2. 5 मिनट के लिए 800 x g और 4 ° c पर केंद्रापसारक और supernatant महाप्राण ।
  3. α-मेम संस्कृति माध्यम के 4 मिलीलीटर में पुनर्निलंबित ।
  4. सेल सॉल्यूशन के 20 µ l को लें और Trypan ब्लू के 20 µ l के साथ मिलाइये । इस मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें गिनती कक्ष और समाधान की मिलीलीटर प्रति सेल गिनती प्राप्त करें ।
  5. 500,000 कोशिकाओं/एमएल का एक सेल समाधान प्राप्त करने के लिए α-मेम संस्कृति माध्यम का एक उचित मात्रा जोड़ें ।
  6. 500 µ एल और 50 µ एल जोड़ें अस्थि मज्जा मैक्रोफेज प्रेरण माध्यम के एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी प्लेट और 96-खैर प्लेट, क्रमशः की ।
  7. एक 24-अच्छी तरह से थाली और 96-खैर प्लेट, क्रमशः के प्रत्येक कुआं में 500 µ एल और 50 µ एल जोड़ें सेल समाधान ।
  8. 3 दिनों के लिए एक 5% कं2 मशीन में 37 ° c में मशीन ।

5. विभेद (दिन 3-7)

  1. तीन दिन बाद चढ़ाना, 96 के प्रत्येक कुआं से 50 µ एल मध्यम इकट्ठा-अच्छी तरह से प्लेट और फ्रीज में-20 डिग्री सेल्सियस, और फिर महाप्राण अवशिष्ट माध्यम ।
  2. 1 मिलीलीटर और 100 µ एल अस्थिशोषक प्रेरण मध्यम एक 24 अच्छी प्लेट और एक 96-well थाली, क्रमशः के प्रत्येक कुआं में जोड़ें ।
  3. 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  4. प्रत्येक कुआं से मध्यम के ५० µ एल लीजिए और अवशिष्ट माध्यम को महाप्राण.
  5. एक अच्छी तरह से अस्थिशोषक प्रेरण माध्यम जोड़ें ।
  6. 1 दिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    नोट: इस समय बिंदु पर, बड़े, multinucleated osteoclasts एक औंधा माइक्रोस्कोप (चित्र 2a) के तहत देखा जाना चाहिए.
  7. यदि osteoclasts नहीं देखा जाता है, अस्थिशोषक प्रेरण माध्यम बदलने के लिए और दैनिक निरीक्षण जब तक osteoclasts देखा जाता है ।
  8. osteoclasts के गठन के बाद 96-खैर प्लेट के प्रत्येक कुआं से मध्यम के 50 µ एल लीजिए ।

6. Tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला

नोट: परिपक्व osteoclasts के बाद इन विट्रो संस्कृति (चरण 4) के 6-7 दिनों के बाद उपस्थित हो सकता है ।

  1. महाप्राण मध्यम और धो धीरे 1x पंजाबियों के साथ 3 बार ।
  2. कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए फिक्स समाधान के 100 µ एल के साथ 96-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में कोशिकाओं को ठीक करें ।
  3. निर्धारण के बाद, ठीक समाधान महाप्राण और धीरे से धोने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस से गरम पानी के साथ 3 बार । महाप्राण जल गया ।
  4. जाल के 100 µ एल जोड़ें 96 की एक अच्छी तरह से थाली में दाग और एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और प्रकाश से ढाल के लिए थाली जगह है ।
  5. दाग के बाद, महाप्राण जाल दाग और धीरे से पानी के साथ 3 बार धो लो ।
  6. छवि 40X आवर्धन पर एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर osteoclasts ।

7. ट्रैप गतिविधि संस्कृति माध्यम के ठहराव

  1. कदम 5.1, 5.4 और 5.8 से 96-खैर प्लेट के प्रत्येक कुआं से 30 µ एल कल्चर supernatant लीजिए; नकारात्मक नियंत्रण के रूप में गैर-कल्चरल अस्थिशोषक प्रेरण माध्यम के 30 µ l का उपयोग करें । नमूनों को एक नए 96-वेल प्लेट में रखें ।
  2. 96-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुआं में सब्सट्रेट मिश्रण (1.5.5) के 90 μL जोड़ें ।
  3. प्लेट एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच और प्रकाश से ढाल के लिए प्लेस ।
  4. 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में 3 मीटर NaOH के 50 µ l को जोड़कर रिएक्शन को बंद कर दें ।
  5. 405 एनएम के तरंग दैर्ध्य पर theabsorbance उपाय ।

8. वेस्टर्न सोख्ता

नोट: 24 वेल प्लेट में इन विट्रो कल्चर में 6-7 दिनों के बाद, परिपक्व osteoclasts दिखाई देनी चाहिए ।

  1. यम महाप्राण ।
  2. पूर्व ठंडा 1x पंजाबियों के साथ धीरे धो 3 बार ।
  3. महाप्राण पंजाबियों ।
  4. 1x एसडीएस lysis बफर युक्त के 100 µ एल जोड़ने के लिए चिढ़ाना अवरोधक कॉकटेल ।
  5. 10 मिनट के लिए 105 ° c पर हीट lysates और 12,000 × g और 4 ° c पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । प्रोटीन युक्त supernatants लीजिए.
  6. 10% एसडीएस-PAGE11 द्वारा प्रोटीन के 30 µ g युक्त lysates को अलग करें और फिर एक polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली में ट्रांसफर करें ।
  7. 30 मिनट के लिए 5% नोनफेट दूध के साथ झिल्ली ब्लॉक ।
  8. एंटी-Raptor, एंटी-पी-s6, एंटी-s6, एंटी-β-actin के साथ झिल्ली की मशीन 1 पर: 1000 कमजोर पड़ने 5% नोनफेट दूध में 4 ° c रातोंरात ।
  9. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए-20 (TBST) के बीच के साथ Tris बफर खारा के साथ झिल्ली धो लो ।
  10. चरण 8.9 दो बार दोहराएं ।
  11. सहिजन peroxidase के साथ झिल्ली गर्मी (एचआरपी)-संयुग्मित विरोधी माउस या खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी पर 1:5% में 5000 कमजोर पड़ने नोनफेट दूध के लिए 1 घंटे में कमरे के तापमान पर ।
  12. TBST के साथ 3 बार झिल्ली को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर धो लें ।
  13. chemiluminescent पता लगाने के लिए, झिल्ली पर पश्चिमी chemiluminescent एचआरपी सब्सट्रेट जोड़ें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । अतिरिक्त सब्सट्रेट नाली और एक्स-रे फिल्म के लिए दाग बेनकाब ।

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Representative Results

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वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करना, विशाल osteoclasts की एक बड़ी संख्या 6 दिन पर देखा गया; यदि विशालकाय osteoclasts नहीं देखा जाता है, अस्थिशोषक विभेद के एक और दिन (चित्रा 1) की जरूरत हो सकती है । ट्रैप धुंधला (चित्रा 2a) द्वारा सफल अस्थिशोषक गठन की पुष्टि की गई । Osteoclasts 3 से अधिक नाभिक के साथ विशाल शराब लाल/ 250 से अधिक osteoclasts WT BMMs (चित्र 4a) में 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुआं में प्राप्त किए गए थे.

Raptor का विलोपन पश्चिमी सोख्ता विश्लेषण द्वारा पुष्टि की गई और mTORC1 की निष्क्रियता राइबोसोमल प्रोटीन S6 फास्फारिलीकरण (पी-S6), जो व्यापक रूप से readout (चित्रा 3) के लिए mTORC1 के रूप में प्रयोग किया जाता है में कमी से निर्धारित किया गया था ।

WT समूह (चित्र 4a), जो संकेत दिया कि Raptor कमी बिगड़ा अस्थिशोषक गठन के साथ तुलना में रैपCtsk BMMs में ट्रेप पॉजिटिव osteoclasts की संख्या में कमी आई ।

स्रावी ट्रैप की गतिविधि अस्थि अवशोषण के लिए महत्वपूर्ण है, और संस्कृति माध्यम में ट्रैप गतिविधि वर्तमान अध्ययन में विश्लेषण किया गया था । के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, जाल गतिविधि दोनों WT और रैपCtsk BMMs में RANKL की उत्तेजना के कारण वृद्धि हुई । इसके अतिरिक्त, ट्रैप गतिविधि में संगत WT समूह (P < 0.05) की तुलना में रैपCtskBMMs में कमी आई ।

Figure 1
चित्रा 1: अस्थिशोषक प्रेरण प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध आरेख । BMMs 1 दिन पर अलग-थलग थे और बुनियादी α-मेम मध्यम रात भर के साथ मशीन । 0 दिन पर, BMMs एकत्र और एक 96-अच्छी तरह से प्लेट और 24 अच्छी तरह से α में मशीन के बाद थाली-मेम मध्यम के साथ 10 एनजी/ 3 दिन पर, मध्यम α के लिए बदल गया था-मेम मध्यम 20 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ और 20 अस्थिशोषक भेदभाव के प्रेरण के लिए एनजी/एमएल RANKL के साथ । 5 दिन पर, अस्थिशोषक विभेद माध्यम बदल गया था । दिन के 6 बजे बड़ी संख्या में osteoclasts दिखाई दे रहे थे और अस्थिशोषक परख कर प्रदर्शन कर रहे थे । यदि osteoblasts दिखाई नहीं थे, अस्थिशोषक प्रेरण माध्यम बदल गया था और एक और दिन के लिए जारी करने की मशीन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: osteoclasts का प्रतिनिधि दृश्य. (एक) विशाल osteoclasts 6 दिन उज्ज्वल क्षेत्र में मनाया । लाल रेखा ने osteoclasts की सीमा को रेखांकित किया । (B) एक सामान्यतया विशालकाय, multinucleated, ट्रैप पॉजीटिव (वाइन रेड) अस्थिशोषक । काले तीर ने multinucleated अस्थिशोषक के दो नाभिक का संकेत दिया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: mTORC1 में निष्क्रियता रैपCtsk BMMs । WT में Raptor, पी-s6 और s6 एक्सप्रेशन का वेस्टर्न सोख्ता एनालिसिस और रैप काCtsk 6 दिन पर BMMs । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: Raptor बिगड़ा अस्थिशोषक गठन का विलोपन । () 6 दिन पर BMMs के जाल धुंधला । WT और रैपCtsk समूहों में वर्गों की उच्च आवर्धन छवियां क्रमशः दिखाई जाती हैं । WT समूह की तुलना में रैपCtsk BMMs में कम विशालकाय, ट्रैप पॉजीटिव osteoclasts का गठन किया गया । () कल्चरल WT की ट्रैप गतिविधि और रैपCtsk BMMs । डेटा का अर्थ है ± S.D. * P < 0.05, n = 3 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

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osteoclastogenic परख को अलग करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है और इन विट्रो12,13में संस्कृति osteoclasts । जबकि कई RANKL आधारित अस्थिशोषक प्रेरण13,14,15वर्णित किया गया है, वर्तमान अध्ययन पिछले तरीकों के आधार पर कुछ संशोधनों के साथ एक प्रोटोकॉल वर्णित है ।

पिछले अध्ययन में, BMMs14,15अलगाव के तुरंत बाद चढ़ाना थे । हम सिफारिश की है कि BMMs बुनियादी मध्यम रात भर के साथ mesenchymal स्टेम सेल और fibroblasts जो तुरंत पकवान का पालन से BMMs अलग करने के लिए चढ़ाना पहले से संस्कृति थे । एम सीएसएफ अस्थिशोषक अग्रदूतों के लिए monocytes के प्रसार को बढ़ावा देने और व्यक्त रैंक कि बांध RANKL और फिर परिपक्व osteoclasts6,16,17के गठन उत्प्रेरण के लिए अस्थिशोषक अग्रदूतों को प्रोत्साहित कर सकते हैं । इसलिए, हमारे अध्ययन में, BMMs अस्थिशोषक प्रेरण से पहले 3 दिनों के लिए 10 एनजी/एमएल एम-सीएसएफ के साथ प्रेरित किया गया, बजाय अस्थिशोषक प्रेरण के लिए दूसरे दिन15चढ़ाना के बाद । सेल घनत्व इन विट्रो मेंअस्थिशोषक गठन के लिए महत्वपूर्ण है । यह सिफारिश की है कि 25,000 BMMs के एक अच्छी तरह से एक 96 की थाली में वरीयता दी गई 3 दिनों की मशीन द्वारा 10 एनजी/ जब कोशिका संगम 80-90% तक पहुंच गया, तो यह RANKL की अस्थिशोषक प्रेरण के लिए एक उपयुक्त समय है । आमतौर पर, 6 दिन पर परिपक्व osteoclasts फार्म । कुछ osteoclasts के लिए सबसे आम कारण है इष्टतम कोशिका घनत्व, जो एक कम बीज का घनत्व या कम कोशिका व्यवहार्यता का परिणाम हो सकता है । BMMs नाजुक प्राथमिक कोशिकाओं रहे है और धीरे इलाज की जरूरत है । एक लंबे समय के लिए बर्फ पर हड्डी रखते हुए या reसस्पैंड जोरदार BMMs की व्यवहार्यता कम हो जाती है और बाद में osteoclasts के गठन बिगड़ जाती है । इस प्रकार, व्यवहार्य BMMs के इष्टतम बोने घनत्व osteoclasts की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

स्रावी ट्रैप की गतिविधि osteoclastic अस्थि अवशोषण के लिए महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए मात्रात्मक संस्कृति माध्यम में स्रावी ट्रैप गतिविधि का विश्लेषण । संस्कृति माध्यम में ट्रैप गतिविधि के परिवर्तन अस्थिशोषक संख्या या अस्थिशोषक या दोनों का एक संयोजन के स्रावी जाल के परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं । इस प्रकार, यह अस्थिशोषक याला परख के साथ एक साथ इन विट्रो में अस्थिशोषक समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक उपयोगी तरीका हो सकता है पहले18वर्णित है ।

mTOR एक evolutionarily-संरक्षित प्रोटीन कळेनासे है कि सेल चयापचय और भेदभाव9विनियमित कर सकते है । इस अध्ययन में हमने पाया कि mTORC1 ने अस्थिशोषक गठन को विनियमित करके अस्थि अवशोषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई । mTORC1 भविष्य में ऑस्टियोपोरोसिस जैसे अस्थि चयापचय विकारों के उपचार के लिए एक संभावित औषधीय लक्ष्य हो सकता है ।

संक्षेप में, अस्थिशोषक प्रेरण के लिए हमारे प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इन विट्रो में विशाल osteoclasts की एक बड़ी संख्या में हुई और हमारे डेटा का सुझाव है कि mTORC1 अस्थिशोषक गठन के लिए महत्वपूर्ण है ।

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Disclosures

सभी लेखकों राज्य है कि वे हित का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक Dr. Minghan टोंग और एस काटो के लिए कृपया एजेंट और चूहे प्रदान धंयवाद । हम उपयोगी विचार विमर्श के लिए Zou लैब के सदस्यों को धंयवाद । इस काम के हिस्से में विज्ञान और प्रौद्योगिकी के चीनी मंत्रालय से 973 कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (अधिकांश) [2014CB964704 और 2015CB964503], 9 पीपुल्स अस्पताल के नैदानिक अनुसंधान कार्यक्रम, शंघाई Jiao टोंग विश्वविद्यालय चिकित्सा के स्कूल । सेल जीवविज्ञान और रासायनिक जीवविज्ञान के लिए कोर सुविधा के लिए कोर सुविधा की मदद के लिए धन्यवाद, कैस आणविक कोशिका विज्ञान में उत्कृष्टता के लिए केंद्र, जैव रसायन और सेल बायोलॉजी के शंघाई संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

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References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
माउस अस्थि मज्जा की एक RANKL आधारित अस्थिशोषक संस्कृति परख अस्थिशोषक गठन में mTORC1 की भूमिका की जांच करने के लिए
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Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

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