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Biology

샘플 준비 및 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 Exosomes의 영상

doi: 10.3791/56482 Published: January 4, 2018

Summary

이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.

Abstract

Exosomes는 나노 크기의 세포 외 체액 분 비 소포 그리고 그들을 분 비 하는 셀의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 내용과 secreted vesicles의 형태 셀 행동 또는 생리 적 상태, 예를 들면 세포 성장, 마이그레이션, 분열, 그리고 죽음을 반영합니다. Exosomes의 역할 매우 크기에 따라 달라질 수 있습니다 따라 다르며 exosomes의 크기 30에서 300 nm. Exosome 이미징에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 부정적인 얼룩, Cryo-전송 전자 현미경, 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경을 기반으로 하는 다른 결과 이다. 전형적인 exosome 형태학 부정적인 얼룩 통해 평가 컵 모양 이지만 더 세부 사항은 아직 명확. 구조 연구를 통해 잘 특징이 있는 exosome 의료 및 제약 분야에서 필요한 특히 이다. 따라서, 함수 종속 형태 라벨 exosome의 상세한 구조에서 특정 단백질 등 전자 현미경 기법에 의해 확인 되어야 한다. 자세한 구조를 관찰, ultrathin sectioned 이미지와 exosomes의 부정적인 스테인드 이미지 비교 되었다. 이 프로토콜에서 부정적인 얼룩이 지기, 전체 마운트 immuno 얼룩이, 블록 준비, 얇은 섹션, 그리고 면역-골드 라벨을 포함 하 여 exosomes의 영상에 대 한 전송 전자 현미경 검사 법 하는 것이 좋습니다.

Introduction

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Extracellular 소포 (EVs) 지질 bilayer 소포 세포에 의해 분 비 되며 그들의 크기 범위는 30 300 nm 사이. EVs는 Hodgkin의 질병1환자의 소포에서 증거와 함께 1978 년에 처음 보고 되었다. 이러한 vesicles 40 ~ 120 나노미터 크기에 보고 했다. 1980 년에, 그것은 EVs 응고 시스템 및 혈전 증, 암 환자2혈관 내 혈액 응고의 형성에 관련 된 것으로 알려졌다. 30 년 후, EVs 종양 침공, 면역 탈출 및 신생3홍보 하는 중요 한 요소 되도록 보고 되었습니다. 또한, EVs의 기능 세포의 상호 작용 분야에서 염증, 면역 장애, 신경 질환 및 암4레 귤 레이 터로 공부 되었다. EVs는 특정 생체 단백질, mRNA, 예측에 관한5등 포함, 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램 분석된6,7되었습니다. EVs는 exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, 미, promininosomes, argosomes, 및 그들의 세포질 근원 및 생물학 기능3에 따라 exosome 같은 소포를 포함 한 하위의 구성 범주. 또한, 그들의 속에 따라, 이러한 EVs 수 나눌 수 microvesicles (창 고 microvesicles, 100-1000 nm) 및 exosomes (30-300 nm)8,9. 이러한 가운데,는 exosome 면역 응답10, 암11,12, 및 전염병13셀 의사 소통으로 보고 되었습니다.

조기 진단 위한 바이오 마커도 exosomes에 대 한 관심, 고 정화와 exosomes의 분자 이미징 기술을 함께 동반 되어야 합니다. 다양 한 크기와 exosomes, 그들의 기원과 기능14, 따라의 형태학은 전자 현미경과 같은 높은 해상도와 현미경 기법에 의해 구분할 수 있습니다. 대부분 exosomes 부정적인 스테인드 전송 전자 현미경 (TEM)15,,1617에 의해 시각 했다 그리고이 결과 전체 산 소포에 특정 단백질의 immunolabeling에 의해 확인 되었다 18. 여러 연구 그룹 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경19,20및 Cryo 편21,22를 통해 구조를 보고 있다. 그러나, 이러한 기술은 exosome 구조를 공부 하는 데 유용 하는 동안 그들은 충분 하지 않습니다는 exosome 안에 있는 특정 단백질의 위치를 관찰. 따라서, 우리는 특정 단백질의 라벨로 exosomes 이미징에 대 한 프로토콜 도입. 우리 블록 준비, ultrathin 단면화 및 immunostaining에 있는 exosome 단백질의 자세한 위치를 ascertaining에 대 한 적용. 이 부정적인 얼룩이 지 고는 exosome의 전통적으로 사용 되는 전체 산 immunostaining와 비교 되었다.

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Protocol

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1. 블록 준비, 단면, 얼룩이 지 고는 Exosome의 이미징

  1. 1.5 h23에 대 한 100000 x g에서 원심 분리에 의해 HCT116 세포의 문화 상쾌한에서 exosomes을 펠 렛. 표면에 뜨는 문화를 제거 하 고 신중 하 게 순화 exosome 펠 릿 1 mL의 0.1 M 나트륨 cacodylate 솔루션 (pH 7.0) 4 ° c.에 1 시간에에서 2.5%도 해결 0.1 M 나트륨 cacodylate, 160 ml 증류수 (DW) 4.28 g cacodylic 산 분해. 0.1 M HCl 최대 200 mL 증류수와 함께 게와 7.4에 pH를 조정 합니다.
  2. 정착 액을 제거 하 고 실 온에서 0.1 M 나트륨 cacodylate 버퍼의 1 mL와 함께 알 약을 씻어. 각 변경 10 분 지속으로 세 번을 반복 합니다.
  3. 후 4 ° c.에 2% 오스뮴 tetroxide 1 h의 1 mL와 함께 샘플을 수정
  4. 정착 액을 제거 하 고 세 번 0.1 M 나트륨 cacodylate와 린스 버퍼 마다 10 분.
  5. 등급된 아세톤 시리즈와 10 분 동안 품 어 (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, 각각) 뿌리에.
  6. 아세톤을 제거 하 고 30 분에 대 한 3:1 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합물의 솔루션을 품 어. Exosome 펠 렛 튜브입니다.
  7. 매체를 제거 하 고 1:1 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합 매체, 추가 다음 30 분 동안 품 어.
  8. 매체를 제거 하 고 1:3 아세톤: 낮은 점도 포함 혼합 매체, 추가 다음 30 분 동안 품 어.
  9. 매체를 제거 하 고 추가 100% 낮은 점도 혼합물을 포함 하 고 하룻밤 실 온에서 품 어.
  10. 65 ° c.에 24 h에 대 한 포함 형과 빵을 사용 하 여 혼합물을 포함 하는 순수한 낮은 점도 샘플 포함
  11. 60 nm 두께 울트라-톰을 통해 섹션을 준비 합니다.
  12. 더블-20 분 동안 2 %uranyl 아세테이트로 얼룩 그리고 10 분 시트르산.
    레이놀즈 리드 솔루션에 대 한 총 50 mL 증 류 물 납 질 산 및 나트륨 시트르산의 1.76 g 1.33 g를 추가 합니다.
  13. 전송 전자 현미경 검사 법 80에서 아래의 표에서 관찰 kV.
  14. "취득"을 클릭 하 고 클릭 "파일" 및 "이름으로 저장" CCD 카메라 시스템 80에서 전자 현미경에 kV. 노출 시간에 대 한 자동 설정을 따릅니다.

2. 면역-얼룩 섹션 및 이미징 (그림 1)의

  1. 매우 톰을 사용 하 여 60 nm ultrathin 섹션을 잘라 고 니켈 격자에 수집 합니다.
  2. 10 분 무료 알데하이드 그룹을 끄다 0.02 M 글리신의 50 µ L에서에서 격자를 품 어.
  3. 린스에 DW의 100 μ 3 번 각각 1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1 시간에 대 한 실 온에서 10 분 품.
  4. 1 시간 (해당 되는 경우 필요한,이 단계 실행 되어야 한다 4 ° C에서 하룻밤.)에 대 한 격자에서 50-100 µ L의 KRS 항 체24 (1: 100 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에) 안티를 품 어
  5. 10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)으로 격자를 씻어.
  6. 1 h (안티-토끼 IgG 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에 10 nm 금 입자 (1: 100)를 활용)에 대 한 2 항 체의 방울을 격자를 전송 합니다.
  7. 5 세척 격자 각 10 분 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 방울 (50 µ L)을 구분 합니다.
  8. 더블-얼룩 어두운 조건 하에서 20 분 동안 2 %uranyl 아세테이트와 Reynold의 리드 시트르산 10 분, 각각.
  9. "취득"을 클릭 하 고 클릭 "파일" 및 "저장" CCD 카메라 시스템 80에서 가장 아래에 kV. 노출 시간에 따라 자동 설정.

Figure 1
그림 1: 샘플 준비 과정 immunostaining. (A) 이중 고정된 exosome 탈수 이며 저 점도 수 지 혼합물 포함으로 침투. (B) 포함 수 지. (C) 다이아몬드 칼으로 초박형 섹션. 면역-골드 라벨에 대 한 (D) 설정. Ultrathin 섹션 격자는 젖은 종이 타월로 배치 parafilm에 액체 방울에 배치 됩니다. 각 섹션은 50-100 µ L 항 체, 방울과 알을 품을 다음 버퍼로 세척. (E) uranyl 아세테이트와 얼룩 더블 고 시트르산. 뚜껑은 알루미늄 호 일 중 금속 얼룩으로 덮여 있다. (F) 솔루션 얼룩 필터 종이 의해 제거 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. 부정적인 얼룩이 지기

  1. 글로우 방전 발광 방 전자에 의해 1 분 동안 얇은 formvar/탄소 코팅 필름 200 메쉬 구리 EM 격자.
  2. 2%의 1 mL와 함께 순화 exosomes 수정 Paraformaldehyde (PFA) 5 분.
    주의: Paraformaldehyde 가스는 유독 합니다. 모든 작업은 통풍이 증기 두건에서 행해져야 한다.
  3. 5-7 µ L exosome 정지 솔루션에 로드 하 고 1 분 동안 품 어. Exosome의 농도가 너무 높은 경우, 희석 농도를 1/2-1/5.
  4. 주사기로 EM 격자의 표면에 필터링 된 1 %uranyl 아세테이트 (UA) 솔루션 ~ 20 방울과 함께 즉시 얼룩.
  5. 필터 종이 그리드 가장자리에 연락 하 여 격자에 과잉 UA 솔루션을 제거 합니다.
  6. 신속 하 게 물 한 방울과 함께 그리드를 헹 구 십시오. 이 단계는 초과 얼룩 솔루션을 제거 합니다.
  7. 그리드 테이블에, 핀셋으로 눌러 놓고 실 온에서 10 분 동안 건조 문화 접시와 부분적으로 그리드를 커버 합니다.
  8. 80 편으로 미래 관측을 위해 EM 격자 상자에 그리드를 저장 kV.

4. 전체 산 Immunostaining에 대 한

  1. 글로우 방전 얇은 formvar/탄소 필름 코팅 200 메쉬 구리 EM 격자 30 s.
  2. 2%의 1 mL와 함께 순화 exosomes 수정 Paraformaldehyde (PFA) 5 분.
    주의: Paraformaldehyde 가스는 유독 합니다. 모든 작업은 통풍이 증기 두건에서 행해져야 한다.
  3. 5-7 µ L exosome 솔루션에 고정 하 고 품 어 PBS의 100 µ L 5 분 린스에 대 한 3 시간 10 분 동안 각각.
  4. 10 분 무료 알데하이드 그룹을 끄다 0.05 M 글리신의 50 µ L로 격자를 취급 합니다.
  5. 30 분 동안 차단 버퍼 (PBS 포함 하는 1 %BSA)의 한 방울을 격자를 전송.
  6. 1 시간 (필요한 경우,이 단계 실행 되어야 한다 4 ° C에서 하룻밤)에 대 한 반대로 PD L1 항 체 (0.1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1: 100) 50-100 µ L로 격자를 품 어.
  7. 10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)과 그리드를 씻어.
  8. 1 시간에 대 한 2 항 체의 하락을 그리드를 전송 합니다.
반대로 마우스 IgG 9-11 nm 금 입자에서 0.1 %BSA 포함 하는 PBS에서 1: 100 희석을 활용.
  • 10 분 동안 0.1 %BSA 포함 하는 PBS의 5 별도 방울 (50 µ L)과 그리드를 씻어. DW의 두 별도 방울 (50 µ L)으로 그리드를 씻어. 3.8 3.4에서 설명한 대로 2 %uranyl 아세테이트와 부정적인 얼룩를 수행 합니다.
  • 80 편으로 미래 관측을 위해 EM 격자 상자에 그리드를 저장 kV.
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    Representative Results

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    현재, exosomes 전송 전자 현미경 검사 법에 의해 크기와 모양 범주로 분류 됩니다. 그림 2 는 부정적인 exosome 및 전체 마운트 상태에 면역 이라는 exosome 스테인드. 그림 3 얇은 단면 후 sectioned exosome와 면역 이라는 exosomes를 보여준다. 면역-골드 얼룩 특정 단백질의 항 체를 사용 하 여 긍정적으로 exosome 식별은 exosome 단백질의 종류를 분류 하는 데 사용 됩니다. 이 종이에 프로토콜 플라스틱 sectioned exosome와 전체 마운트 immunostaining 및 immunostaining를 사용합니다.

    Figure 2
    그림 2: 얼룩 및 전체 마운트 면역 얼룩 네거티브. (A) Exosome 형태학 부정적인 얼룩이 지기에 의해 관찰 된다. Exosomes는 그들의 컵 모양의 형태를 보여줍니다. (B, C) (반대로 인간 CD274; 특정 단백질의 위치를 보여줍니다 모든 마운트 면역-골드 얼룩 PD-L1) exosome에. 흰색 화살표의 위치를 나타냅니다. 검정색 화살표는 배경 신호의 위치를 나타냅니다. ((D)) immunostaining 결과의 부정적인 통제. Isotype 제어는 immunostaining 과정에서 1 차 항 체에 의해 사용 되었다. 눈금 막대 = 100 nm.

    Figure 3
    그림 3: sectioned exosomes의 전자 현미경 사진. (A) Exosomes' 둥근 모양 형태 (B) 박스 exosome EMAN 프로그램에 "복 서" 도구를 사용 하 여. (C, D) 면역-골드 이라는 중 금속 얼룩과 exosome. 검은색 화살표는 금 입자 (A-D) 규모를 나타냅니다 바 = 100 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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    Discussion

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    이 문서는 자세한 exosome의 구조를 관찰 하 고 그 특정 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜을 표시 합니다. 부정적인 얼룩 exosome17이미징에 대 한 최선의 방법으로 간주 되었습니다. 이 기본 기술을 exosomes의 컵 모양의 구조를 보이고 있다. 그러나,이 컵 모양 인 위 건조 과정으로 인해 발생할 수 있는 형태입니다. 곳을 알아내는 가장 결과 exosomes 용액25,26에 완벽 하 게 구형 구조를가지고 나타났습니다. 곳을 알아내는 가장 기술 자연 구조를 조사 하기 위한 매우 강력한 방법 이지만 면역-골드 메서드를 적용 하기 어렵습니다. 종래의 방법 (전체 마운트-부정적인 얼룩이 지기 방법)에서 건조 지적 Raso와 동료는 컵 모양의 형태에 결과. 이 연구에서 셀 준비 (일상적인 EM, 고정, 탈수, 포함, 및 단면)에 대 한 표준 방법 exosome 건조 효과 줄이기 위해 적용 되었다. 루틴 안에 플라스틱 포함을 사용 하 여 수 피 하거나 유물 (볼륨 및 모양 변경) 변성에 의해 발생을 줄일 수. 화학 기정, cross-linking (아미노 그룹 간의 공유 상호 작용)에 대 한 글 (가) 사용 되었습니다. 일반적으로, 오스뮴 tetroxide (OsO4) 지질 뿐만 아니라 향상 된 대비의 고정에 사용 됩니다.

    이 연구에서는 이전 논문21,27,,2829에 보고 되는 exosomes의 일반적인 형태를 확인 도움이 부정적인 얼룩이 지기. 부정적인 얼룩 뿐만 아니라 블록 단면 exosomes (그림 2)의 관찰에 대 한 좋은 방법 또한입니다. Sectioned 이미지 exosome의 내부 구조를 보여주었다, 그러나 반대로 부정적인 스테인드 가장은 exosome의 표면에 주로 나타났다. Sectioned 이미지 (그림 3)에 소포 exosomes30의 구조 기능으로 알려져 있다 루멘 구조를 보여주었다. 이 프로토콜에서 우리 블록 단면, immuno 얼룩이 지 고 가장 이미징 사용. 특히, 블록 구분은 때 이미지 다른 배율에서 필요할 수 있습니다 나중에 분석, 다른 현미경 검사 법 기술, 그리고 면역-골드 라벨 등 다른 분석에 유용 합니다. 단면, 후에 섹션 exosomes의 분류에 대 한 면역 염색을 위해 사용 될 수 있는 표 상자에 저장할 수 있습니다. 예를 들어 우리 exosomes의 기능을 공부 하는 고립 된 exosomes에서 알려진된 exosome 마커14 감지.

    Immunogold 라벨 방법 라벨 또는 높은 배경 라벨을 포함 한 몇 가지 기술적인 문제가 있다. 아니 라벨 겪고, 1 차 항 체 농도 및 기본 보육 시간을 확인 하는 것이 좋습니다. 1 차 항 체의 낮은 농도 경우 항 체 적정 최적화 된 immunoreactivity을 찾을 수 될 수 있습니다. 그것은 또한 하룻밤 4 ° C에 외피 시간 증가 도움이 될 수 있습니다. 반면, 1 차 항 체의 농도 너무 높은 또는 높은 온도에서 부 화 시간 너무 오래, 배경 신호 증가 됩니다.

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    Disclosures

    저자는 공개 없다.

    Acknowledgments

    이 연구는 생물에 의해 지원 되었다 & 의료 기술 개발 프로그램 국가 연구 재단 (NRF)의 &는 정부에 의해 투자 (MSIP & 보건복지부) (No. 2016M3A9B6904244). 우리는 또한 exosome의 정화의 약용 Bioconvergence 연구 센터의 회원을 감사합니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Glutaraldehyde EMS 16200
    Sodium cacodylate  EMS 12300
    Osmium tetroxide 1 g crystal EMS 19100 Use only in fume hood
    acetone JUNSEI 1B2031
    Spurr medium TED PELLA 18108
    Ultra-microtome Leica UCT
    Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
    Lead citrate EMS 17900
    Transmission Electron Microscopy Hitachi H7600
    nickel grid EMS G200-Ni
    Copper grid EMS G200-Cu
    glycine SIGMA 022K5404
    Phosphate buffer saline SIGMA P4417
    Bovine serum albumin Aurion 25557
    1st Antibody purification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody BioLegend 329710 Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl BioLegend 401202 Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle sigma G7652
    Transmission Electron Microscopy JEOL JEM2200FS
    Glow discharger JEOL JFC1100E
    Carbon grid EMS 121119
    Paraformaldehyde EMS 19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) EMS FCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh) EMS FCF200-NI

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).More

    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).

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