이 프로토콜 전송 전자 현미경 검사 법이 부정적인 얼룩이 지기, 상세한 구조 및 면역-골드 라벨 exosomes에 특정 단백질의 위치를 확인 하려면 ultrathin 단면에 필요한 다양 한 기법을 설명 합니다.
Exosomes는 나노 크기의 세포 외 체액 분 비 소포 그리고 그들을 분 비 하는 셀의 특성을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 내용과 secreted vesicles의 형태 셀 행동 또는 생리 적 상태, 예를 들면 세포 성장, 마이그레이션, 분열, 그리고 죽음을 반영합니다. Exosomes의 역할 매우 크기에 따라 달라질 수 있습니다 따라 다르며 exosomes의 크기 30에서 300 nm. Exosome 이미징에 대 한 가장 널리 사용 되는 방법 부정적인 얼룩, Cryo-전송 전자 현미경, 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경을 기반으로 하는 다른 결과 이다. 전형적인 exosome 형태학 부정적인 얼룩 통해 평가 컵 모양 이지만 더 세부 사항은 아직 명확. 구조 연구를 통해 잘 특징이 있는 exosome 의료 및 제약 분야에서 필요한 특히 이다. 따라서, 함수 종속 형태 라벨 exosome의 상세한 구조에서 특정 단백질 등 전자 현미경 기법에 의해 확인 되어야 한다. 자세한 구조를 관찰, ultrathin sectioned 이미지와 exosomes의 부정적인 스테인드 이미지 비교 되었다. 이 프로토콜에서 부정적인 얼룩이 지기, 전체 마운트 immuno 얼룩이, 블록 준비, 얇은 섹션, 그리고 면역-골드 라벨을 포함 하 여 exosomes의 영상에 대 한 전송 전자 현미경 검사 법 하는 것이 좋습니다.
Extracellular 소포 (EVs) 지질 bilayer 소포 세포에 의해 분 비 되며 그들의 크기 범위는 30 300 nm 사이. EVs는 Hodgkin의 질병1환자의 소포에서 증거와 함께 1978 년에 처음 보고 되었다. 이러한 vesicles 40 ~ 120 나노미터 크기에 보고 했다. 1980 년에, 그것은 EVs 응고 시스템 및 혈전 증, 암 환자2혈관 내 혈액 응고의 형성에 관련 된 것으로 알려졌다. 30 년 후, EVs 종양 침공, 면역 탈출 및 신생3홍보 하는 중요 한 요소 되도록 보고 되었습니다. 또한, EVs의 기능 세포의 상호 작용 분야에서 염증, 면역 장애, 신경 질환 및 암4레 귤 레이 터로 공부 되었다. EVs는 특정 생체 단백질, mRNA, 예측에 관한5등 포함, 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 응용 프로그램 분석된6,7되었습니다. EVs는 exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, 미, promininosomes, argosomes, 및 그들의 세포질 근원 및 생물학 기능3에 따라 exosome 같은 소포를 포함 한 하위의 구성 범주. 또한, 그들의 속에 따라, 이러한 EVs 수 나눌 수 microvesicles (창 고 microvesicles, 100-1000 nm) 및 exosomes (30-300 nm)8,9. 이러한 가운데,는 exosome 면역 응답10, 암11,12, 및 전염병13셀 의사 소통으로 보고 되었습니다.
조기 진단 위한 바이오 마커도 exosomes에 대 한 관심, 고 정화와 exosomes의 분자 이미징 기술을 함께 동반 되어야 합니다. 다양 한 크기와 exosomes, 그들의 기원과 기능14, 따라의 형태학은 전자 현미경과 같은 높은 해상도와 현미경 기법에 의해 구분할 수 있습니다. 대부분 exosomes 부정적인 스테인드 전송 전자 현미경 (TEM)15,,1617에 의해 시각 했다 그리고이 결과 전체 산 소포에 특정 단백질의 immunolabeling에 의해 확인 되었다 18. 여러 연구 그룹 스캐닝 전자 현미경, 원자 힘 현미경19,20및 Cryo 편21,22를 통해 구조를 보고 있다. 그러나, 이러한 기술은 exosome 구조를 공부 하는 데 유용 하는 동안 그들은 충분 하지 않습니다는 exosome 안에 있는 특정 단백질의 위치를 관찰. 따라서, 우리는 특정 단백질의 라벨로 exosomes 이미징에 대 한 프로토콜 도입. 우리 블록 준비, ultrathin 단면화 및 immunostaining에 있는 exosome 단백질의 자세한 위치를 ascertaining에 대 한 적용. 이 부정적인 얼룩이 지 고는 exosome의 전통적으로 사용 되는 전체 산 immunostaining와 비교 되었다.
이 문서는 자세한 exosome의 구조를 관찰 하 고 그 특정 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜을 표시 합니다. 부정적인 얼룩 exosome17이미징에 대 한 최선의 방법으로 간주 되었습니다. 이 기본 기술을 exosomes의 컵 모양의 구조를 보이고 있다. 그러나,이 컵 모양 인 위 건조 과정으로 인해 발생할 수 있는 형태입니다. 곳을 알아내는 가장 결과 exosomes 용액25,<sup clas…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 생물에 의해 지원 되었다 & 의료 기술 개발 프로그램 국가 연구 재단 (NRF)의 &는 정부에 의해 투자 (MSIP & 보건복지부) (No. 2016M3A9B6904244). 우리는 또한 exosome의 정화의 약용 Bioconvergence 연구 센터의 회원을 감사합니다.
Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
Ultra-microtome | Leica | UCT | |
Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
Lead citrate | EMS | 17900 | |
Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
nickel grid | EMS | G200-Ni | |
Copper grid | EMS | G200-Cu | |
glycine | SIGMA | 022K5404 | |
Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
1st Antibody | purification in manually | ||
Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
silver paint | CANS | CTP100 | |
aluminum stub | EMS | 75622 | |
FIB-SEM | Zeiss | AURIGA | |
Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
Carbon grid | EMS | 121119 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |