Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

doi: 10.3791/56468 Published: March 15, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Abstract

Osteoklastlar vardır benzersiz kemik-resorbing kemik iliği monosit/makrofaj soyundan hücre. Osteoklastlar disfonksiyon kemik metabolik hastalıkları, osteoporoz da dahil olmak üzere bir dizi neden olabilir. Patolojik kemik kayıplarının önlenmesi için ilaç hedefleri geliştirmek için hangi precursors Osteoklastlar ayırt mekanizmaları anlaşılması gerekir. Yeteneği yalıtmak ve çok sayıda Osteoklastlar vitro kültür Osteoklast ayrımında belirli genlere rolünün belirlemede önemlidir. İnactivation rapamycin karmaşık 1 (TORC1) Osteoklastlar içinde memeli/mekanik hedef Osteoklast kaç azaltın ve kemik kütlesi artırmak; Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, ayırmak ve fare kemik iliği dan Osteoklastlar kültür ve mTORC1 inactivation Osteoklast oluşumu üzerine etkisi çalışmaya RANKL tabanlı bir protokol açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, genellikle bir hafta içinde çok sayıda dev Osteoklastlar, başarıyla sonuçlandı. Raptor silinmesiyle Osteoklast oluşumu Engelli ve o mTORC1 Osteoklast oluşumu için kritik olduğunu belirten salgı tartarat dayanıklı asit fosfataz aktivitesini azalmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kemik değişen bir organdır ve dokusunu ve hayatı boyunca Osteoklastlar tarafından yenilenmiş. Osteoklastlar mineralize matris rezorpsiyonu için sorumlu ve dokusunu sentez ve yeni kemik matrisler1salgılar. Kemik rezorpsiyonu ve kemik oluşumu arasındaki dengeyi kemik bakım da dahil olmak üzere Kemik sağlığı için önemlidir kütle ve stimülasyon ve yaralanma yanıt. Bu denge bozulur, bir dizi metabolik kemik hastalıkları, Osteoporoz ve periodontal hastalıkları da dahil olmak üzere meydana gelebilir. Bu hastalıklar, kemik dokusunu2,3kapasite şekillendirme mediatörlerin kemik rezorpsiyonu kaynaklanan kemik kayıplarının aşıyor. Böylece, osteoporoz gibi iskelet bozuklukları tedavisinde ilaç hedefleri geliştirmek için üretimi ve Biyoloji Osteoklastlar4anlamak önemlidir.

Osteoklastlar benzersiz dev multinucleated hücreleri, veya kemik yüzeye yakın bulunan ve monosit/makrofaj aile1' e ait. Ibbotson K. J. vd. Osteoklast benzeri hücreler vitro ile 1,25-dihidroksi-vitamin D35içeren ortam oluşturmak için bir yöntem bildirdi. Makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve reseptör aktivatör nükleer faktör-κ B ligand (RANKL) için tanımlayıcısı Osteoklast oluşumu temel faktörler olarak osteoclastogenesis içinde vitro verimliliğini önemli ölçüde artmıştır 1 , 6 , 7. Kültür Osteoklastlar vitro yeteneği anlayışımız oluşturma ve düzenleme, Osteoklastlar geliştirdi.

Memeli/mekanik hedef iki yapısal ve işlevsel olarak ayrı kompleksleri, yani mTORC1 ve mTORC28,9' rapamycin (mTOR) fonksiyonların. İki çok protein kompleksleri onların farklı bileşenleri ve aşağı akım yüzeylerde nedeniyle birbirinden farklıdır. mTORC2 içerirken, rapamycin-duyarlı arkadaşı mTOR (Rictor)9mTORC1 mTOR (Raptor), benzersiz düzenleyici ilişkili protein içerir. mTORC1 entegre ve hücre büyümesi, yayılmasını önleme ve farklılaşma düzenleyen önemli sinyalleri iletmek. Son zamanlarda, biz bu mTORC1 mTORC1 Osteoklastlar10devre dışı bırakabilirsiniz için Raptor silinmesiyle tarafından katabolik kemik rezorpsiyonu ağ içinde önemli bir rol oynar gösterdi. Ancak, temel mekanizmaları daha fazla çalışma gerektirir. Bu da çalışmanın, Osteoklastlar kemik iliği türevi makrofajlar vahşi-tipi (WT) ve Ctsk Rap fareler (BMMs) oluşturmak ve mTORC1 inactivation Osteoklast üzerindeki etkisini incelemek için osteoclastogenic RANKL tabanlı yöntemi kullanıldı oluşumu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hayvanlarla ilgili tüm yordamlar Stanford idari Panel üzerinde laboratuvar hayvan bakım (APLAC) tarafından onaylanmış protokolüne göre gerçekleştirilen ve hayvan bakım ve kullanım Komitesi Shanghai Enstitüsü Biyokimya ve hücre tarafından kabul edildi Biyoloji.

1. hazırlık

  1. Osteoklast belirli Raptor silme fareler (Raptorfl/fl; oluşturmak Ctsk-cre, ahiret CtskRap) Ctsk-cre fareler ile Raptorfl/fl fareler çiftleşme tarafından. Bu çalışmada WT denetimi olarak Raptorfl/fl fare kullanın.
  2. Bir konteyner ile izole kemik tutmak için buz var.
  3. Kültür ortamı hazırlamak.
    1. α-MEM kültür orta minimum temel orta alfa (α-MEM) 1 x glutamin, penisilin-streptomisin ve % 10 fetal buzağı serum ile ilave olarak hazırlayın.
    2. α-MEM orta ve M-CSF 50 mL 20 ng/mL oluşan kemik iliği makrofaj indüksiyon orta hazırlayın.
    3. M-CSF ve RANKL 20 ng/mL sırasıyla, α-MEM orta 50 mL oluşan Osteoklast indüksiyon orta hazırlayın.
  4. Aşağıdaki arabellekleri tuzak boyama önce hazırlayın.
    1. Aseton, 2.5 mL sitrat çözüm ve 0.8 mL % 37 (vol/vol) formaldehit çözeltisi mL 6.5 oluşan düzeltme çözüm hazırlamak.
    2. Çözüm boyama tuzak hazırlayın.
      1. Deiyonize su ile 37 ° c prewarm
      2. 100 µL hızlı garnet GBC temel çözüm ve sodyum nitrit çözeltinin 100 µL 1.5 mL microtube ve 30 s. bırakmak için nazik INVERSION tarafından 2 min için stand karışımı karıştırın.
      3. Prewarm 9 mL deiyonize su ile 37 ° c Diazotized hızlı garnet GBC temel çözüm 200 µL adım 1.4.2.2, 100 µL naftol AS-BI fosfat çözüm, 400 µL asetat çözüm ve 200 µL tartarat çözüm ekleyin.
      4. Bir su banyosu 37 ° C'de çözümde karışım boyama tuzak tutmak
  5. TUZAK etkinlik miktar kültür ortamının önce aşağıdaki arabellek hazırlayın.
    1. Tartarat arabellek (50 mL) hazırlamak: 0,33 M L tartarik asit, 0,33 M sodyum tartarat dibasic 48 mL 2 mL kurutmak. 4,9 pH değerine ayarlayın.
    2. 4-Nitrophenyl fosfat disodyum (pNPP) arabellek (200 mL) hazırlamak: 1.502 g glisin, 41 mg MgCl2, ZnCl227.2 mg ve 180 mL deiyonize su. 10,4 ile 3 M NaOH pH değerine ve 200 mL deiyonize su ile birime ayarlayın.
    3. PNPP arabellek fosfataz substrat ile (bir 96-şey plaka) hazırlamak: 49.37 mg fosfataz substrat ve pNPP arabelleği adım 1.5.2 175 µL.
    4. Substrat arabellek (9 mL/96-iyi plaka) hazırlamak: 6,24 mL deiyonize su, asetat çözüm 360 μL ve tartarat arabellek 2.4 mL. Gönderen Vortex mix ve kullanımdan önce 37 ° C'de ısıtın.
    5. 9 ml substrat karışımı ve 10 için girdap yapmak için Önceden ısıtılmış substrat buffer(1.5.4) fosfataz substrate(1.5.3) ile pNPP tamponunun 90 μL eklemek s.

2. diseksiyon (gün -1)

  1. 3 aylık bir kadın WT ve RapCtsk fareler CO2 tarafından ayrı ayrı ötenazi. CO2 inhalasyon eğitimli personel tarafından uygun ekipman ile gerçekleştirin.
  2. Bir ölçek ile % 75 etanol (vol/vol) bakteriyel kontaminasyonu önlemek ve daha sonra sırtüstü pozisyonda bir diseksiyon tahtada yer 5 min için 100 mL 6 fare bırakın. Bir kesik dikey olarak tibia distal yapmak ve arka bacak boyunca cilt oftalmik makasla incelemek.
  3. Kalça eklemi eklem bağ makasla kesme ve hind bacaklarda bagajdan yerinden çıkar.
  4. Diz eklem eklem bağ kesilmiş ve dikkatle diz eklemi üzerinden femur ve tibia ilişkisini kaldır. Yavaşça yumuşak doku makasla çıkarın.
  5. Bütün kemikleri tek bir fare bir genotip içinde altı iyi bir tabak her şey α-MEM buz üzerinde 2 mL ile yerleştirin.
    Not: hücre canlılığı korumak için kemik az 1 h için bu koşullarda tutulmalıdır.

3. yalıtım (gün -1)

  1. Bir altı-şey plaka % 75 etanol (3 mL) ile bir kuyu ve diğer 5 kuyuları α-MEM orta (3 mL) ile doldurun.
  2. 5 kere α-MEM orta 10 ile 15 s ve yıkama kemikler için etanol yıkama bir genotip tüm kemikleri koymak lar her zaman.
  3. Epifizleri makas ile kesti ve kemik boşluğu ve floş iliğini α-MEM orta içine 50 mL santrifüj tüpü ile 0,45 mm şırınga iğne yerleştirin.
  4. Kemik diğer ucundan aynı yöntemi kullanarak kemik boşluğu floş. En az iki kez kemik soluk olana kemik boşluğu iyice yıkamak için yineleyin.
  5. Bir hücre Pelet vasıl 800 x g ve 4 ° C 5 dk. aspiratı süpernatant elde etmek için kemik iliği santrifüj kapasitesi.
  6. Kırmızı kan hücre lizis arabellek 3 mL santrifüj tüpü ve pipet yavaşça kemik iliği resuspend ekleyin. Santrifüj tüpü için kırmızı kan hücreleri parçalayıcı için 8 dakika buzda tut.
  7. α-MEM orta 6 mL hücre lizis durdurmak için santrifüj tüpüne ekleyin. 500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  8. 3 mL α-MEM kültür orta resuspend ve hücreleri bir altı-şey plaka (genellikle bir fare iyi başına) içine yerleştirin.
  9. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.

4. kaplama (0 gün)

  1. Süpernatant ertesi sabah ekli olmayan hücreleri toplamak için 15 mL santrifüj tüpü aktarın.
  2. 800 g ve 5 min için 4 ° C x santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
  3. 4 mL α-MEM kültür orta resuspend.
  4. Hücre çözümü 20 µL alıp Trypan mavi 20 µL ile karıştırın. Karışımı 10 µL sayım odasına ekleyin ve çözüm mL başına hücre sayısı elde edilir.
  5. Uygun bir birim olarak 500.000 hücre/mL hücre çözümü elde etmek için α-MEM kültür ortamının ekleyin.
  6. 500 µL ve kemik iliği makrofaj indüksiyon orta 50 µL 24-şey plaka ve 96-şey plaka, her kuyuya sırasıyla ekleyin.
  7. 500 µL ve hücre çözümü 50 µL 24-şey plaka ve 96-şey plaka, her kuyuya sırasıyla ekleyin.
  8. %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 3 gün kuluçkaya.

5. farklılaşma (3-7 gün)

  1. Üç gün sonra kaplama, 96-iyi-plaka her kuyudan 50 µL orta toplamak ve -20 ° C'de dondurmak ve kalan orta Aspire edin.
  2. 1 mL ve 100 µL Osteoklast indüksiyon orta 24-şey plaka ve 96-şey plaka her kuyuya sırasıyla ekleyin.
  3. 37 ° C de 2 gün kuluçkaya.
  4. Orta 50 µL her kuyudan toplamak ve kalan orta Aspire edin.
  5. Osteoklast indüksiyon orta her kuyunun içine ekleyin.
  6. 37 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.
    Not: Bu zaman noktada, ters bir mikroskop altında (şekil 2A) büyük, multinucleated Osteoklastlar görülmelidir.
  7. Osteoklastlar görülmez, Osteoklast indüksiyon orta değiştirmek ve Osteoklastlar görülmektedir kadar her gün gözlemlemek.
  8. Osteoklastlar oluşmuş sonra orta 50 µL 96-şey plaka her kuyudan toplamak.

6. tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) Boyama

Not: Olgun Osteoklastlar vitro kültür (Adım 4) 6-7 gün sonra mevcut olabilir.

  1. Orta Aspire edin ve yavaşça 3 kez 1 x PBS ile yıkayın.
  2. Hücreleri 96-şey plaka her şey 100 µL 30 için düzeltme çözümü ile fix s, oda sıcaklığında.
  3. Fiksasyon sonra düzeltme çözüm Aspire edin ve yavaşça 37 ° C'ye prewarmed deiyonize su ile 3 kez yıkamak Deiyonize su Aspire edin.
  4. TUZAK leke 96-şey plaka her kuyuya 100 µL ekleyin ve kuluçka 37 ° C'de 30 dk ve ışık kalkan plaka yer.
  5. Boyama sonra tuzak leke Aspire edin ve yavaşça 3 kez deiyonize su ile yıkayın.
  6. 40 X büyütme oranında ters bir mikroskop kullanarak görüntü Osteoklastlar.

7. tuzak etkinlik Quantification kültür ortamının

  1. 30 µL kültür süpernatant her şey 96-şey plaka adım 5.1, 5.4 ve 5,8 toplamak; Kültürlü Osteoklast indüksiyon orta 30 µL negatif kontrol kullanın. Örnekleri yeni bir 96-şey tabağına yerleştirin.
  2. Substrat mixture(1.5.5) 90 μL 96-şey plaka her kuyunun içine ekleyin.
  3. Plaka 37 ° C'de bir kuluçka 1 h ve ışık kalkan için yerleştirin.
  4. Reaksiyon 96-şey plaka her kuyuya 50 µL 3 M NaOH ekleyerek durdurmak.
  5. Ölçmek theabsorbance, dalga boyu 405 nm.

8. Batı kurutma

Not: vitro kültür 24-şey plaka 6-7 gün sonra olgun Osteoklastlar görünür olmalıdır.

  1. Orta Aspire edin.
  2. Yavaşça önceden soğutulmuş 1 x PBS 3 kere yıkayın.
  3. PBS Aspire edin.
  4. 1 SDS lizis arabellek içeren proteaz inhibitörü kokteyl x 100 µL ekleyin.
  5. Isı lysates 105 ° c 10 dakika ve 10 dakika süreyle santrifüj 12.000 × g ve 4 ° C protein içeren supernatants toplamak.
  6. % 10 SDS-sayfa11 tarafından 30 µg protein içeren lysates ayırın ve sonra bir polivinilidin florid (PVDF) membran aktarın.
  7. %5 30 dk için yağsız süt ile membranlar engelleyin.
  8. Membranların Anti-Raptor, anti-P-S6, anti-S6, anti-β-aktin, gecede 1:1,000 seyreltme 4 ° C'de % 5 yağsız süt ile kuluçkaya.
  9. Tris tamponlu tuz ile ara-20 (TBST) ile membranlar 10 dakika oda sıcaklığında yıkayın.
  10. Adım 8,9 iki kez tekrarlayın.
  11. Membranlar horseradish peroksidaz (HRP) ile kuluçkaya-Anti-fare ya da tavşan IgG antikorlar 1:5,000 seyreltme oda sıcaklığında 1 h için %5 yağsız süt, Birleşik.
  12. Membranlar 3 kez ile TBST 10 dk için oda sıcaklığında yıkayın.
  13. Chemiluminescent algılama için Batı chemiluminescent HRP substrat membranlar ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Fazla yüzey drenaj ve röntgen film açıkları ortaya çıkarmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mevcut iletişim kuralını kullanarak, çok sayıda dev Osteoklastlar gün 6 görüldü; Dev Osteoklastlar görülmez, bir gün daha Osteoklast farklılaşma olabilir (şekil 1) gerekli. Başarılı Osteoklast oluşumu (şekil 2A) Boyama tuzak tarafından doğrulandı. Osteoklastlar 3'ten fazla çekirdeği dev şarap kırmızı/mor hücrelerle vardı. 250'den fazla Osteoklastlar WT BMMs (şekil 4A) 96-şey plaka her şey elde edilmiştir.

Silme işlemini Raptor olduğunu doğruladı tarafından western Blot analizi ve mTORC1 inactivation ribozomal protein S6 fosforilasyon (P-S6), okuma mTORC1 için yaygın olarak kullanılan bir düşüş tespit edildi (Resim 3).

Raptor eksikliği Osteoklast oluşumu engelliler gösterilen WT grup (şekil 4A), ile karşılaştırıldığında RapCtsk BMMs içinde tuzak-pozitif Osteoklastlar sayısı azalmıştır.

Salgı tuzak etkinlik kemik rezorpsiyonu için önemlidir ve tuzak etkinlik kültür ortamında çalışmanın analiz edildi. Şekil 4B' de gösterildiği gibi tuzak etkinlik RANKL WT ve Ctsk Rap BMMs uyarılması nedeniyle artmış. Buna ek olarak, tuzak etkinliği azalmıştır karşılık gelen WT grubuyla karşılaştırıldığında RapCtskBMMs içinde (P < 0,05).

Figure 1
Şekil 1: şematik diyagramı Osteoklast indüksiyon protokolü. BMMs 1 gün izole ve gecede temel α-MEM orta ile inkübe edildi. Gün 0, BMMs toplanmış ve 96-şey plaka ve kuluçka 10 ng/mL M-CSF ile α-MEM ortamda ardından 24-şey plaka üzerine kaplama. 3 günde orta α-MEM orta 20 ng/mL M-CSF ve 20 ng/mL RANKL Osteoklast farklılaşma indüksiyon için ile değiştirildi. 5 günde Osteoklast farklılaşma orta değiştirildi. Gün 6, çok sayıda Osteoklastlar görünür ve Osteoklast deneyleri gerçekleştirilmiştir. Eğer dokusunu görünür değildi, Osteoklast indüksiyon orta değiştirildi ve kuluçka bir gün daha devam etti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Osteoklastlar temsilcisi görünümünü. (A)dev Osteoklastlar gözlenen parlak alanında gün 6. Kırmızı çizgi Osteoklastlar kenarlığını sıraladı. (B) A genellikle dev, multinucleated, tuzak pozitif (şarap kırmızı) Osteoklast. Siyah oku multinucleated Osteoklast iki çekirdekleri belirtti. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: mTORC1 inactivation Ctsk Rap BMMs. Western Blot analizi Raptor, P-S6 ve S6 deyimde WT ve Ctsk Rap BMMs gün 6. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Raptor silinmesiyle Osteoklast oluşumu Engelliler. (A) tuzak BMMs gün 6 boyama. Yüksek büyütme görüntüleri WT ve Ctsk Rap grupları kareler gösterilir, anılan sıraya göre. WT grubu ile karşılaştırıldığında Ctsk Rap BMMs oluşan dev, daha az tuzak olumlu Osteoklastlar vardı. (B) tuzak etkinliği kültürlü WT ve Ctsk Rap BMMs. veri temsil anlamına gelir ± S.D.* P < 0,05, n = 3. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Osteoclastogenic tahlil yalıtmak ve Osteoklastlar vitro12,13kültür için en çok kullanılan yöntemdir. Ise birkaç RANKL tabanlı Osteoklast indüksiyon açıklanan13,14,15olabilirdi, bu da çalışmanın bir iletişim kuralı önceki yöntemleri üzerinde temel bazı değişikliklerle nitelendirdi.

Önceki çalışmada, BMMs hemen yalıtım14,15sonra kaplama. Biz BMMs temel orta gece önce BMMs Mezenkimal Kök hücre ve hemen yemek için uygun fibroblastlar yalıtmak için kaplama ile kültürlü önerilir. M-CSF monosit Osteoklast öncüleri için yayılması teşvik ve Osteoklast öncüleri RANKL bağlar ve olgun Osteoklastlar6,16,17oluşumuna neden olmaktadır sırası ifade etmek için teşvik. Bu nedenle, bizim çalışmada, BMMs 10 ng/mL M-CSF Osteoklast indüksiyon önce 3 gün ile bunun yerine Osteoklast indüksiyon15kaplama sonra ikinci gün için indüklenen. Hücre yoğunluğu Osteoklast oluşumu içinde vitroiçin önemlidir. 25.000 BMMs tarafından 3 gün kuluçka 10 ng/mL M-CSF ile bir 96-şey plaka aşağıdaki her kuyuya seribaşı önerilir. Hücre izdiham % 80-90'ı görünce RANKL Osteoklast indüksiyon için uygun bir zamanı. Genellikle, Osteoklastlar form üzerinde gün 6 olgun. Kaç Osteoklastlar en yaygın nedeni düşük tohumlama yoğunluğu veya düşük hücre canlılığı sonucu olabilir suboptimal hücre yoğunluğu var. BMMs hassas Primer hücre ve hafifçe tedavi edilmesi gerekir. Kemik buz üzerinde uzun süre tutmak ya da şiddetle resuspending BMMs canlılığı azaltır ve daha sonra Osteoklastlar oluşumunu azaltır. Böylece, uygun BMMs en iyi tohum yoğunluğu çok sayıda Osteoklastlar elde etmek için önemlidir.

Salgı tuzak mediatörlerin kemik rezorpsiyonu için kritik bir faaliyettir. Bu çalışmada, salgı tuzak faaliyet kültür orta kantitatif analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. TUZAK faaliyet kültür ortamında değişiklik değişiklikler Osteoklast sayının veya Osteoklast veya her ikisinin birleşimini salgı tuzak neden olabilir. Böylece, bu Osteoklast işlevi vitro Osteoklast rezorpsiyonu tahlil ile birlikte analiz daha önce açıklanan18için yararlı bir yöntem olabilir.

mTOR hücre metabolizması ve farklılaşma9düzenleyen bir evrimsel korunmuş protein kinaz var. Bu çalışmada, bulduğumuz o mTORC1 Osteoklast oluşumu düzenleyerek kemik rezorpsiyonu içinde önemli bir rol oynadı. mTORC1 kemik metabolizması bozuklukları Osteoporoz gibi tedavisi içinde belgili tanımlık gelecek için potansiyel bir farmakolojik hedef olabilir.

Özetle, bizim protokol Osteoklast indüksiyon için başarılı bir şekilde çok sayıda dev Osteoklastlar vitro sonuçlandı ve o mTORC1 Osteoklast oluşumu için önemlidir bizim verileri göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ellerinde devlet.

Acknowledgments

Dr. Minghan Tong ve S. Kato yazarlar nazikçe sağlayan reaktifler ve fareler için teşekkür ederiz. Biz yararlı tartışmalar Zou laboratuvar üyeleri teşekkür ederim. Bu eser kısmen hibe tarafından desteklenmiştir 973 Çin Bakanlığı bilim ve Teknoloji (çoğu) [2014CB964704 2015CB964503], 9 insanların Hastanesi, Shanghai Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi klinik araştırma programı Program. Hücre biyolojisi ve çekirdek tesis Kimya Biyoloji, moleküler hücre bilim, Shanghai Enstitüsü biyokimyası ve hücre biyolojisi, Çin Bilimler Akademisi mükemmelliği CAS merkezi çekirdek tesis yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Raptorfl/fl mice The Jackson Laboratory 013188
Ctsk-cre mice a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan
α-MEM Corning 10-022-CVR
Glutamine Gibico 25030081
Penicillin streptomycin Gibico 15140122
Fetal calf serum BioInd 04-001-1A
Recombinant mouse M-CSF protein R&D Q3U4F9
Recombinant mouse RANKL protein R&D Q3TWY5
RBC lysis buffer Beyotime C3702
Trypan blue Sigma-Aldrich 302643
Acetone Shanghai Chemical Co. Ltd.
Citrate solution Sigma-Aldrich 915
Formaldehyde solution Shanghai Chemical Co. Ltd.
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit Sigma-Aldrich 387A-1KT
Fast Garnet GBC Base solution Sigma-Aldrich 3872
Sodium Nitrite Solution Sigma-Aldrich 914
Naphthol AS-BI Phosphate Solution Sigma-Aldrich 3871
Acetate solution Sigma-Aldrich 3863
Tartrate solution Sigma-Aldrich 3873
Dulbecco's phosphate-buffered saline Corning 21-031-CVR
L-tartaric acid Sigma-Aldrich 251380
Sodium tartrate dibasic dehydrate Sigma-Aldrich s4797
Glycine Shanghai Chemical Co. Ltd.
MgCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
ZnCl2 Shanghai Chemical Co. Ltd.
NaOH Shanghai Chemical Co. Ltd.
Phosphatase substrate Sigma-Aldrich P4744
anti-Raptor Cell Signaling Technology 2280
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) Cell Signaling Technology 2317
anti-ribosomal protein S6 Cell Signaling Technology 2211
anti-β-actin Santa Cruz Biotechnology sc-130300
37% formaldehyde Xilong scientific
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane Bio-Rad
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) Millipore 00000367MSDS
IX71 Olympus
Envision Perkin Elmer
0.45-mm Syringe
Scissor
Mosquito forcep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423, (6937), 337-342 (2003).
  2. Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
  3. Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
  4. Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28, (4), 711-722 (2013).
  5. Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99, (2), 471-480 (1984).
  6. Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, (2), 165-176 (1998).
  7. Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272, (40), 25190-25194 (1997).
  8. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (1), 21-35 (2011).
  9. Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12, (4), 487-502 (2007).
  10. Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292, (1), 196-204 (2017).
  11. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press. (1989).
  12. Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
  13. Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
  14. Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
  15. Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
  16. Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (7), 3540-3545 (1999).
  17. Underwood, J. C. From where comes the osteoclast? J Pathol. 144, (4), 225-226 (1984).
  18. Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (21), 8173-8178 (2012).
Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).More

Dai, Q., Han, Y., Xie, F., Ma, X., Xu, Z., Liu, X., Zou, W., Wang, J. A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation. J. Vis. Exp. (133), e56468, doi:10.3791/56468 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter