Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme

doi: 10.3791/56482 Published: January 4, 2018

Summary

Bu iletişim kuralı gerekli transmisyon elektron mikroskobu negatif boyama, ayrıntılı yapısı ve IMMUNO-altın spesifik proteinlerin konumlarda exosomes belirlemek için etiketleme için ultrathin kesit dahil olmak üzere için çeşitli teknikler açıklanır.

Abstract

Exosomes hücre dışı veziküller nano boyutlu vücut sıvıları tarafından salgılanan vardır ve onları salgılar hücre özellikleri temsil etmek için bilinir. İçeriği ve salgılanan veziküller morfolojisi hücre davranış ya da fizyolojik durum, örneğin hücre büyümesi, geçiş, bölünme ve ölüm yansıtır. Exosomes rolü son derece boyutuna bağlı olabilir ve exosomes boyutu 30 ila 300'e değişir nm. En çok kullanılan eksozom görüntüleme için diğer sonuçlar Cryo-transmisyon elektron mikroskobu, elektron mikroskobu tarama ve Atomik kuvvet mikroskobu dayalı iken negatif boyama yöntemidir. Tipik eksozom'ın Morfoloji negatif boyama ile değerlendirildi, bir fincan şekli olmakla birlikte, daha fazla ayrıntılı bilgi henüz net değildir. Bir eksozom yapısal çalışma ile iyi karakterize gerekli özellikle de sağlık ve ilaç alanlar var. Bu nedenle, işlev bağımlı Morfoloji eksozom detaylı yapısında belirli bir protein etiketleme gibi elektron mikroskobu teknikleri tarafından doğrulanması gerekir. Ayrıntılı yapısı gözlemlemek için ultrathin kesitli görüntülerini ve exosomes negatif lekeli görüntüleri karşılaştırıldı. Bu protokol için iletim elektron mikroskopi exosomes negatif boyama, Bütün Dağı IMMUNO-boyama, blok hazırlık, ince bölüm ve IMMUNO-altın etiketleme gibi görüntüleme için öneririz.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ekstrasellüler veziküller (EVs) hücreleri tarafından salgılanan lipid bilayer veziküller vardır ve büyüklükleri 30 ve 300 nm arasında değişmektedir. EVs veziküller Hodgkin Hastaligi1hastalarda kanıt ile 1978 yılında ilk bildirildi. Bu veziküller 40-120 nanometre boyutunda bulunduğu rapor edilmiştir. 1980 yılında, bu EVs pıhtılaşma sistemi ve tromboz, bir damar kanseri hastalar2içinde bir kan pıhtısı oluşumu katılmaktadırlar bildirildi. 30 yıl sonra EVs tümör işgali, bağışıklık kaçış ve anjiogenezi3tanıtmak için önemli bir faktör olarak bildirilmiştir. Buna ek olarak, EVs fonksiyonları alanlarda hücresel etkileşimlerin iltihabı, bağışıklık bozukluğu, nörolojik hastalık ve kanser4düzenleyiciler olarak incelenmiştir. EVs protein, mRNA ve mikroRNA5gibi belirli biomolecules içerdiğinden, teşhis ve tedavi uygulama onların potansiyel analiz6,7oldu. EVs exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes ve hücresel kökeni ve biyolojik fonksiyon3bağlı eksozom benzeri veziküller dahil olmak üzere alt gruplar oluşan bir kategori vardır. Buna ek olarak, onların Biyogenez üzerinde bağlı olarak, bu EVs microvesicles (döken microvesicles, 100-1000 nm) ve exosomes (30-300 nm)8,9bölünmüş olabilir. Bunlar arasında ya bir hücre iletişim bağışıklık yanıtı10, kanser11,12ve bulaşıcı hastalık13olarak bildirilmiştir.

Exosomes olarak bir biyomarker erken tanı için ilgi hızla artıyor ve arıtma ve exosomes karakterizasyonu moleküler görüntüleme teknikleri ile eşlik etmelidir. Farklı boyutlarda ve türleri exosomes, kendi kökeni ve işlev14, bağlı olarak, Morfoloji mikroskobu teknikleri gibi elektron mikroskobu yüksek çözünürlüklü tarafından ayrılır. Çoğu exosomes negatif lekeli transmisyon elektron mikroskobu (TEM)15,16,17tarafından görüntülenmiştir ve bu sonuçlar immunolabeling bütün Dağı vezikül içinde belirli bir protein tarafından teyit edildi 18. birkaç araştırma grubu aracılığıyla tarama elektron mikroskobu, Atomik kuvvet mikroskobu19,20ve Cryo-TEM21,22yapısı bildirdin. Ancak, bu teknikler eksozom yapısı eğitim için yararlı olsa da, ya içinde bulunan spesifik proteinlerin konumunu gözlemlemek için yetersiz bunlar. Bu nedenle, belirli protein etiketleme ile exosomes görüntüleme için bir protokol tanıttı. Biz blok hazırlanması, ultrathin kesit ve immunostaining protein'ın detaylı eksozom konumda ascertaining için uygulanır. Bu negatif boyama ve geleneksel eksozom karakterizasyonu için kullanılan bütün Dağı immunostaining ile karşılaştırıldı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. blok hazırlık, kesit, boyama ve ya görüntüleme

  1. Santrifüjü 100.000 x g 1,5 saat23de tarafından gelen Kültür süpernatant HCT116 hücre exosomes cips. Kültür süpernatant kaldırmak ve dikkatle 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate çözüm (pH 7,0) 1 h 4 ° C'de % 2.5 oxazolidin ile arıtılmış eksozom Pelet düzeltmek 0.1 M sodyum cacodylate için 160 mL distile su (DW) 4,28 g Kakodilik asit geçiyoruz. PH 7.4 0,1 M HCl o zaman ilâ 200 mL distile su ile yapmak için ayarlayın.
  2. Sabitleştirici kaldırmak ve granül 1 mL 0.1 M sodyum cacodylate arabelleği ile oda sıcaklığında durulayın. 10 dk süren her değişiklikle üç kez tekrarlayın.
  3. Sonrası 4 ° C'de % 2 Osmiyum tetroxide 1 h için 1 mL örnekleriyle düzeltmek
  4. Sabitleştirici kaldırmak ve durulama üç kez 0.1 M sodyum cacodylate ile tampon her 10 min.
  5. Kademeli aseton serisi ile 10 min için kuluçkaya (% 50, % 60, % 70, %80, % 90'ı, % 95, % 100, sırasıyla) shaker üzerinde.
  6. Aseton kaldırmak ve 3:1 aseton: düşük viskozite gömme karışımı 30 dk için çözüm kuluçkaya. Ya Pelet tüp var.
  7. Orta kaldırmak ve 1:1 aseton: düşük viskozite gömme karışımı orta ekleyin, sonra 30 dk için kuluçkaya.
  8. Orta kaldırmak ve 1:3 aseton: düşük viskozite gömme karışımı orta ekleyin, sonra 30 dk için kuluçkaya.
  9. Orta kaldırın ve % 100 karışımı katıştırma viskozitesi düşük ve gecede oda sıcaklığında kuluçkaya ekleyin.
  10. Örnek saf düşük viskozite 65 ° C'de 24 h için gömme kalıp ve fırında kullanarak karışımı katıştırma katıştırılmış
  11. Bir ultra-microtome üzerinden 60 nm kalınlı¤ında bölümleri hazırlayın.
  12. % 2 uranyl asetat için 20 dk ile çift-leke ve sitrat 10 min için yol.
    Reynolds götürmek eriyik için fazla 50 mL distile su ile 1.33 g kurşun nitrat ve sodyum sitrat 1.76 g ekleyin.
  13. Kılavuz 80, transmisyon elektron mikroskobu altında gözlemlemek kV.
  14. "Al" düğmesini tıklatın ve ardından "Dosya" ve "80, elektron mikroskobu altında CCD kamera sisteminde farklı kaydet" seçeneğini tıklatın kV. Otomatik ayarları pozlama süresi için izleyin.

2. IMMUNO-boyama bölümü ve görüntüleme (şekil 1)

  1. 60 nm ultrathin bölümleri bir ultra-microtome kullanarak kesme ve nikel ızgara üzerinde toplamak.
  2. 0,02 M glycine için ücretsiz aldehit gruplarını gidermek 10 dk 50 µL damla kılavuzlarda kuluçkaya.
  3. DW 100 μL içinde üç kez her 1s içinde % 1 BSA içeren PBS için oda sıcaklığında 10 dk. Incubate için durulayın.
  4. 50-100 µL damla KRS antikor24 (1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde) anti kılavuzlarda kuluçkaya 1 h (gerekirse, bu adım 4 ° C'de gecede yapılmalıdır.)
  5. 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, Izgaralar beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın.
  6. Izgaralar 2nd antikor için 1 h (Anti-tavşan IgG % 0,1 BSA içeren PBS 10 nm altın parçacık (1: 100) Birleşik) damla aktarın.
  7. Yıkama Izgaralar beş damla % 0,1 BSA içeren PBS (50 µL) her 10 dk ayırın.
  8. Çift-%2 uranyl asetat için karanlık koşullarda 20 dk ve Reynolds kurşun sitrat 10 dk, sırasıyla leke.
  9. "Al" düğmesini tıklatın ve ardından "Dosya" ve "80, TEM altında CCD kamera sisteminde farklı kaydet" seçeneğini tıklatın kV. Pozlama süresi otomatik ayarları izledi.

Figure 1
Şekil 1: sürecin numune hazırlama ve immunostaining. (A) Çift Kişilik sabit eksozom susuz ve düşük viskozite karışımı reçine katıştırma sızmış. (B) katıştırma reçine. (C) elmas bıçak ile Ultra ince bölümü. IMMUNO-altın etiketleme için (D) kurulum. Izgaralar ultrathin bölümleri ile ıslak kağıt havlu ile yerleştirilen bir parafilm üzerinde sıvı damlacıkları olarak konur. Her bölüm 50-100 µL antikor damlacıkları ile inkübe sonra arabellek ile yıkanır. (E) uranyl asetat ile boyama çift ve sitrat yol. Kapağı heavy metal boyama için alüminyum folyo ile kaplı. (F) çözüm boyama filtre kağıdı tarafından kaldırılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. negatif boyama

  1. Parlaklık-ince formvar/karbon film kaplı 200 mesh bakır EM Izgaralar için 1dk kızdırma deşarj tarafından terhis edildi.
  2. % 2 ile 1 mL saf exosomes saptamak Paraformaldehyde (PFA) 5 min için.
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir. Tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  3. 5-7 µL eksozom süspansiyon çözüm ızgara üzerinde yük ve 1 dk. için kuluçkaya. Ya konsantrasyonu çok yüksek ise, konsantrasyon ile 1/2 - 1/5 oranında seyreltin.
  4. Hemen filtre uygulanan % 1'uranyl asetat (UA) çözüm EM ızgara yüzeyi şırınga tarafından ~ 20 damla ile leke.
  5. Aşırı UA çözüm çizgilerini kılavuz kenar filtre kağıdı ile irtibata geçerek kaldırın.
  6. Hızlı kılavuz bir damla su ile durulayın. Bu adımı aşırı boyama çözüm kaldırır.
  7. Izgarayı cımbızla tutup masaya koyun ve kılavuz altında oda sıcaklığında 10 dakika kurumaya kısmen kültür yemeği ile kapsar.
  8. Kılavuz tarafından TEM 80, gelecekteki gözlem için bir EM kılavuz kutusunda saklamak kV.

