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Developmental Biology

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

Introduction

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뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스1분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts4의 생물학을 이해 하는 중요 한.

Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족1에 속한다. Ibbotson K. J. 외. 1, 25-dihydroxy-비타민 D35를 포함 하는 매체와 osteoclast 같은 세포에서 생체 외에서 생성 하는 방법을 보고. Osteoclast 형성의 필수적인 요인으로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 및 핵 요인-κ B ligand (RANKL)에 대 한 수용 체 활성의 식별 극적으로 osteoclastogenesis 체 외 의 효율성 증가 1 , 6 , 7. 수 문화 osteoclasts에서 생체 외에서 세대의 우리의 이해와 osteoclasts의 규제 개선 했다.

2 구조적 및 기능적으로 뚜렷한 단지, 즉 mTORC1 및 mTORC28,9rapamycin (mTOR) 함수의 포유류/기계적 대상. 두 다 단백질 복합물은 다릅니다 서로 그들의 서로 다른 구성 요소와 다운스트림 기판. mTORC1 mTORC2 포함 mTOR (Rictor)9의 rapamycin을 구분 하지 않는 동반자 mTOR (랩 터)의 독특한 규정 관련 단백질을 포함 합니다. mTORC1 통합 하 고 통제 세포 성장, 증식 및 분화에 중요 한 신호를 전송할 수 있습니다. 최근에, 우리는 mTORC1 중요 한 역할 catabolic 뼈 재흡수의 네트워크에서 랩 터 osteoclasts10에서 mTORC1을 비활성화에 삭제에 의해 입증. 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 야생-타입 (WT) 및 Ctsk 마우스의 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 osteoclasts를 생성 하 고 mTORC1 비활성화 osteoclast에의 영향을 공부 RANKL 기반 osteoclastogenic 메서드 사용 되었다 형성입니다.

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Protocol

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동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.

1입니다. 준비

  1. Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터플로리다/플로리다; 생성 Ctsk-cre, 향후 Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터플로리다/플로리다 쥐를 교배 하 여. 랩 터플로리다/플로리다 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.
  2. 고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.
  3. 문화 매체를 준비 합니다.
    1. 최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.
    2. 골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.
    3. Osteoclast 유도 매체 구성 된 M-CSF RANKL 20 ng/mL에서 각각, α-MEM 매체의 50 ml에서를 준비 합니다.
  4. 트랩 얼룩이 지기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
    1. 아세톤, 시트르산 솔루션 및 37% (vol/vol) 포름알데히드 용액의 0.8 mL 2.5 mL의 6.5 mL의 구성 수정 솔루션을 준비 합니다.
    2. 트랩 솔루션 얼룩을 준비 합니다.
      1. 37 ° c.에 prewarm 이온된 수
      2. 1.5 mL microtube에 빠른 가닛 GBC 기본 솔루션의 100 µ L 및 나트륨 아 질산염 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 혼합 30 미 허가 부드러운 반전 하 여 2 분 동안 서 서 혼합물.
      3. 37 ° c 이온된 물 9 mL prewarm 단계 1.4.2.2, naphthol AS 비 인산 염 솔루션, 아세테이트 솔루션의 400 µ L 및 주석산 솔루션의 200 µ L의 100 µ L에서에서 빨리 가닛 diazotized GBC 기본 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.
      4. 37 ° c.에 물 욕조에 혼합 솔루션 얼룩 트랩을 유지
  5. 문화 매체의 트랩 활동 정량화 하기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
    1. 주석산 버퍼 (50 mL) 준비: 0.33 M L tartaric 산 성, 염기 0.33 M 나트륨 주석산의 48 mL의 2 mL 탈수. 4.9에 pH 값을 조정 합니다.
    2. 4-Nitrophenyl 인산 disodium (pNPP) 버퍼 (200 mL) 준비: 글리신의 1.502 g, MgCl2의 41 밀리 그램, ZnCl2, 27.2 mg 및 이온된 물 180 mL. 3 M NaOH와 10.4 pH 값 및 이온 물 200 mL을 볼륨을 조정 합니다.
    3. PNPP 버퍼 인산 가수분해 효소 기질 (한 96 잘 접시)에 대 한 준비: 인산 가수분해 효소 기질과 단계 1.5.2의 pNPP 버퍼의 175 µ L의 49.37 mg.
    4. 기판 버퍼 (9 mL/96 잘 접시) 준비: 이온된 수, 아세테이트 솔루션의 360 μ, 주석산 버퍼의 2.4 mL 6.24 mL. 소용돌이 의해 혼합 하 고 사용 하기 전에 37 ° C에서 예 열.
    5. 기판 혼합물 및 10에 대 한 소용돌이를 데워 기판 buffer(1.5.4)의 9 ml에 추가할 인산 가수분해 효소 substrate(1.5.3)와 pNPP 버퍼의 90 μ s.

2입니다. (주-1) 해 부

  1. CO2 3 1 달 오래 된 여성 WT 및 Ctsk 마우스를 별도로 안락사. 훈련 된 직원에 의해 적절 한 장비와 CO2 흡입을 수행 합니다.
  2. 6 마우스의 세균 오염을 방지 하기 다음 부정사 위치에 해 부 보드에 장소를 5 분 동안 75% 에탄올 (vol/vol) 100 mL를 비 커에 담가. 경골의 원심에 세로로 절 개를 확인 하 고 안과 위 뒷 다리를 따라 피부를 해 부.
  3. 고관절의 관절 인 대가 위로 잘라 고 트렁크에서 뒷 다리 사지를 탈 구.
  4. 무릎 관절의 관절 인 대를 절단 하 고 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 신중 하 게 끊을. 부드럽게가 위로 부드러운 조직을 제거 합니다.
  5. 얼음에 α-MEM의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트의 각 음에 한 마우스에 하나의 유전자의 모든 뼈를 배치 합니다.
    참고: 세포 생존 능력을 유지 하는 뼈는 미만 1 시간에 대 한 이러한 조건에서 유지 되어야 한다.

3입니다. 절연 (주-1)

  1. Α-MEM 매체 (3 mL)와 75% 에탄올 (3 mL) 6 잘 플레이트 한 우물 및 다른 5 웰 스 작성.
  2. 5 번 10 α-MEM 매체와 15 s 및 세척 뼈에 대 한 에탄올 세척에 한 유전자 형의 모든 뼈를 넣어 s 각 시간.
  3. 시저와 epiphyses에서 잘라내어 구멍 및 플러시 골 밖으로 50 mL 원심 분리기 관으로 α-MEM 매체와 0.45 m m 주사기 바늘을 삽입.
  4. 뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용 하 여 뼈 구멍을 플러시. 뼈는 창백한 될 때까지 철저 하 게 뼈 구멍을 씻어 두 번 이상 반복 합니다.
  5. 800 x g와 4 ° C 5 분 Aspirate는 상쾌한 셀 펠 렛을 얻기 위해 골 원심
  6. 원심 분리기 튜브와 골 수를 resuspend를 부드럽게 피 펫에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브 8 분 붉은 혈액 세포를 lyse 얼음에 계속.
  7. 세포 세포의 용 해를 막으려고 원심 분리기 튜브에 α-MEM 매체의 6 mL를 추가 합니다. G와 10 분 동안 4 ° C x 500에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
  8. Α-MEM 문화 매체의 3 ml에서 resuspend 고 셀 6 잘 플레이트 (일반적으로 하나의 마우스 잘 당) 합니다.
  9. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 밤새 품 어.

4입니다. 도금 (0 일)

  1. 15 mL 원심 분리기 튜브 다음날 아침 첨부 되지 않은 세포를 수집 하는 상쾌한 전송.
  2. G와 5 분 동안 4 ° C x 800 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
  3. Α-MEM 문화 매체의 4 mL에 resuspend.
  4. 셀 솔루션의 20 µ L 고 20 µ L Trypan 파랑의 혼합. 세 실로 혼합물의 10 µ L을 추가 하 고 솔루션의 mL 당 셀 수를 얻을.
  5. 500, 000 셀/mL의 셀 솔루션을 얻기 위해 α-MEM 문화 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
  6. 추가 500 µ L 골 대 식 세포 유도 매체의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
  7. 추가 500 µ L 셀 솔루션의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
  8. 3 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어.

5. 차별화 (3-7 일)

  1. 도금, 후 3 일 96 잘 접시의 각 우물에서 50 µ L 매체를 수집 하 고-20 ° C에서 동결 후 잔여 중간 발음.
  2. 추가 1 mL 및 100 µ L osteoclast 유도 매체는 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.
  3. 2 일 동안 37 ° C에서 품 어.
  4. 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 하 고 잔여 중간 발음.
  5. 각 우물에 osteoclast 유도 매체를 추가 합니다.
  6. 1 일 37 ° C에서 품 어.
    참고:이 시간 포인트에서 큰, multinucleated osteoclasts 보여야 한다 거꾸로 현미경 (그림 2A).
  7. Osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 유도 매체를 변경 하 고 osteoclasts 볼 수 있습니다 때까지 매일 관찰.
  8. Osteoclasts 형성 후 96 잘 접시의 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 합니다.

6. 주석산 얼룩 저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정)

참고: 성숙한 osteoclasts 생체 외에서 문화 (4 단계)의 6-7 일 후 존재할 수 있습니다.

  1. 중간 발음 하 고 부드럽게 1 x PBS로 3 회 세척.
  2. 30에 대 한 수정 프로그램 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 잘 셀 수정 실 온에서 s.
  3. 고정, 후 수정 솔루션을 발음 하 고 37 ° c.에 prewarmed 이온된 수 3 번 부드럽게 씻어 이온된 수 발음
  4. 96 잘 접시의 각 음에 트랩 얼룩의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 30 분 한 빛에서 방패는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. 얼룩, 후 발음 트랩 얼룩 하 고 부드럽게 이온된 물으로 3 회 세척.
  6. 이미지 osteoclasts 40 X 확대는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여.

7. 트랩 활동 부 량의 문화 매체

  1. 표면에 뜨는 30 µ L 문화 단계 5.1, 5.4, 5.8; 96 잘 접시의 각 우물에서 수집 비 경작 osteoclast 유도 매체의 30 µ L를 사용 하 여 부정적인 제어. 샘플을 새로운 96 잘 접시에 놓습니다.
  2. 96 잘 접시의 각 음에 기판 mixture(1.5.5)의 90 μ를 추가 합니다.
  3. 1 h와 빛 으로부터 방패에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  4. 96 잘 접시의 각 음에 3 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.
  5. 405의 파장에서 theabsorbance 측정 nm.

8. 서 부 럽

참고: 6-7 일 후 24-잘 접시에 생체 외에서 문화, 성숙한 osteoclasts 표시 되어야 합니다.

  1. 매체 발음
  2. 부드럽게 씻어 미리 PBS 3 시간 x 1 냉각.
  3. PBS 발음
  4. SDS 세포의 용 해 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1의 100 µ L를 추가 합니다.
  5. 10 분 동안 105 ° C에서 열 lysates 및 12000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 단백질을 포함 하는 supernatants 수집 합니다.
  6. Lysates 10 %SDS 페이지11 30 µ g의 단백질을 포함 하 고 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송 합니다.
  7. 30 분 동안 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 합니다.
  8. 반대로 랩 터, 안티-P-S6, S6 안티, 안티-β-말라 4 ° C에서 5% 탈지 우유에 1:1,000 희석 하룻밤에 막 품 어.
  9. 실 온에서 10 분 동안 Tris 버퍼 염 트윈 20 (TBST)와 함께 막 씻으십시오.
  10. 단계 8.9 두 번 반복 합니다.
  11. 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-실 온에서 1 h 5% 탈지 우유에 1:5,000 희석에 반대로 마우스 또는 토끼 IgG 항 체를 활용.
  12. 실 온에서 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막을 씻어.
  13. Chemiluminescent 탐지에 대 한 세포 막에 서쪽 chemiluminescent HRP 기질을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 초과 기판 배수와 x 선 필름에도 말을 폭로.

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Representative Results

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현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (그림 4A)에서 96 잘 접시의 각 우물에서 얻은 했다.

랩 터 의 삭제는 서쪽 더 럽 히 분석에 의해 확인 되었다, mTORC1의 비활성화는 S6 ribosomal 단백질 인 산화 (P-S6), mTORC1에 대 한 판독으로 널리 이용 되는 감소에 의해 결정 되었다 (그림 3).

트랩-긍정적인 osteoclasts 수 Ctsk BMMs WT 그룹 (그림 4A), 랩 터 결핍 osteoclast 형성 장애 표시와 비교에서 감소.

분 비 트랩의 활동은 중요 한 뼈 재흡수, 그리고 문화 매체에서 트랩 활동 현재 연구에서 분석 했다. 그림 4B같이 트랩 활동 WT에 Ctsk BMMs RANKL의 자극으로 인해 증가 했다. 또한, 트랩 활동 CtskBMMs 해당 WT 그룹에 비해 감소 (P < 0.05).

Figure 1
그림 1: osteoclast 유도 프로토콜의 회로도. BMMs 1 일에 고립 되었고 기본 α-MEM 매체와 알을 품을 하룻밤. 0 일에 BMMs 수집 되었고 96 잘 접시 24-잘 접시 10 ng/mL M-CSF와 α-MEM 매체 부 화 뒤에 도금. 3 일에 매체는 α-MEM 보통 20 ng/mL M-CSF와 20 ng/mL RANKL osteoclast 분화의 유도으로 변경 되었습니다. 5 일에 osteoclast 차별화 매체 변경 되었습니다. 6 일에 많은 osteoclasts 볼 수 있었고 osteoclast 분석 실험을 수행 했다. Osteoblasts 보이지 않았다, osteoclast 유도 매체 변경 되었습니다 하 고 인큐베이션 하루 더 계속. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: osteoclasts의 대표적인 보기. (A) 거 대 한 osteoclasts 하루 6에 밝은 분야에서 관찰. 빨간색 선은 osteoclasts 테두리 설명. (B)는 일반적으로 거 대 한, multinucleated, 트랩 긍정적인 (와인 레드) osteoclast. 검은색 화살표 표시 multinucleated osteoclast의 두 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: mTORC1 비활성화에 Ctsk BMMs. 당일 6 WT에 BMMs Ctsk 랩 터, P s 6와 S6 식의 분석을 더럽혀 서. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 랩 터 의 삭제 장애인 osteoclast 형성. (A) 트랩 6 일에 BMMs의 얼룩. WT Ctsk 그룹에 사각형의 높은 확대 이미지, 각각 표시 됩니다. 적은 거 대 한, 트랩 긍정적인 osteoclasts WT 그룹에 비해 Ctsk BMMs에서 형성 했다. (B) 트랩 활동 경작 WT 및 Ctsk BMMs. 데이터 대표 의미 ± S.D.* P < 0.05, n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.

이전 연구에서 BMMs는 절연14,15직후 도금 했다. BMMs 중간 엽 줄기 세포를 즉시 접시에 준수는 섬유 아 세포 BMMs를 분리 하는 도금 전에 하룻밤 기본 매체와 경작 했다 하는 것이 좋습니다. M-CSF osteoclast 선구자에 monocytes의 확산을 촉진 하 고 osteoclast 선구자 RANKL을 바인딩하고 성숙한 osteoclasts6,,1617의 형성을 유도 하는 순위를 표현 하기 위해 자극 수 있습니다. 따라서, 우리의 연구는 BMMs 했다 유도 10 ng/mL M-CSF osteoclast 유도 하기 전에 3 일 동안 함께 대신 osteoclast 유도15도금 후 두 번째 날에. 셀 밀도 osteoclast 형성 시험관에 대 한 중요 하다. 25000 BMMs 10 ng/mL M-CSF를 가진 3 일 외피에 의해 96 잘 접시 다음의 각 음에 시드 했다 하는 것이 좋습니다. 셀 합류에 80-90%에 도달 하면 RANKL의 osteoclast 유도 위한 적당 한 시간 이다. 일반적으로, 성숙 osteoclasts 형태에 주 6. 몇 osteoclasts에 대 한 가장 일반적인 이유는 시드 저밀도 또는 낮은 세포 생존 능력의 결과 수 있는 차선의 셀 밀도입니다. BMMs 섬세 한 기본 세포 고 부드럽게 처리 될 필요가 있다. 오랜 동안 얼음에 뼈를 유지 하거나 적극적으로 resuspending BMMs의 가능성을 감소 하 고 이후 osteoclasts의 형성을 손상. 따라서, 가능한 BMMs의 최적의 시드 밀도 osteoclasts의 많은 수를 얻기 위해 필수적입니다.

분 비 트랩의 활동은 osteoclastic 뼈 재흡수에 중요 합니다. 이 연구에서 우리는 양적 문화 매체에서 분 비 트랩 활동을 분석 하는 방법을 설명 합니다. 문화 매체에서 트랩 활동의 변화는 osteoclast 번호의 변경 또는 분 비 트랩 osteoclast 또는 둘 다의 조합에서 발생할 수 있습니다. 따라서, osteoclast 함수에서 분석 생체 외에서 osteoclast 재흡수 분석 결과 함께 설명 하는 이전18유용한 방법 수 있습니다.

mTOR은 세포 신진 대사와 차별화9를 통제할 수 있다 봤을 보존 단백질 키 니 아 제 이다. 이 연구에서 우리는 그 mTORC1 osteoclast 형성을 조절 하 여 뼈 재흡수에 중요 한 역할을 재생을 발견. mTORC1는 나중에 골다공증과 같은 뼈 대사 질환의 치료에 대 한 잠재적인 약리 대상 수 있습니다.

요약 하자면, osteoclast 유도 대 한 우리의 프로토콜 성공적으로 많은 수의 생체 외에서 거 대 한 osteoclasts 귀착되 고 우리의 데이터는 mTORC1 osteoclast 형성에 대 한 중요 한 제안.

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Disclosures

모든 저자 들은 관심의 없습니다 충돌 상태.

Acknowledgments

저자는 친절 하 게 제공 하는 시 약 및 마우스에 대 한 박사 Minghan 통 및 미 카토를 감사합니다. 우리는 유용한 토론 Zou 실험실의 구성원 감사. 이 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 973에서 9 사람들의 병원, 상해 Jiao 집게 대학의 학부의 임상 연구 프로그램은 중국 교육부의 과학 및 기술 (대부분) [2014CB964704, 2015CB964503]에서 프로그램. 세포 생물학 및 화학 생물학에 대 한 핵심 시설, 분자 세포 과학, 상하이 연구소 생화학 및 세포 생물학, 과학의 중국 아카데미의 우수성에 대 한 CAS 센터에 대 한 핵심 시설의 도움 주셔서 감사.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

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References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
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RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하
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Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

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