نموذج إعداد وتصوير اكسوسوميس مجهر إلكتروني
Summary
ويصف هذا البروتوكول مختلف التقنيات اللازمة مجهر إلكتروني بما في ذلك صبغة سلبية، وتمزيقها سامسونج للهيكل المفصل، ووضع العلامات لتحديد مواقف محددة من البروتينات في اكسوسوميس المناعية والذهب.
Abstract
اكسوسوميس هي حويصلات خارج الخلية نانو الحجم يفرزها سوائل الجسم، ومن المعروف أن تمثل خصائص الخلايا التي تفرز لهم. وتعكس محتويات ومورفولوجية الحويصلات يفرز سلوك الخلية أو الحالة الفسيولوجية، على سبيل المثال نمو الخلايا، والهجرة والانقسام، والموت. قد يتوقف دور اكسوسوميس عاليا في الحجم، ويختلف حجم اكسوسوميس من 30 إلى 300 نانومتر. الأسلوب الأكثر استخداماً لتصوير اكسوسومي تلطيخ سلبية، في حين تستند النتائج الأخرى في البرد مجهر إلكتروني، وفحص المجهر الإلكتروني، ومجهر القوة الذرية. مورفولوجيا اكسوسومي نموذجية لتقييمها عن طريق تلطيخ السلبي شكل كوب، ولكن المزيد من التفاصيل ليست واضحة بعد. اكسوسومي تتسم جيدا من خلال دراسة الهيكلية اللازمة خاصة في المجالات الطبية والصيدلانية. ولذلك، ينبغي التحقق من مورفولوجيا تعتمد على الدالة بتقنيات الميكروسكوب الإلكتروني مثل وسم بروتين محددة في هيكل اكسوسومي مفصلة. لمراقبة الهيكل المفصل، قورنت سامسونج مقطعة والصور السلبية الملون من اكسوسوميس. ونقترح في هذا البروتوكول، مجهر إلكتروني لتصوير اكسوسوميس بما في ذلك صبغة سلبية وتلطيخ المناعية جبل كله وإعداد كتلة، قسم رقيقة ووسمها المناعية والذهب.
Introduction
حويصلات خارج الخلية (EVs) حويصلات بلير الدهن يفرز من الخلايا، ويتراوح حجمها بين 30 و 300 نانومتر. تم الإبلاغ عن المركبات الكهربائية أولاً في عام 1978، مع الأدلة من حويصلات من المرضى الذين يعانون من مرض هودجكن1. هذه الحويصلات أفيد بأن 40 إلى 120 نانومتر في الحجم. في عام 1980، أفيد بأن المركبات الكهربائية وتشارك في نظام تخثر وتجلط الدم، تشكيل تجلط الدم داخل الأوعية الدموية في مرضى السرطان2. بعد 30 عاماً، أبلغ المركبات الكهربائية لتكون عاملاً مهما لتعزيز غزو الورم، ومحصنة ضد الهرب، وتولد الأوعية3. وبالإضافة إلى ذلك، قد درست وظائف المركبات الكهربائية حسب المنظمين في التفاعلات الخلوية في المناطق من الالتهابات والاضطرابات المناعية والأمراض العصبية والسرطان4. المركبات الكهربائية تحتوي على الجزيئات الحيوية المحددة مثل البروتين، ومرناً، وميكرورنا5، إمكانية تطبيقها في التشخيص والمداواة منذ تم تحليلها6،7. المركبات الكهربائية فئة تتألف من مجموعات فرعية بما في ذلك اكسوسوميس، بروستاسوميس، أونكوسوميس، ديكسوسوميس، المجهرية الدقيقة، برومينينوسوميس، أرجوسوميس، وحويصلات مثل اكسوسومي، تبعاً للمنشأ الخلوي والوظيفة البيولوجية3. وبالإضافة إلى ذلك، استناداً على نشوء حيوي، يمكن تقسيم هذه المركبات إلى ميكروفيسيكليس (تسليط ميكروفيسيكليس، 100-1000 نيوتن متر) واكسوسوميس (30-300 نانومتر)8،9. ومن بين هذه أبلغ اكسوسومي وصفها محاورا خلية للسرطان11،12، الاستجابة المناعية10و13من الأمراض المعدية.
يتزايد الاهتمام في اكسوسوميس كالعلامات البيولوجية للتشخيص المبكر بسرعة، وتنقية وتوصيف اكسوسوميس يجب أن تقترن مع تقنيات التصوير الجزيئي. ويمكن تمييز بأحجام مختلفة ومورفولوجيس من اكسوسوميس، اعتماداً على الأصل والدالة14، باستخدام تقنيات الفحص المجهري بدقة عالية، مثل الميكروسكوب الإلكتروني. معظم اكسوسوميس كانت تصور سلبي الملون انتقال الميكروسكوب الإلكتروني (TEM)15،16،17، وتأكدت هذه النتائج قبل إيمونولابيلينج بروتين معين في حويصلة جبل كله 18-مجموعات بحثية عديدة أبلغت عن الهيكل من خلال “المسح الضوئي المجهر الإلكتروني” و “مجهر القوة الذرية”19،2021،Cryo-ال22. ومع ذلك، بينما هذه التقنيات مفيدة لدراسة هيكل اكسوسومي، هم غير كافية لمراقبة موقف محدد البروتينات الموجودة داخل اكسوسومي. ولذلك، قمنا بعرض بروتوكول للتصوير اكسوسوميس مع وضع العلامات المحددة للبروتين. قمنا بتطبيق إعداد كتلة وتمزيقها سامسونج، وإيمونوستاينينج للتحقق من موقع البروتين مفصلة في اكسوسومي. هذا كان مقارنة تلطيخ السلبية وكله جبل إيمونوستينينج، الذي يستخدم عادة لوصف اكسوسومي.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعرض هذه المقالة بروتوكول لمراقبة الهيكل اكسوسومي مفصلاً ووسم البروتينات المحددة لها. واعتبرت تلطيخ السلبية كأفضل طريقة لتصوير17اكسوسومي. وقد أظهرت هذه التقنية التقليدية هيكل على شكل كوب اكسوسوميس. ومع ذلك، هذا الشكل كأس شكل من أشكال الحرفية التي يمكن أن تحدث بسبب عملية التج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذه البحوث الحيوية & “برنامج تطوير التكنولوجيا الطبية” لمؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني) & التي تمولها الحكومة الكورية (مسيب & الاجتماعية) (رقم 2016M3A9B6904244). ونشكر أيضا أعضاء من مركز بحوث الأدوية بيوكونفيرجينسي لتنقية اكسوسومي.
Materials
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| silver paint | CANS | CTP100 | |
| aluminum stub | EMS | 75622 | |
| FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin’s disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles – a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases?. Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
