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Developmental Biology

RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

本稿では、マウスの骨髄から破骨細胞形成の複雑な 1 ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの役割を研究する分離と培養破骨細胞の in vitroにプロトコルについて説明します。

Abstract

破骨細胞が骨吸収をユニークな細胞を骨髄単球/マクロファージ系統から分化します。破骨細胞の機能不全、骨粗鬆症を含む骨代謝疾患のシリーズあります。病的骨の質量損失の防止のための医薬品のターゲットを開発するには、破骨細胞を前駆体から区別するメカニズムが理解されなければなりません。分離し、培養破骨細胞の多数の文化能力は破骨細胞分化における特定遺伝子の役割を決定するために重要です。破骨細胞の複雑な 1 (TORC1) ラパマイシンの哺乳類/機構のターゲットの不活化する破骨細胞数が低下し、骨の量を増やすただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。本研究では RANKL ベースのプロトコルを分離し、培養マウス骨髄から破骨細胞と破骨細胞形成における mTORC1 不活性化の影響を研究する、説明します。このプロトコルは正常に 1 週間以内通常巨大な破骨細胞の多数で起因しました。ラプターの削除は、破骨細胞形成を障害者し、その mTORC1 が破骨細胞形成のためクリティカルを示す分泌の酒石酸耐性酸性ホスファターゼの活性が低下します。

Introduction

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骨は絶えず変化する臓器で、骨芽細胞と破骨細胞は生涯で改造します。破骨細胞は、無機マトリックス吸収と骨芽細胞が合成し、新しいボーン行列1を分泌します。骨吸収と骨形成のバランスは骨の維持を含む骨の健康にとって重要な質量と刺激や損傷に応答します。このバランスを中断すると、骨粗鬆症と歯周疾患を含む、一連の骨代謝性疾患が発生します。これらの疾患では、破骨細胞性骨吸収による骨の質量損失は骨形成骨芽細胞2,3の容量を超えています。したがって、骨粗鬆症など骨格の疾患を治療する医薬品ターゲットを開発するために、世代や4破骨細胞の生物学を理解する重要です。

破骨細胞または骨の表面近くにあるユニークな巨大な多核巨細胞の細胞、単球/マクロファージ家族1に属する。イボットソン k. j.1, 25-ジヒドロキシ ビタミン D35を含む培地で培養破骨細胞様細胞を生成する手法について報告します。破骨細胞形成の本質的な要因としてマクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) と核因子 κ B ligand (RANKL) の受容体を活性化因子の同定には破骨細胞形成体外の効率が大幅に増加します。1,6,7. 世代の我々 の理解と破骨細胞の制御に培養破骨細胞の in vitroに能力は向上します。

2 つの構造的、機能的に異なる錯体、すなわち mTORC1、mTORC28,9ラパマイシン標的 (mTOR) 関数の哺乳類/機構対象。2 つの多蛋白質の複合体は異なった部品および下流の基板による互いから区別されます。mTORC1 には mTORC2 には mTOR (Rictor)9のラパマイシンを区別しないコンパニオンが含まれている mTOR (ラプター) のユニークな規制関連タンパク質が含まれています。mTORC1 は統合し、細胞の増殖、増殖と分化の調節に重要な信号を送信できます。最近、その mTORC1 破10で mTORC1 を不活化するラプターの削除によって異化骨吸収のネットワーク キー役割を果たしてデモンストレーションを行った。ただし、基になるメカニズムのさらなる研究が必要です。野生型 (WT) とラップのCtskマウスの骨髄由来マクロファージ (BMMs) から破骨細胞を生成し、破骨細胞に mTORC1 不活性化の影響を研究する本研究 RANKL ベースの osteoclastogenic メソッドを使用しました。形成します。

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Protocol

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動物に関する各種手続きスタンフォード紛争処理パネル研究所動物ケア (APLAC) のによって承認されたプロトコルに従って行われ、動物愛護、上海研究所の生化学と細胞の利用委員会によって承認されました。生物学。

1. 準備

  1. 破骨細胞特定ラプター削除マウス (ラプターフロリダ州/フロリダ; を生成します。Ctsk creCtskラップ来世)ラプターフロリダ州/フロリダ州 Ctsk creマウス マウスの交配による。本研究では WT コントロールとしてラプターフロリダ州/フロリダマウスを使用します。
  2. 分離骨を保つために氷が付いている容器があります。
  3. 培養液を準備します。
    1. 1 x グルタミン、ペニシリン ・ ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清と最小必須培地アルファ (α-MEM) を補うことで α MEM 培地を準備します。
    2. 骨髄マクロファージ誘導培地 20 ng/mL で α MEM 培地および M CSF の 50 mL の構成を準備します。
    3. 破骨細胞誘導培地から成る M-CSF と RANKL 20 ng/ml、それぞれ α MEM 培地 50 ml を準備します。
  4. トラップに汚れる前に次のバッファーを準備します。
    1. 0.8 mL の 37% (巻/巻) ホルムアルデヒド溶液クエン酸溶液 2.5 mL、アセトンの 6.5 mL から成る修正ソリューションを準備します。
    2. トラップの染色液を準備します。
      1. 37 ° c. に脱イオン水を prewarm します。
      2. 1.5 mL マイクロ チューブに高速ガーネット GBC 基本ソリューションの 100 μ L との亜硝酸ナトリウム溶液 100 μ L を加え、混ぜる 30 s. 休暇の穏やかな逆解析による 2 分放置する混合物。
      3. 脱イオン水 37 ° C の prewarm 9 mL1.4.2.2、ナフトール AS BI リン酸液、酢酸溶液を 400 μ l 添加、酒石酸溶液 200 μ L を 100 μ l 添加のステップから高速ガーネット ジアゾ GBC 基本ソリューションの 200 μ L を追加します。
      4. 37 ° C の水浴中で混合液を染色トラップを維持します。
  5. 培養液中のトラップ活動定量化する前に次のバッファーを準備します。
    1. 酒石酸バッファー (50 mL) を準備: 0.33 M L - 酒石酸、0.33 M 酒石酸二塩基ナトリウム 48 mL の 2 mL の水分を取り除きます。4.9 に pH 値を調整します。
    2. 4-ニトロフェニル リン酸二ナトリウム (同時) バッファー (200 mL) を準備: 180 mL の脱イオン水、ZnCl2、27.2 mg MgCl241 mg グリシンの 1.502 g。3 M NaOH で 10.4 に pH 値および脱イオン水と 200 mL にボリュームを調整します。
    3. (1 つの 96 ウェル プレート) の脱燐酸化酵素の基質との同時バッファーを準備: ホスファターゼ基板のステップ 1.5.2 の同時バッファーの 175 μ L 49.37 mg。
    4. 基板バッファー (9 mL/96-ウェル プレート) を準備: 6.24 mL の脱イオン水, 酢酸溶液の 360 μ L と 2.4 mL の酒石酸バッファー。渦によって混合し、使用前に 37 ° C で予熱します。
    5. 予熱した基板 buffer(1.5.4) 基板の混合物と 10 の渦の 9 ml に, 耐バッファーとホスファターゼ substrate(1.5.3) の 90 μ L を追加 s。

2. 郭清 (日-1)

  1. CO2 3 1 ヶ月齢の雌の WT とラップCtskマウスを別々 に安楽死させます。訓練された人員によって適切な装置を持つ CO2吸入を実行します。
  2. 75% エタノール (巻/巻) 細菌汚染を防止し、仰臥位で郭清ボードの上に 5 分間の 100 mL のビーカーに 6 匹のマウスを浸します。脛骨の遠位部に縦切開をするそして眼科用ハサミで後肢に沿って皮膚を解剖します。
  3. 股関節の関節の靭帯をハサミで切って、トランクから後肢を脱臼します。
  4. 膝関節の関節の靭帯を切り、慎重に脛骨と大腿骨、膝関節から関連付けを解除します。ハサミで軟部組織を慎重に取り外します。
  5. 氷の上 α MEM の 2 mL の 6 ウェル プレートの各ウェルに 1 つ 1 つのマウスの遺伝子型のすべてのボーンを配置します。
    注意: セル実行可能性を維持するために、骨は 1 時間未満をこれらの条件で保管すべき。

3. 分離 (日-1)

  1. Α MEM 培地 (3 mL) で 75% エタノール (3 mL) 6 ウェル プレートのウェル 1 個と他の 5 の井戸を埋めます。
  2. 1 つの遺伝子型のすべてのボーンを入れて 5 回 10 α MEM 培地で 15 s と洗って骨のエタノール洗浄 s たびに。
  3. シザーと骨を断つ、50 mL の遠心管に α MEM 培地でのうち、骨の空洞とフラッシュの骨髄に 0.45 mm 注射針を挿入します。
  4. 骨のもう一方の端から同じメソッドを使用して骨の空洞をフラッシュします。骨が薄いまで骨空洞を徹底的に洗うが、少なくとも 2 回繰り返します。
  5. 遠心分離機の骨髄細胞ペレット 800 x g で 5 分吸引清 4 ° C を取得します。
  6. 遠心分離機管と骨髄を再懸濁します優しくピペットに赤血球細胞の換散バッファーの 3 mL を加えます。赤い血液細胞を溶解する 8 分間氷の上遠心管を保ちます。
  7. セル換散を停止する遠心管に α MEM 媒体の 6 mL を追加します。500 x g と 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を吸引します。
  8. Α MEM 培地 3 mL に再懸濁します、6 ウェル プレート (ウェルあたり一般に 1 つのマウス) にセルを配置します。
  9. 37 ° c 5% CO2インキュベーターで一晩インキュベートします。

4. めっき (0 日)

  1. 未接続のセルに次の朝を収集するために 15 mL 遠心チューブに上清を転送します。
  2. 800 x g と 5 分の 4 ° C で遠心し、上清を吸引します。
  3. Α MEM 培地 4 mL に再懸濁します。
  4. 携帯ソリューションの 20 μ L を取るし、トリパン ブルーの 20 μ L で混ぜます。カウントの商工会議所に混合物の 10 μ L を追加し、ソリューションの mL あたりのセル数を取得します。
  5. Α MEM 培地 500,000 セル/mL のセル解を得るための適切な量を追加します。
  6. それぞれ 500 μ L と骨髄マクロファージ誘導培地の 50 μ L を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  7. それぞれ 500 μ L とセル溶液 50 μ L を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  8. 3 日間、37 ° c 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。

5. 分化 (日 3-7)

  1. めっき後, 3 日 96 ウェル プレートの各ウェルから 50 μ L の培地を収集-20 ° C の凍結し、残留の培地を吸引します。
  2. それぞれ 1 mL と 100 μ L 破骨細胞誘導培地を 24 ウェル プレート、96 ウェル プレートの各ウェルに追加します。
  3. 37 ° C で 2 日間インキュベートします。
  4. 各ウェルから媒体の 50 μ L を収集し、残留の培地を吸引します。
  5. 各ウェルに破骨細胞誘導培地を追加します。
  6. 37 ° C で 1 日間インキュベートします。
    注: この時点で大きい、多核巨細胞の破骨細胞は倒立顕微鏡 (図 2 a) の下で見てはなりません。
  7. 破骨細胞は見ていない場合、は、破骨細胞誘導培地を変更し、破骨細胞が見られるまで毎日観察。
  8. 破骨細胞が形成された後、96 ウェル プレートの各ウェルから媒体の 50 μ L を収集します。

6. 酒石酸耐性酸フォスファターゼ (TRAP) 染色

注: 成熟破骨細胞は体外培養 (ステップ 4) の 6-7 日後にあります。

  1. 培地を吸引し、1x PBS で 3 回を優しく洗ってください。
  2. 30 の修正プログラム ソリューションの 100 μ L の 96 ウェル プレートの各ウェルに、細胞を修正室温で s。
  3. 固定後、修正プログラム ソリューションを吸引、prewarmed 37 ° c. に脱イオン水で 3 回を優しく洗浄脱イオン水を吸い出しなさい。
  4. トラップ汚れ 96 ウェル プレートの各ウェルに 100 μ L を追加し、37 ° C で 30 分と光からの盾のインキュベーターでプレートを配置します。
  5. 汚損の後トラップ汚れを吸引、脱イオン水で 3 回を優しく洗います。
  6. イメージは、40 倍の倍率で倒立顕微鏡を用いた破骨細胞。

7. トラップ活動定量化培地の

  1. ステップ 5.1、5.4 5.8; から 96 ウェル プレートの各ウェルから 30 μ L の培養上清を収集します。陰性対照として非培養破骨細胞誘導培地の 30 μ L を使用します。新しい 96 ウェル プレートにサンプルを配置します。
  2. 96 ウェル プレートの各ウェルに基板 mixture(1.5.5) の 90 μ L を追加します。
  3. 1 h と光からの盾の 37 ° C でインキュベーターでプレートを配置します。
  4. 96 ウェル プレートの各ウェルに 3 メートル naoh 水溶液 50 μ L の追加によって反作用を停止します。
  5. 測定波長 405 theabsorbance nm。

8. 西部にしみが付くこと

注: 6-7 日間 24 ウェル プレートで体外培養後成熟破骨細胞が表示されます。

  1. 培地を吸引します。
  2. 予冷 1 x PBS 3 回で優しく洗ってください。
  3. PBS を吸い出しなさい。
  4. SDS 換散バッファー含むプロテアーゼ抑制剤のカクテル × 1 の 100 μ L を追加します。
  5. 10 分 105 ° C で熱を可溶化物、12,000 × g と 4 ° C で 10 分間遠心するタンパク質を含む培養上清を収集します。
  6. 10 %sds ページ11で蛋白質の 30 μ g を含む溶解液を分離し、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に転送。
  7. 30 分間 5% 乳脂肪の膜をブロックします。
  8. 反猛禽、アンチ P S6、アンチ S6、抗 β-アクチン一晩 4 ° C で 5% 乳脂肪で縮尺希釈で膜を孵化させなさい。
  9. 室温でトリス緩衝生理食塩水トゥイーン 20 (TBST) で 10 分間、膜を洗浄します。
  10. 8.9 の手順を 2 回繰り返します。
  11. 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の膜を孵化させなさい-標識抗マウスやウサギの IgG 抗体 1:5,000 室温で 1 時間 5% 無脂肪牛乳で希釈。
  12. 室温で 10 分間 TBST で 3 回膜を洗います。
  13. 化学ルミネセンスの検出の膜に西洋化学発光 HRP 基板を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。余分な基板のドレインし、x 線フィルムにしみを公開します。

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Representative Results

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現在のプロトコルを使用して、巨大な破骨細胞の数が多いは、6; の日に見られました。巨大な破骨細胞を見ていない場合破骨細胞分化の 1 つのより多くの日があります (図 1) を必要とします。成功した破骨細胞形成は、TRAP 染色 (図 2 a) によって確認されました。破骨細胞以上 3 核の巨大ワイン赤/紫細胞はあった。WT BMMs (図 4 a) で 96 ウェル プレートの各ウェルに 250 以上の破骨細胞が得られました。

ラプターの削除は西部のしみが付く分析によって確認された、mTORC1 の不活性化は mTORC1 の読み出しとして用いられているリボソームタンパク質 S6 のリン酸化 (P-S6) の減少によって決定された (図 3)。

ラプターの欠乏に破骨細胞形成が損なわれることを示された WT グループ (図 4 a) と比較してラップCtsk BMMs で TRAP 陽性破骨細胞数が減少しました。

分泌トラップの活動が骨吸収のために重要、TRAP 活性培養培地では本研究で分析しました。図 4 bに示すように TRAP 活性は WT のCtskラップBMMs RANKL 刺激により増加しました。さらに、TRAP 活性ラップCtskBMMs 対応する WT 群と比較して減少した (P < 0.05)。

Figure 1
図 1: 破骨細胞誘導プロトコルの概略図。BMMs が 1 日目に分離・基本的な α-MEM 培地で一晩培養します。0 日 BMMs は収集され 96 ウェル プレートと 10 ng/ml の M-CSF α MEM 培地で培養後 24 ウェル プレートにメッキします。3 日目、媒体は α MEM 培地 20 ng/ml M-CSF と 20 ng/mL RANKL 破骨細胞分化の誘導のために変更されました。破骨細胞分化培地が 5 日に変更されました。6 日目、破骨細胞の数が多いが表示されていたし、破骨細胞アッセイを行った。骨芽細胞が表示されていない場合、破骨細胞誘導培地が変更され、潜伏継続 1 つのより多くの日。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 破骨細胞の代表的なビューです。(A) 巨大な破骨細胞が 6 日目に明視野で観察されます。赤い線は、破骨細胞の境界線を概説しました。(B) A は通常巨大な多核巨細胞、トラップの陽性 (ワインレッド) 破黒の矢印には、多核巨細胞の破骨細胞の 2 つの核が示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: mTORC1 不活化 BMMs のCtskをラップ。6 日目の WT とCtskラップBMMs ラプター、P S6 および S6 式のウエスタンブロット。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:ラプターの削除障害破骨細胞形成します。(A) トラップの 6 日目で BMMs の汚損。WT は、 Ctskのラップグループで正方形の高倍率画像は、それぞれ表示されます。以下、巨大なトラップ肯定的な破骨細胞 WT グループと比較するとCtskラップBMMs の形成があった。トラップ (B) 活性培養 WT とCtskラップBMMs データを表す意味 ± S.D.* P < 0.05、n = 3。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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Osteoclastogenic アッセイは、分離と培養破骨細胞の in vitro12,13最も広く使われている方法です。いくつかの RANKL による破骨細胞誘導説明13,14,15をされているが、本研究は、いくつかの変更は、以前の方法に基づくプロトコルを説明します。

以前の研究では、BMMs は分離14,15後すぐにメッキされました。BMMs 間葉系幹細胞とすぐに皿に付着する線維芽細胞から BMMs を隔離するめっきする前に基本培地を一晩培養したことをお勧めします。M CSF は、破骨細胞前駆細胞への単球の増殖を促進でき、RANKL を結合し、破骨細胞6,16,17の形成を誘導するランクを表現する破骨細胞前駆体を刺激します。したがって、私たちの研究では、BMMs 誘導された 10 ng/ml の M-CSF 破骨細胞誘導前に 3 日間の代わりに15のめっき後の 2 日目の破骨細胞誘導の.細胞密度は、破骨細胞形成体外にとって重要です。10 ng/mL M CSF で 3 日間培養まで次の 96 ウェル プレートの各ウェルに 25,000 BMMs の播種することをお勧めします。セル合流が 80-90% に達したら、RANKL の破骨細胞誘導に適した時間です。通常、成熟した破骨細胞フォーム 6 日目。いくつかの破骨細胞の最も一般的な理由は最適な細胞密度、低播種密度または低細胞生存率の結果をすることができます。BMMs 繊細な一次電池、優しく扱われることを必要です。長い間氷の上の骨を保つか、または積極的に再 BMMs の生存力を低下し、その後破骨細胞の形成を損ないます。したがって、実行可能な BMMs の最適な播種密度は、破骨細胞の大規模な番号を取得するため重要です。

分泌型トラップの活動は破骨細胞性骨吸収のため重要です。この研究では、培養液中の分泌の TRAP 活性を定量的に解析する方法をについて説明します。培養培地で TRAP 活性の変化は、破骨細胞数の変化や破骨細胞またはその両方の組み合わせの分泌のトラップに起因できます。このように、破骨細胞機能分析培養破骨細胞の吸収測定と説明した18のため、これは有用な方法かもしれません。

mTOR は細胞代謝と分化9を調節することができます - 保存された蛋白質キナーゼです。本研究ではその mTORC1 が破骨細胞形成を調節することによって骨吸収に重要な役割を果たしたがわかった。mTORC1 将来、骨粗鬆症などの骨代謝性疾患の治療のための潜在的な薬理学の目標があります。

要約すると、多数の巨大な破骨細胞の in vitroの結果正常に破骨細胞誘導のためのプロトコルとその mTORC1 は破骨細胞形成の重要な示唆します。

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Disclosures

すべての著者は、利害の対立があるないこと状態します。

Acknowledgments

著者は、ご提供する試薬およびマウスの博士 Minghan トンと加藤をありがとうございます。私たちは有益な議論のゾウの研究室のメンバーに感謝します。この作品は一部の助成金によって支えられた 973 プログラム中国の省の科学と技術 (ほとんど) [2014CB964704、2015CB964503] からの第 9 人民病院、上海 Jiao はさみ大学医学部の臨床研究プログラム。細胞生物学および生物化学の中核施設、上海生物化学および細胞生物学、中国科学アカデミー研究所分子細胞科学の卓越性のための CAS センターの中核施設の助けをありがとう。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

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References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
RANKL による破骨細胞文化アッセイのマウス骨髄破骨細胞形成における mTORC1 の役割を調査するには
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Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

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