4. bütün dağ Immunostaining için

  1. Parlaklık-deşarj ince formvar/karbon film kaplı 200 mesh bakır EM Izgaralar için 30 s.
  2. % 2 ile 1 mL saf exosomes saptamak Paraformaldehyde (PFA) 5 min için.
    Dikkat: Paraformaldehyde dumanı zehirlidir. Tüm iş havalandırılmış duman mahallede yapılmalıdır.
  3. 5-7 µL eksozom çözüm kılavuz üzerinde sabit yük ve 5 dk. için durulama ile 100 µL PBS, üç kez her 10 min için kuluçkaya.
  4. Izgaralar 0,05 M glycine için ücretsiz aldehit gruplarını gidermek 10 dk 50 µL ile tedavi.
  5. Izgaralar engelleme arabellek (%1 BSA içeren PBS) atmak için 30 dk aktarın.
  6. Izgaralar ile 50-100 µL PD-L1 antikor (1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde) anti 1 h (gerekirse, bu adım 4 ° C'de gecede yapılmalıdır) kuluçkaya.
  7. 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, kılavuz beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın.
  8. Kılavuz için 1 h 2nd antikor bir damla aktarın.
9-11, 1: %100 0,1 BSA içeren PBS içinde seyreltilmiş nm altın parçacık için anti-fare IgG Birleşik.
  • 10 dk % 0,1 BSA içeren PBS, kılavuz beş ayrı damla (50 µL) ile yıkayın. İki ayrı damla (50 µL) kılavuzla DW ile yıkayın. 3.4 3,8 için açıklandığı gibi % 2 uranyl asetat ile negatif boyama gerçekleştirmek.
  • Kılavuz tarafından TEM 80, gelecekteki gözlem için bir EM kılavuz kutusunda saklamak kV.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Şu anda, exosomes transmisyon elektron mikroskobu tarafından boyutu ve şekli kategoride sınıflandırılır. Şekil 2 negatif lekeli eksozom ve bağışıklık etiketli eksozom tüm bağlama durumu gösterir. Şekil 3 kesitli eksozom ve immün etiketli exosomes ince kesit sonra gösterir. IMMUNO-altın belirli proteinlerin antikorları kullanarak boyama olumlu bir eksozom tanımlamak ve proteinler arasında eksozom türleri sınıflandırmak için kullanılır. Bu kağıt protokolünde bütün Dağı immunostaining ve immunostaining plastik kesitli eksozom ile kullanır.

    Figure 2
    Şekil 2: negatif Dağı immün boyama-boyama ve bütün. (A) eksozom Morfoloji negatif boyama tarafından görülmektedir. Exosomes onların Kupası şeklindeki Morfoloji gösterir. (B, C) Bütün Dağı IMMUNO-altın boyama (anti insan CD274; belirli protein konumunu gösterir PD-L1) ya da. Beyaz okları altın konumunu gösterir. Siyah oklar arka plan sinyal konumunu gösterir. (D) kontrolünü immunostaining sonuç negatif. İzotip kontrol bu immunostaining işlem birincil antikor tarafından kullanıldı. Ölçek çubuğu = 100 nm.

    Figure 3
    Şekil 3: Elektron test, kesitli exosomes. (A) Exosomes yuvarlak şekil morfolojisi. (B) "boxer" aracını kullanarak EMAN programında eksozom kutulu. (C, D) IMMUNO-altın eksozom heavy metal boyama ile Etiketlenmiş. Siyah oklar, altın parçacıkları (A-D) ölçek gösterir çubuk 100 = nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Bu makalede ayrıntılı eksozom'ın yapısı gözlemleyerek ve onun belirli proteinlerin etiketleme için bir protokol sunar. Negatif boyama eksozom17görüntüleme için en iyi yöntem olarak kabul edilmiştir. Bu geleneksel teknik exosomes Kupası şeklindeki yapı göstermiştir. Ancak, bu fincan şekli bir kurutma işlemi nedeniyle oluşan yapay doku biçimidir. Cryo-TEM sonuçları exosomes sulu çözüm25,26yılında tamamen küresel bir yapısı olduğunu ortaya koymuştur. Cryo-TEM tekniği doğal yapısı incelenmesi için çok güçlü bir yöntemdir ama IMMUNO-altın yöntemi uygulamak zordur. Raso ve iş geleneksel yöntem (bütün mount yöntemi boyama negatif) kurumasını işaret Kupası şeklindeki bir kara delik sonuçlandı. Bu çalışmada, hücre hazırlık (rutin EM; fiksasyon, dehidratasyon, gömme ve kesit) için standart yöntem etkisi kurutma eksozom azaltmak için uygulandı. Rutin plastik katıştırma kullanarak EM önlemek veya azaltmak denatürasyon tarafından neden olduğu eserler (ses ve şekil değişiklikleri). Kimyasal fiksasyonu için oxazolidin (GA) (amino grupları arasında kovalent etkileşimleri) cross-linking için kullanıldı. Genellikle, Osmiyum tetroxide (OsO4) yanı sıra geliştirilmiş kontrast lipidler fiksasyonu için kullanılır.

    Bu çalışmada, negatif boyama bildirdi önceki kağıtları21,27,28,29exosomes tipik Morfoloji onaylamak için yardımcı oldu. Negatif boyama ek olarak, blok kesit de exosomes (Şekil 2) gözlenmesi için iyi bir yöntem var. Buna ek olarak, ya iç yapısını kesitli görüntüleri gösterdi olumsuz lekeli TEM esas olarak eksozom yüzeyine gösterdi. Kesitli Albümdeki (şekil 3), veziküller exosomes30yapısal bir özellik olarak bilinen Lümen yapısı gösterdi. Bu protokol için blok kesit, immün boyama ve TEM görüntüleme kullanılır. Özel olarak, blok kesit sonradan ne zaman adet fotoğraf-ebilmek var olmak farklı büyütme oranlarında gerekli analiz, farklı mikroskobu tekniği ve IMMUNO-altın etiketleme gibi diğer analizler için yararlıdır. Kesit sonra kılavuzdaki bölümleri exosomes sınıflandırılması için immün boyama için kullanılan ızgara kutusunda depolanabilir. Örneğin, exosomes işlevleri çalışmaya izole exosomes bilinen eksozom işaretleri14 algıladı.

    Immunogold etiketleme yöntemi etiketleme veya yüksek arka plan etiketleme de dahil olmak üzere bazı teknik sorunlar vardır. Hiçbir etiketleme yaşıyor, birincil antikor konsantrasyon ve birincil kuluçka kez kontrol önerilir. Söz konusu olduğunda düşük konsantrasyon birincil antikor antikor titrasyonu en iyi duruma getirilmiş immunoreactivity bulmak yararlı olabilir. Ayrıca kuluçka kez 4 ° c gecede artırmak yararlı olabilir. Buna ek olarak, birincil antikor konsantrasyonu çok yüksek veya yüksek sıcaklıkta kuluçka süresi çok uzun, arka plan sinyal artırılacak.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Bu araştırma Bio tarafından desteklenen & tıbbi teknoloji geliştirme programı Ulusal Araştırma Vakfı (NMG) & Kore hükümeti tarafından finanse (MSIP & MOHW) (No. 2016M3A9B6904244). Biz de eksozom arıtma Medicinal Bioconvergence Araştırma Merkezi üyeleri teşekkür ederiz.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Glutaraldehyde EMS 16200
    Sodium cacodylate  EMS 12300
    Osmium tetroxide 1 g crystal EMS 19100 Use only in fume hood
    acetone JUNSEI 1B2031
    Spurr medium TED PELLA 18108
    Ultra-microtome Leica UCT
    Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
    Lead citrate EMS 17900
    Transmission Electron Microscopy Hitachi H7600
    nickel grid EMS G200-Ni
    Copper grid EMS G200-Cu
    glycine SIGMA 022K5404
    Phosphate buffer saline SIGMA P4417
    Bovine serum albumin Aurion 25557
    1st Antibody purification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody BioLegend 329710 Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl BioLegend 401202 Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle sigma G7652
    Transmission Electron Microscopy JEOL JEM2200FS
    Glow discharger JEOL JFC1100E
    Carbon grid EMS 121119
    Paraformaldehyde EMS 19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) EMS FCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh) EMS FCF200-NI

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38, (8), 2581-2591 (1978).
    2. Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212, (4497), 923-924 (1981).
    3. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65, (8), 783-797 (2015).
    4. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
    5. Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140, (19), 6631-6642 (2015).
    6. Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, (16), 2667-2688 (2011).
    7. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. (2017).
    8. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820, (7), 940-948 (2012).
    9. Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
    10. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, (8), 581-593 (2009).
    11. Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78, (9), 838-848 (2010).
    12. Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24, (4), 435-443 (2015).
    13. Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. (2017).
    14. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
    15. Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
    16. Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8, (6), 6135-6142 (2015).
    17. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
    18. Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135, (6), 1603-1613 (2015).
    19. Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87, (1), 146-150 (2011).
    20. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, (4), 1921-1926 (2010).
    21. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200, (4), 373-383 (2013).
    22. Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
    23. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
    24. Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. (2017).
    25. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7, (12), 5157-5166 (2008).
    26. Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189, (2), 744-754 (2012).
    27. Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214, (1), 35-44 (2016).
    28. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523, (7559), 177-182 (2015).
    29. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, (6), 654-659 (2007).
    30. van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283, (2), G251-G255 (2002).
    Numune hazırlama ve transmisyon elektron mikroskobu tarafından Exosomes görüntüleme
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).More

    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter