Summary
Denne protokollen beskriver ulike teknikker nødvendig for overføring elektronmikroskop inkludert negative flekker, supertynn snitting for detaljert struktur og immun-gull merking for å bestemme plasseringen av spesifikke proteiner i exosomes.
Abstract
Exosomes er nano-størrelse ekstracellulære blemmer utskilles av kroppsvæsker, og er kjent som representerer egenskapene til celler det avsondre dem. Innholdet og morfologi av secreted blemmer gjenspeile cellen atferd eller fysiologiske status, for eksempel cellevekst, migrasjon, cleavage og død. Exosomes' rolle kan svært avhengig av størrelse og størrelsen på exosomes varierer fra 30 til 300 nm. Den mest brukte metoden for exosome imaging er negativ flekker, mens andre resultater er basert på Cryo-overføring elektronmikroskop og skanning elektronmikroskop Atomic Force mikroskopi. Den typiske exosome morfologi vurdert gjennom negative flekker er en kopp-form, men ytterligere detaljer er ikke ennå klar. En exosome godt karakterisert gjennom strukturelle studien er nødvendig spesielt i medisinske og farmasøytiske. Derfor må funksjon-avhengige morfologi verifiseres av elektronmikroskop teknikker som merking et bestemt protein i detaljert strukturen i exosome. For å observere detaljert struktur, ble supertynn valgte bilder og negative farget bilder av exosomes sammenlignet. I denne protokollen foreslår vi overføring elektronmikroskop for avbilding av exosomes inkludert negative flekker, hele mount immuno-flekk, blokk forberedelse, tynne delen og immun-gull merking.
Introduction
Ekstracellulære blemmer (EVs) er lipid bilayer blemmer utskilles av celler, og deres størrelse varierer mellom 30 og 300 nm. EVs ble først rapportert i 1978 med bevis fra blemmer av pasienter med Hodgkins sykdom1. Disse vesikler ble rapportert å være 40 til 120 nanometer i størrelse. I 1980 ble det rapportert at EVs er involvert i koagulasjonssystemet og blodpropp, dannelse av blodpropp i en blodåre i kreft pasienter2. Etter 30 år, er EVs rapportert å være en viktig faktor å fremme svulst invasjon, immun rømme og angiogenese3. Dessuten, har funksjonene til EVs studert som regulatorer i mobilnettet interaksjoner i områder av betennelse, immune disorder, nevrologisk sykdom og kreft4. Siden EVs inneholder bestemte biomolecules som protein, mRNA og microRNA5, har deres potensielle programmet i diagnostikk og therapeutics vært analysert6,7. EVs er en kategori består av undergrupper inkludert exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes og exosome som blemmer, avhengig av mobilnettet opprinnelse og biologisk funksjon3. I tillegg kan basert på deres biogenesis, disse EVs deles inn i microvesicles (skur microvesicles, 100-1000 nm) og exosomes (30-300 nm)8,9. Blant disse, har exosome blitt rapportert som en celle kommunikator for immunforsvaret10, kreft11,12og smittsomme sykdommer13.
Interesse i exosomes som en biomarkør for tidlig diagnostisering øker raskt, og rensing og karakterisering av exosomes må ledsages med molekylær Bildeteknikker. Ulik størrelse og morphologies av exosomes, avhengig av deres opprinnelse og funksjonen14, kan være preget av mikroskopi teknikker med høy oppløsning, for eksempel elektronmikroskop. De fleste exosomes var visualisert ved negative farget overføring elektronmikroskop (TEM)15,16,17, og disse resultatene ble bekreftet av immunolabeling av et bestemt protein i hele mount vesicle 18. flere forskningsgrupper har rapportert strukturen gjennom skanning elektronmikroskop, Atomic Force mikroskopi19,20og Cryo-TEM21,22. Men mens disse teknikkene er nyttige for å studere exosome strukturen, er de ikke nok for å observere plasseringen av spesifikke proteiner ligger inne på exosome. Derfor innført vi en protokoll for imaging exosomes med et bestemt protein merking. Vi brukt blokk forberedelse, supertynn snitting og immunostai-for konstatere protein's detaljert beliggenhet i exosome. Dette ble sammenlignet med negative flekker og hele mount immunostai-, som tradisjonelt brukes for karakteristikk av exosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kvartal forberedelse, skjæring, flekker og Imaging av Exosome
- Pellets exosomes fra kultur nedbryting av HCT116 celler med sentrifugering 100.000 x g for 1,5 t23. Fjerne kulturen supernatant og nøye løse renset exosome pellets med 1 mL 2,5% glutaraldehyde i 0.1 M natrium cacodylate løsning (pH 7.0) 1t på 4 ° C. For 0.1 M natrium cacodylate, løses 4,28 g cacodylic syre i 160 mL destillert vann (DW). Justere pH 7,4 med 0,1 M HCl gjør deretter opp til 200 mL med destillert vann.
- Fjern bindemiddel og skyll pellets med 1 mL av 0.1 M natrium cacodylate buffer ved romtemperatur. Repeter tre ganger med hver endring varer 10 min.
- Etter fikse prøvene med 1 mL av 2% Osmium tetroxide 1t på 4 ° C.
- Fjern bindemiddel og skyll tre ganger med 0.1 M natrium cacodylate buffer hvert 10 min.
- Inkuber i 10 min med en gradert aceton serie (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, henholdsvis) på shaker.
- Fjern aceton og ruge løsning av 3:1 aceton: lav viskositet innebygging blanding i 30 min. Exosome pellets er i røret.
- Fjerne mediet legge til 1:1 aceton: lav viskositet innebygging blanding medium, og ruge i 30 min.
- Fjerne mediet legge 1:3 aceton: lav viskositet innebygging blanding medium, og ruge i 30 min.
- Fjerner mediet og legge 100% lav viskositet innebygging blanding og ruge over natten i romtemperatur.
- Bygge inn prøven i ren lav viskositet innebygging blanding med innebygging mold og bake for 24 h på 65 ° C.
- Forberede deler med 60 nm tykkelse gjennom en ultra-mikrotomen.
- Dobbel-flekk med 2% uranyl acetate for 20 min og føre citrate i 10 min.
Reynolds bly løsning legge 1,33 g av bly nitrat og 1.76 g natriumsitrat totalt 50 mL destillert vann. - Observere rutenettet under overføring elektronmikroskop på 80 kV.
- Klikk "Hent" og deretter "File" og "Lagre som" i CCD Kamerasystemet under elektron mikroskop på 80 kV. Følg automatiske innstillinger for eksponeringstid.
2. Immuno-farging av seksjoner og bildebehandling (figur 1)
- Skjær 60 nm ultrathin seksjoner med en ultra-mikrotomen, og samle på nikkel rutenettet.
- Inkuber rutenettene i 50 µL dråper 0.02 M glysin for 10 min å slukke gratis aldehyd grupper.
- Skyll i 100 μL DW tre ganger hver for 10 min. Incubate ved romtemperatur 1t i PBS med 1% BSA.
- Inkuber rutenettene i 50-100 µL dråper anti KRS antistoff24 (1: 100 i PBS med 0,1% BSA) 1t (om nødvendig, dette trinnet skal utføres på 4 ° C over natten.)
- Vask rutenett med fem separate dråper (50 µL) på PBS med 0,1% BSA i 10 min.
- Overføre rutenett til dråper 2nd antistoff 1t (anti-kanin IgG konjugert til 10 nm gull partikler (1: 100) i PBS med 0,1% BSA).
- Vask rutenett med fem separate dråper (50 µL) PBS med 0,1% BSA hver 10 min.
- Dobbel-flekk med 2% uranyl acetate for 20 min under mørke forhold og Reynolds bly citrate for 10 min, henholdsvis.
- Klikk "Hent" og deretter "File" og "Lagre som" i CCD Kamerasystemet under en TEM på 80 kV. Eksponeringstid fulgte automatiske innstillinger.
Figur 1: eksempel forberedelse og immunostai-. (A) dobbel fast exosome er dehydrert og infiltrert med lav viskositet innebygging blanding harpiks. (B) harpiks innebygging. (C) ultratynne delen med diamant kniv. (D) oppsett for Immuno-gull merking. Rutenett med delene ultrathin er satt på de flytende dråpene på en parafilm, som er plassert med våt tørkepapir. Hver del er ruges med dråper 50-100 µL antistoff, deretter vasket med buffer. (E) dobbel flekker med uranyl acetate og føre citrate. Lokket er dekket med aluminiumsfolie til heavy metal farging. (F) flekker løsningen er fjernet av filter papir. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
3. negative flekker
- Glød-utslipp de tynne formvar/karbon filmdrasjerte 200 mesh kobber EM rutenettene for 1 min av glød discharger.
- Fastsette renset exosomes med 1 mL av 2% Paraformaldehyde (PFA) i 5 min.
Forsiktig: Paraformaldehyde gasser er giftige. Alt arbeid bør gjøres i ventilert avtrekksvifte. - Last 5-7 µL exosome suspensjonen løsning på nettet og ruge for 1 min. Hvis konsentrasjonen av exosome er for høy, fortynne konsentrasjonen til 1/2 - 1/5.
- Umiddelbart flekk med ~ 20 dråper filtrerte 1% uranyl acetate (UA) løsning på overflaten av EM rutenettet av sprøyte.
- Fjern overflødig UA løsningen på nettet ved å kontakte rutenettet kanten med filter papir.
- Raskt skyll rutenettet med en dråpe vann. Dette trinnet fjerner overflødig flekker løsningen.
- Plasser rutenettet på bordet ved å holde med pinsett, og dekke rutenettet delvis med en kultur parabol tørke 10 min under romtemperatur.
- Lagre rutenettet i en EM rutenett for for fremtidige observasjon av en TEM på 80 kV.
4. hele Mount for Immunostaining
- Glød-utslipp tynne formvar/karbon filmen belagt 200 mesh kobber EM rutenett for 30 s.
- Fastsette renset exosomes med 1 mL av 2% Paraformaldehyde (PFA) i 5 min.
Forsiktig: Paraformaldehyde gasser er giftige. Alt arbeid bør gjøres i ventilert avtrekksvifte. - Last 5-7 µL fast exosome løsning på rutenettet og ruge for 5 min. skyll med 100 µL av PBS tre ganger hver for 10 min.
- Behandle rutenett med 50 µL av 0,05 M glysin for 10 min å slukke gratis aldehyd grupper.
- Overføre rutenett til en dråpe blokkerer buffer (PBS med 1% BSA) for 30 min.
- Inkuber rutenett med 50-100 µL anti PD-L1 antistoff (1: 100 i PBS med 0,1% BSA) 1t (om nødvendig, dette trinnet skal utføres på 4 ° C over natten).
- Vask rutenett med fem separate dråper (50 µL) på PBS med 0,1% BSA i 10 min.
- Overføre rutenettet til en dråpe 2nd antistoff 1t.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Foreløpig er exosomes klassifisert i størrelse og form kategorier av overføring elektronmikroskop. Figur 2 viser negative farget exosome og immun-merket exosome i hele mount status. Figur 3 viser valgte exosome og immun-merket exosomes etter tynn snitting. Immuno-gull farging med antistoffer spesifikke proteiner brukes å positiv identifisere en exosome og klassifisere typen proteiner i exosome. Protokollen i dette dokumentet bruker hele mount immunostai- og immunostai-med plast delt exosome.
Figur 2: Negative flekker og hele mount immuno-flekk. (A) Exosome morfologi er observert av negative flekker. Exosomes viser sine kopp morfologi. (B, C) Hele mount immuno-gull farging viser bestemt protein (anti menneskelige CD274; PD-L1) i exosome. Hvite pilene viser plasseringen av gull. Svarte piler indikerer plasseringen av bakgrunnen. (D) negativ kontroll over immunostai-resultatet. Isotype kontroll ble brukt av primære antistoff immunostai-prosessen. Skala bar = 100 nm.
Figur 3: elektron mikroskop-bilde av delt exosomes. (A) Exosomes' rund form morfologi. (B) innestengt exosome bruke verktøyet "boxer" i EMAN programmet. (C, D) Immuno-gull merket exosome med heavy metal flekker. Svarte piler indikerer gull partikler (A-D) skala bar = 100 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen presenterer en protokoll for å observere det detaljert exosome struktur og merking av sine spesifikke proteiner. Negativ flekker har vært ansett som den beste metoden for exosome imaging17. Denne konvensjonelle teknikken vist exosomes' cup-formet struktur. Men er denne kopp form en form for gjenstanden som kan skyldes tørkeprosessen. Cryo-TEM resultatene har vist at exosomes har en perfekt sfærisk struktur i vandig løsning25,26. Cryo-TEM teknikken er en meget kraftfull metode for å undersøke den naturlige strukturen, men det er vanskelig å bruke metoden immuno-gull. Raso og kolleger påpekt tørke i det tradisjonelle metoden (hele mount-negativ flekker metoden) resulterte i en kopp morfologi. I denne studien standardmetoden for cellen forberedelse (rutinemessig EM, fiksering, dehydrering, innebygging og skjæring) ble brukt til å redusere exosome tørking virkning. Rutinen EM bruker plast innebygging kan unngå eller redusere gjenstander (endringer i volum og form) skyldes rødsprit. For kjemiske fiksering, ble glutaraldehyde (GA) brukt for den cross-linking (kovalente interaksjoner mellom amino grupper). Osmium tetroxide (OsO4) brukes vanligvis for fiksering av lipider, samt bedre kontrast.
I denne studien hjalp negative flekker for å bekrefte typisk morfologi av exosomes som har blitt rapportert i forrige papir21,27,28,29. I tillegg til negative flekker er blokk snitting også en god metode for observasjon av exosomes (figur 2). Mens valgte bildene viste den indre strukturen i exosome, viste i motsetning negative farget TEM hovedsakelig overflaten av exosome. I valgte bilder (Figur 3), blemmer viste lumen strukturen som er kjent som en strukturell funksjon exosomes30. I denne protokollen brukte vi blokk snitting immuno flekker og TEM bildebehandling. Spesielt, er blokk snitting nyttig for analyse på et senere tidspunkt når bilder kan være nødvendig ved ulike forstørrelser, for forskjellige mikroskopi teknikk og for andre analyser som immuno-gull merking. Etter snitting kan deler på rutenettet lagres i boksen rutenett som kan brukes for immuno-flekk for klassifisering av exosomes. For eksempel oppdaget vi det kjente exosome markører14 i det isolerte exosomes å studere funksjonene til exosomes.
Immunogold merking metoder har noen tekniske problemer, inkludert ingen merking eller høye merking. Når opplever ingen merking, anbefales det primære antistoff konsentrasjon og primære inkubasjon ganger. Når det gjelder lav konsentrasjon av primære antistoffer, kan antistoff titrering være nyttig å finne den optimaliserte immunoreactivity. Det kan også være nyttig å øke de inkubasjon gangene 4 ° c over natten. I kontrast hvis konsentrasjonen av primære antistoffer er for høy eller inkubasjon tiden er lenge ved høy temperatur, skal bakgrunn signalet økes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av Bio & medisinsk teknologi Development Program av National Research Foundation (NRF) & finansiert av koreanske myndigheter (MSIP & MOHW) (nr. 2016M3A9B6904244). Vi takker også medlemmer av Medisintran Bioconvergence Research Center for rensing av exosome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al.
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
